Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Courtney Reeks; Robert A. Screaton

doi:10.3791/53152

JoVE Journal
Biology

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JoVE Journal Biology

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

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11:13 min

August 29, 2015

DOI: 10.3791/53152-v

Courtney Reeks¹, Robert A. Screaton^2,3

¹Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, ²Sunnybrook Research Institute,University of Toronto, ³Department of Biochemistry,University of Toronto

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。

この手順の全体的な目標は、ハイスループットスクリーニング法を使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを同定することです。これは、まず、キナーゼFUをグルタチオンに発現するプラスミドをトランスフェラーゼまたはGSTとして細胞にトランスセクトすることによって達成されます。2番目のステップは、GSTキナーゼプルダウンを実行することです。

次に、サンプルをゲルにロードし、ゲルを走らせてkumasi brilliant blue dyeで染色します。最後のステップは、ゲルを乾燥させ、自動X線撮影フィルムにさらすことです。最終的には、得られたフィルムを現像し、解釈することにより、各レーンが異なるキナーゼアッセイを代表するため、キナーゼ基質ペアを同定することができます。

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