競合アッセイを使用してGTPアーゼ結合タンパク質の親和性を比較すると、

この手順の全体的な目標は、慎重に制御されたヌクレオチド負荷条件下で、Row Family GT P ACEのタンパク質結合パートナーの相対的な親和性を比較することです。これは、最初に、それぞれが同じタグで標識された推定上の競合結合パートナー、例えば、緑色蛍光タンパク質またはGFPを精製することによって達成されます。2番目のステップは、目的のGTPAを精製することです。

例えば、RAC 1 と適切なヌクレオチドをロードして、目的の GTPA シグナル伝達状態を達成します。次に、ヌクレオチドをロードしたgtpaを、一方の結合競合物質を一定量、他方の結合競合物質の量を増やすことでインキュベートし、滴定結合曲線を樹立します。最後のステップは、固定化GTパーゼに結合したタンパク質をウェスタンブロットで分離し、2つの結合パートナー間で共有されるGFPタグの膜をプローブすることです。

最終的に、ウェスタンブロットを使用して、各GFPタグ付き結合パートナーの同量がGTPアーゼによって捕捉される相対濃度を特定します。この手法が共沈などの既存の方法よりも優れている点は、gtpaのタンパク質結合特性が細胞内の結合ヌクレオチドによって決定されることです。結合したヌクレオチドは不安定であるため、タンパク質結合データの解釈が困難です。

この手順は、テキストプロトコルに詳述されているように、GSTタグ付きG tpaの精製およびgtpa結合タンパク質の発現から開始します。トランスフェクションした細胞のフラスコをリン酸生理食塩水またはPBSにRINし、フラスコを5分間排出します。遊離液を吸引し、次いで500マイクロリットルの溶解緩衝液中の細胞をマイクロフュージチューブに掻き取り、混合細胞を4°Cで30分間反転して溶解する。

溶解洗浄中に、40マイクロリットルのGFPトラップビーズを2ロット、新鮮な溶解緩衝液沈殿物で3回洗浄します。ビーズは2、700倍Gで2分間洗浄します。溶解に続いて、21, 000倍Gで10分間遠心分離することによりライセートを清澄化します。

各競合タンパク質の清澄化されたライセートを、洗浄したGFPトラップビーズに転写します。GFP融合タンパク質を2時間結合させ、摂氏4度で反転させて混合します。ロードしたGFPトラップビーズを溶解バッファーで2回、競合液で2回洗浄します。

結合緩衝液沈殿ビーズを2,700倍Gで洗浄間に2分間沈降させる。0.2モルグリシンの40マイクロリットルを追加し、30秒間ピペッティングしてGFP融合タンパク質を溶出させ、すぐにビーズを21、000倍Gで60秒間沈殿させ、液体を1モルトリスHCLの4マイクロリットルを含む新しいフージチューブに移します精製タンパク質への損傷を制限するためにこのステップを迅速に実行します。精製した各タンパク質の1マイクロリットルをウェスタンブロットで分析し、抗GFP抗体でプローブして、メーカーのプロトコルに従って定量的ブロッティングシステムを使用して相対収量を確立します。

競合結合バッファーを添加することにより、モルタンパク質濃度を均等化します。調製したGSTラック1ビーズの90マイクロリットルを取り、磁性粒子選別機を使用してヌクレオチドローディングバッファーで3回洗浄し、各ステップでビーズを沈殿させます。ビーズから緩衝液を吸引し、G-D-P-G-T-Pまたはヌクレオチドローディングが必要かどうかに応じて、100マイクロリットルのヌクレオチドローディングバッファーを追加します。

競争実験では、100ミリモルGDPの12マイクロリットル、10ミリモルGTPガンマSの12マイクロリットル、またはヌクレオチドなしを60マイクロリットルのGSTラック1ビーズに追加して、ヌクレオチドローディング制御を行います。残りのビーズを3つの10マイクロリットルクォートに分割し、2マイクロリットルの100ミリモルGDP、2マイクロリットルの10ミリモルGTPガンマS、またはヌクレオチドを各チューブに追加します。ビーズミックスを摂氏30度で30分間攪拌しながらインキュベートします。

ヌクレオチド結合ラックを安定化させ、実験用混合物と対照用混合物に1モル塩化マグネシウムを1モル添加して1個ずつ競技結合を行う。マイクロフージチューブを6本設置します。それぞれに200マイクロリットルの競合結合バッファーが含まれています。

各チューブには、ヌクレオチドロードラック10マイクロリットル、ビーズ1個、ラック5マイクロリットルも含まれている必要があります。1つの結合タンパク質Aを定常結合タンパク質として各チューブに添加し、0、1、2、0.55、10、または20マイクロリットルのラック1結合タンパク質Bを可変結合タンパク質として追加する。これらの容量は、一定結合タンパク質と可変結合タンパク質のストック濃度がほぼ等しいと仮定しており、調整が必要な場合があります。

結合混合物の総容量を、競合結合緩衝液を添加することにより235マイクロリットルに構成する。次に、競技用バッファー200マイクロリットルが入ったマイクロフージチューブをセットします。実験ヌクレオチドの10マイクロリットルは、ラック、1つのビーズとラック1結合タンパク質A.Thenの10マイクロリットルをロードし、G-D-P-G-T-PガンマSとテキストプロトコルに記載されているようにヌクレオチド制御チューブを設定しない。

チューブを2時間インキュベートし、インキュベーション後4°Cで反転して混合します。ビーズを競合結合バッファーで3回洗浄します。最後に、結合したタンパク質を20マイクロリットルの還元性サンプルバッファーで溶出します。

精製したGFP RCC 2とGFP CoronaのGFPタグを1つのC.Propellerドメインで定量的にウェスタンブロッティングしたところ、上部バンドのタンパク質であるGFP RCC 2は下部バンドの1.4倍存在量であり、競合実験で1対1のモル比を達成するために希釈する必要があることが明らかになりました。対照実験では、ラック1のヌクレオチド負荷状態が、1つのCプロペラドメイン内の一定量の等モルGFPコロナに対するGFP RCC 2の体積の増加とブロッティングによる結合特異性を決定することを示しています。ラック1に結合するタンパク質は、結合タンパク質の相対的な変化を視覚化し、同じグラフ上に両方の競合製品のGFPバンド強度をプロットし、線が交差する点を特定することで、平衡状態の可変結合タンパク質の量を特定することができます。

ただし、競合他社間の相互作用や過剰な餌のgtpaなどの問題が実験を損なわないように注意する必要があります。ここに示すように、他の競争相手の損失なしに一方の競争相手の増加は、この手順を試みている間に問題を示しています。競合するバインディングパートナーの豊富さの間に相互関係があることを確認することを覚えておくことが重要です。

結果を歪める可能性のある問題や、データを検査することで特定される限り解決できる問題がいくつかあります。