Name: ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶハイスループットスクリーニングによるキナーゼ基質ペアの同定法。GSTキナーゼプルダウンとオートラジオグラフィーを用いて、哺乳類細胞から精製したキナーゼの活性を迅速に解析し、リン酸化シグナル伝達を理解する。

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この作品は、NSERCの助成金によってサポートされていました 386634.私たちは有用な議論のためにScreatonラボのメンバーに感謝したいと思います。

試薬、プレート、および細胞の作製<ol><li> 25mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、50mMのNaFを、0.5mMのEDTA pH8.0の、0.5％トリトンX-100、5mMのβグリセロリン酸、5％グリセロール：500 mlの溶解バッファー行います。 4℃で保存します。使用1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び1mMのバナジン酸ナトリウムを添加する直前。このステップの後、PMSFは、任意のすすぎバッファに必要とされません。 </li><li> 200 mMトリスpH7.5の、50mMのベータ - グリセロホスフェート（FW 216）、2mMのバナジン酸ナトリウム：10倍キナーゼ緩衝液20mlのを行います。 -20℃で1 mlチューブで分注し、店舗。使用直前に、5mMのDTTを追加します。 </li><li> 300μMのアデノシン三リン酸（ATP）、66mMのMgCl 2を、-20℃で33 mMでのMnCl 2.1 mlチューブで小分けして保存：10倍、M-ATPバッファの20ミリリットルを行います。 </li><li> 1.5グラムのトリス塩基、20 mlのグリセロール、30mLのH 2 O：2Xドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶解緩衝液100mlを作ります溶解し、HClでpHを6.8に調整します。 40を追加mlの10％SDS、100ミリリットルにボリュームを調整します。 25 mgのブロモフェノールブルーを追加します。 </li><li>スポット応じて96ウェルプレートとラベルプレートのセットで、ウェルあたりのGST-キナーゼ14をコードする 25 ngの/μlの哺乳動物発現プラスミドの4μlの。使用するまで-20℃でプレートを密封し、凍結。 </li><li>トランスフェクションの2日前に、CO 2（最終5％）を補充した37℃のインキュベーター内で培養HEK293Tの完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）中の細胞及び抗生物質。そしてトリプシンで通過は在庫が拡張中に、&gt; 80％コンフルエントになることはできません。 6×10 7細胞の最小画面（80％コンフルエンスでHEK293T細胞の約3×15cmの皿）に必要とされます。 </li></ol> 2.トランスフェクション注意：プロトコル全体のフローチャートについては、図1を参照してください 。 <ol><li>キナーゼプラスミドを含むプレートは、凍結されている場合は、室温aの解凍NDウェルの底に任意の水分を収集するために、3分間1900×gで遠心します。 </li><li>脂質ベースのトランスフェクション試薬の312.7μlの低血清培地（例えば、OPTI-MEM）の8.6ミリリットルを混ぜます。 5分間座ってみましょう。 </li><li>小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて各ウェルに減少血清培地10μlのを追加します。 </li><li>小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて、ステップ2.2から減少血清培地/トランスフェクション試薬混合物のウェルあたり10μLを追加します。 20〜45分間座ってみましょう。 </li><li>完全DMEM 80mlに7.5×10 5細胞/ mlで再懸濁した293T細胞。よく標準ボリュームカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いあたり100μlの細胞懸濁液（ すなわち 7.5×10 4細胞）を追加します。 </li><li>均一な細胞分布のために顕微鏡下で井戸を確認し、24時間インキュベーターに戻します。 </li></ol> 3. GST-キナーゼプルダウン<ol><li> Fを作りますレッシュ：H 2 Oの540μlの0.2 Mバナジン酸ナトリウムの60μLを混合することにより、4 mMのペルバナデートソリューション第2のチューブミックス30％の過酸化物の2.7マイクロリットルのPBS 1.4ミリリットルで。 2つのソリューションを追加し、使用前に15分間放置します。 </li><li>マルチチャンネルピ ​​ペットを使用して（それもであまりにも多くの乱流を生成するように自動液体ディスペンサーを使用しないでください）ステップ3.1で調製した過バナジン酸の2.5μlのに続いて、各ウェルに0.25 M CaCl 2を2μLを分注します。 37℃で10分間各プレートをインキュベートした後、氷の上に置きます。 </li><li>第1（試薬の調製）に示すようにDTT、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムを添加することによって溶解緩衝液の35ミリリットルを準備します。 </li><li>氷の上でプレートを維持、真空吸引器を使用して、各ウェルから培地を除去します。すぐに標準カセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて氷冷溶解緩衝液50μl/ウェルを追加します。オプション（溶解し、氷上で30分間座ってみましょう：必要に応じてPLATをシールすることによってここに停止することができますE、-80℃で保存します。氷の上で、解凍プレート）を続行します。 </li><li> 4℃で3分間、1,900×gでスピンプレート。 </li><li>各ウェルマルチチャンネルピペットを使用してから細胞をこすり落とし、すべての内容を転送は、適切にV底96ウェルプレートをラベル付けします。 4℃で10分間、1900×gでスピンプレート。 </li><li>スピン中、リンスとして（PMSFなし）の氷冷溶解緩衝液100μl/ウェルでグルタチオン被覆したプレート（各96ウェルプレートに1つずつ）を入力します。氷の上でプレートを保管してください。 </li><li>遠心機からのV底プレートを取り外します。当時の一つは、ペーパータオルの溶解バッファーとブロットを振るために、シンクの上にグルタチオンプレートを反転。底にペレットを乱さないように注意しながら、プレートを傾けると、マルチチャンネルピペットを用いて、グルタチオンプレートにV底プレートから溶解バッファーを転送します。プレートをカバーして結合するための最小2時間、氷上に残します。 </li><li> 2時間結合ステップの終わりに近く、トンを確保し、放射能のワークステーションを準備します彼に必要な安全上の注意事項は、放射性の仕事のための場所です。 30℃のハイブリダイゼーションオーブンを設定します。 </li><li> 1. PMSFこの段階で必要とされていないセクションに示すようにDTTおよびナトリウムバナジン酸を加えることによって、溶解緩衝液200ミリリットルを準備します。 </li><li>溶解バッファーを振る、ペーパータオルにブロットするシンクの上にグルタチオンプレートを反転します。ウェルは（PMSFなし）、100μlの溶解緩衝液で3倍すすいでください。井戸が乾燥座らせてはいけない - 続行する準備ができるまで、すすぎに保管してください。 </li><li> 10倍の株式を希釈し、標準ボリュームのカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて1×KB50μlの1リンスプレート一度節に示すようにDTTを追加することによって、1×キナーゼ緩衝液（KB）の55ミリリットルを準備します。溶液Aの準備ができるまでのウェルで1倍KBを残します： <ol><li> 15.9ミリリットルまで530関心の基板μgの、ミエリン塩基性タンパク質の500μgの（MBP）、10倍の2.65ミリリットルKB、1 M DTTの13.25μL、 および H 2 Oに500を追加することによって、溶液Aを準備します。 </li></ol></LI&gt; <li>一度に1つは、1×KBリンスを除去ペーパータオルにブロットし、すぐに小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて溶液Aの30μlを添加するシンクの上にプレートを反転。氷の上でプレートを保管してください。 </li><li> 2.5ミリリットルの10倍のM-ATP、500μCiのガンマ- 32 PのATP、 および H 2 Oに10ミリリットルを追加することによって、放射能作業領域に溶液Bを準備します。 <ol><li>よく吐出力による混合に役立つリピーターピペットを用いあたり溶液Bの20μLを加えます。覆い、30分間30℃のハイブリダイゼーションオーブンでインキュベート。 </li></ol></li><li> 30分後、氷にバックプレートを転送します。各ウェルマルチチャンネルピペットを使用して2倍のSDS溶解緩衝液50μlを追加します。次のステップにこの時点で進行、または便利になるまで-20℃でアルミホイルや店舗でプレートをシールすることができます。 </li></ol> 4.ランニング、染色、乾燥ゲル注：すべての作業は、エリアdesignaで実行する必要があります放射能のためのテッド。 <ol><li>ハイブリダイゼーションオーブンをオンにして、85℃に設定してください。室温で解凍プレート。一度オーブンオーブンで10分間サンプルを変性するためにインキュベートした温度、転写板に到達しました。 </li><li>ロード一度に複数の井戸を埋めるためにマルチチャンネルピペットを用いて、各反応15μlの26ウェルのプレキャストゲル。ケアは、すべてのヒントは、サンプルを追加する前に十分に対応して整列するように注意しなければなりません。これが組み込まれていないATPが含まれているとして、追跡用色素（青線）は、ゲルの底部から実行させてはいけない150 Vでゲルを実行します。 </li><li>ゲルを解体して、フィルムを露出オーバーになりますようにメスまたはストレートエッジを使用して、取り込まれていないATP（青線）を遮断します。ラベル付き容器にゲルを置き、15分間のクマシー染色でカバーしています。 </li><li>簡単に、クマシー染色を取り除くには、水でゲルを洗浄し、溶液を脱色追加。タンパク質がはっきりと見えるようになるまで、ゲルを脱色。 MBPのためのバンドと基板用バンドべき各サンプルの見えること。 </li><li>ゲルを乾燥させるには： <ol><li>ろ紙の大きなシートをカットし、乾燥機の上に置きます。 </li><li>それは滑らかで、しわがなくなるまで蒸留水にセロファンシートを湿らせて、紙の上に置きます。 </li><li>ゲルのためのノートを作り、セロハンシートの上にゲルを置きます。二セロファンシートを湿らせ、ゲルの上に置きます。 </li><li>素敵な均一な表面のためのすべてのバブルを（プレートシールローラは、この適しています）ロールアウト。 、フラップを閉じ、真空をオンにし、80℃で3時間、ゲルを乾燥させます。 </li></ol></li><li>ゲルが乾燥したら、信号を強化するには、画面を使用してXARフィルムにそれらを公開します。サランラップやビニール袋でカセットをラップし、霜を保つためにテープで密封します。 -80℃で一晩カセットを保管してください。 </li></ol> 5. XARフィルムを開発<ol><li>次の日、冷凍庫からカセットを除去し、室温で解凍してみましょう。フィルムを開発製造業者の指示に従ってフィルムプロセッサを用いて暗室。 注：キナーゼ基質のペアの証拠のためのフィルムを調べます。より長い第2の露光はまた、より弱いリン酸化事象を検出するのに有用であり得ます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

アプローチ14,15を記述する元の出版以来、180 GST-キナーゼの元のライブラリは、ヒトタンパク質キノームの420のメンバー、または〜80％ ​​にまで拡大されました。拡大ライブラリを使用すると、説明したようにプロトコルは、ホスホおよびデジタル信号増強を使用することによって短縮することができた、（必要と認めた場合）フィルムを開発するために4〜5日、その後1-4日かかります。注意しなければならないいくつかの重要なステップは、（プロトコルの概要について、図1を参照してください ）があります。まず、トランスフェクションの時点でバッチ拡張段階、96ウェルプレート中で（マイコプラズマフリー、拡張中にコンフルエントに到達させず、各継代でのトリプシン処理決して）細胞のストックの健康です。トランスフェクションが行われ（ステップ1.5）を取るとき、細胞を均一に播種すると、80％のコンフルエントにする必要があります。 第二に、ボリュームTRANSFを最小にするために、自動化液体ディスペンサを使用するトランスフェクション時に理想的ですERエラー...

タンパク質の翻訳後修飾（PTMを）は、細胞内の通信のために不可欠です。おそらく全てのPTMの検討最高の細胞内局在性、コンフォメーション、安定性、それらの生化学的活性を含むタンパク質の機能の無数を調節するタンパク質キナーゼによって触媒されるリン酸化は、です。標的タンパク質上のリン酸化部位の同定は、トリプシンリンペプチドマッピングにより、またはリン酸化ペプチド1,2-について富化サンプルを使用して、今、標準プロテオミクス技術によって達成することができます。表現プロテオームの四分の三が3リン酸化されることが予想され、100万6までの推計で20万リン酸化部位5を特定しているが、これらの多くは、経路、またはプロテインキナーゼシグナル伝達、全く割り当てられた生物学を持っていません。 リン酸化部位の同定は比較的簡単ですが、比較的大きな挑戦はにあります基板のペア：これらのサイトを対象と同族キナーゼ（複数可）、我々はマッピングキナーゼと呼ぶプロセスが識別されます。いくつかのキナーゼを同定するための方法：基板対は、目的のキナーゼで開始し、その基質を探しまたは対象の基板から始まると修飾キナーゼ実験7-11または計算12を検索しようとするいずれかの記載されています。既知のリン酸化基質のためのキナーゼを同定するために、バイオインフォマティクスは、基板と沈殿複合体を形成するキナーゼをリン酸化残基（コンセンサス部位）に隣接する、ならびに特定のアミノ酸の短い保存配列を含むタンパク質を同定するために使用することができます。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、多くの場合、成功して満たしていません。 私たちは、急速に所定の基板13をリン酸化することができるキナーゼを同定するための体系的な機能的なアプローチを開発しました。スクリーンアッセイは、優れた特定の生成します潜在的な同族のキナーゼのために非常に明確な選択と性、。生物学的シグナル伝達にリン酸化の中心性を考えると、画面は、事実上すべての細胞シグナル伝達経路14-16で発見するのに便利です。画面には、ヒトタンパ​​ク質キナーゼのライブラリーと、大規模なキナーゼアッセイを実施することを含みます。キナーゼは、細菌のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タンパク質でタグ付けされており、組換え酵素があることを意味する、哺乳類細胞抽出物から精製される - 細菌から調製されたものとは異なり、 - 多くの場合に必要な上流のプロテインキナーゼの存在下で生成されます組換え酵素は、インビトロで活性を有すること。セリン、スレオニン、およびチロシンキナーゼ活性は、下流のキナーゼの活性化のために必要としながら実際には、酵母10内に存在する、酵母ゲノムは、500を超える遺伝子17と哺乳類キノームは、するために、かなり複雑になっていることを示す、122プロテインキナーゼをコードしレギュレーションより高次の生物に固有のプロセスをTE。さらに、（例えば、 その他の小分子、増殖因子、ホルモンなど）、細胞生物学およびヒトの疾患に関連した様々な刺激の効果は、適切なコンテキストに14,15モジュレートキナーゼ活性のために使用することができます。

<table><tbody><tr>社内<td>で製造された</td><td></td><td>溶解緩衝液</td><td>プロトコルステップ1.1</td></tr>を参照してください <tr><td>10xキナーゼ緩衝液</td><td>社内で製造</td><td></td>されました <td>プロトコルステップ1.2</td></tr>を参照してください <tr><td>10x M-ATP</td><td>社内</td><td></td>で製造<td>されました プロトコルステップ1.3</td></tr>を参照してください <tr><td>ヒトキナーゼプラスミド</td><td>Orfeome、Invitrogen、Origene</td><td></td><td>GSTタグ付き社内</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>CS003595ック</td><td></td></tr><tr><td>293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&nbsp;U/mlペニシリン、100&nbsp;&#956;g / mlストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清。</td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>還元血清培地</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>脂質ベースのトランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>自動液体ディスペンサー</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>小型カセットアタッチメント</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>標準カセットアタッチメント</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM パーバナジント</td><td>Made in house</td><td></td> プロトコル<td>ステップ3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット (20-200 &#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット (1-10 &#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V底6ウェルプレート</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオンコーティング96ウェルプレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GSTタグ付き基板</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミエリン塩基性タンパク質(MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>リピータピペット (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&nbsp;ml)</td><td>家</td><td></td>で作られる <td>プロトコルのステップ1.4を見なさい</td></tr><tr><td>26井戸のprecast TGXのゲル</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td>の<td>ゲルの必要なパーセントは興味の基質の分子量によって依存する</td></tr><tr><td>Coomassieの汚れ</td><td>家</td><td></td>で作られる<td>0.1% Coomassie R250、10%の酢酸、40%のメタノール</td></tr><tr><td>Coomassieのdestain</td><td>家</td><td></td>で作られる <td>10%の酢酸、20%のメタノール</td></tr><tr><td>ラベル付きゲル容器</td><td>自社</td><td></td>製 <td>空のチップボックスからプラスチック製の蓋を使用し、ゲル1個が入る程度</td></tr>の大きさ <tr><td>Whatmanフィルターペーパー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>セロハンシート (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>ゲルドライヤー</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>ダブルエマルジョンオートラジオグラフィーフィルム</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>フィルムカセット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>インテンシファイイング・スクリーン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>プレートシール ゴムローラー</td><td>シグマ</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

我々は、新規のシグナル伝達経路を解明するために使用することができ、リン酸化基質のための専用のヒトプロテインキナーゼを同定するためのスクリーニングプラットフォームを開発しました。我々のアプローチは、精製GSTタグ付きヒトプロテインキナーゼのライブラリーを使用すると、目的の組換えタンパク質基質を備えています。私たちは、CREB-規制転写コアクチベーター2（CRTC2）のグルコース調節サイトのキナーゼとしてのMAP /微小管親和性調節キナーゼ2（MARK2）を識別するために、β細胞の増殖に必要なタンパク質、ならびにこの技術を使用していますアダプタータンパク質ELMOのリン酸化による細胞の転移の調節因子としてのチロシンキナーゼのAXLファミリー。私たちはこの技術を記述し、それは、細胞が環境刺激に応答する方法の包括的なマップを確立するのを助けることができる方法について説明します。

画面の代表的な結果を図2に示す 。180は、CRTC2キナーゼならびに古典的なキナーゼアッセイ基質ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のアミノ酸268から283に対応するGSTタグ化ペプチド基質を用いてスクリーニングしました。唯一の2つのキナーゼ、MARK2および高度に関連するキナーゼMARK3は、CRTC2ペプチドをリン酸化しました。それは多くのリン酸化残基を含有し、ゲルの底に向かっ、18 kDaので動作するようMBPは、全てのアッセイで内部コントロールとして含まれています。これは特異性の解釈を可能にする：いくつかのキナーゼは、堅牢基板およびMBPをリン酸化します。ここで注目すべきは、このように常にアッセイにおけるバックグラウンドのリン酸化があり、（無キナーゼコントロールすなわち ）GSTのみを含むウェルは、常にいくつかの内因性キナーゼ活性を浄化することです。これは基質のリン酸化が本物であることを排除していませんが、それは 、インビトロでのキナーゼの設定は以下の選択であることを示唆しているん。これは、キナーゼ基質特異性に関する結論を引...

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

この手順の全体的な目的は、ハイスループットスクリーニング法を用いて、目的の基質をリン酸化するキナーゼを同定することです。これは、まず、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合キナーゼを発現するプラスミドを細胞に導入し、次にGSTキナーゼプルダウンを行うことで達成されます。次に、サンプルをゲルにロードし、電気泳動を行った後、クマシーブリリアントブルーで染色します。最終ステップとして、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーフィルムに感光させます。最終的に、得られたフィルムを現像して解析することにより、各レーンが個別のキナーゼアッセイに対応しているため、キナーゼと基質のペアを特定することができます。既知のリン酸化基質に対応するキナーゼを特定する既存の手法には、バイオインフォマティクス的手法を用いて基質内のコンセンサス部位を探索する方法、生化学的手法を用いてキナーゼと基質の複合体を検出する試行錯誤的なアプローチ、あるいは既知の生物学的機能に基づいてコンセンサス基質を探索する方法などがあります。これらのアプローチは時間がかかり、必ずしも成功するとは限りません。本手法では、機能的な結果に基づいてキナーゼと基質のペアを迅速に特定することが可能です。この手法を最初に考案した際、in vitroでの特異性が不十分ではないかという懸念がありました。しかし実際には基質特異性は非常に高く、スクリーニングにおいて特定の基質をリン酸化できるのは同じファミリーのキナーゼのみである場合が多いことが分かりました。これは、各スクリーニングで複数の基質を用いてマルチプレックス化した際に特に顕著であり、本手順の有効性を示しています。私の研究室の技術者であるCourtneyが、テキストプロトコルに記載されている試薬、プレート、および細胞の調製から手順を開始します。キナーゼプラスミドを含むプレートを凍結させていた場合は、室温で解凍し、1900 ×gで3分間遠心分離してウェル底部の水分を集めます。10 µLの低血清培地を含むキナーゼプラスミドの96ウェルプレートの各ウェルに、8.6 mLの低血清培地と312.7 µLの脂質ベースのトランスフェクション試薬を混合した液を加え、5分間静置します。小容量カセットを装着した自動液体分注機を用い、還元血清培地含有トランスフェクション試薬混合液を1ウェルあたり10 µL添加し、プレートを20～45分間静置します。次に、293T細胞を完全Dulbecco修飾イーグル培地（DMEM）で0.75 million cells/mLに再懸濁し、標準容量カセットを装着した自動液体分注機を用いて、細胞懸濁液を1ウェルあたり100 µLずつ添加します。顕微鏡下でウェル内の細胞が均一に分布していることを確認した後、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻し、24時間培養します。GSTキナーゼプルダウン実験を開始します。0.2 Mのバナジン酸ナトリウム60 µLと水540 µLを混合し、4 mMのバナジン酸溶液を作成します。別のチューブに、30%過酸化水素2.7 µLとリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1.4 mLを混合します。これら2つの溶液を合わせ、使用前に15分間静置させます。マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに0.25 molarの塩化カルシウムを2 µL分注し、続いて証明済みの日付溶液を2.5 µL分注します。各プレートを37 °Cで10分間インキュベートした後、氷上に置いて冷却し続けます。各ウェルから培地を除去し、直ちに氷冷したライシスバッファーを1ウェルあたり50 µLずつ真空吸引を用いて加えます。標準カセットを装着した自動液体分注機を使用し、プレートを氷上で30分間静置して溶解させます。4 °Cで1900 ×g、3分間遠心分離した後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルから細胞を回収し、適切にラベル付けされたvbo. 96ウェルプレートに全内容物を移します。プレートを4 °Cで1900 ×g、10分間遠心分離します。遠心分離の間に、グルタチオンコートプレートの各ウェルに氷冷した溶解バッファーを100 µLずつ満たします。洗浄の間、プレートは氷上に保持します。底面プレートの遠心分離後、グルタチオンプレートをシンクの上で逆さまにしてライシスバッファーを振り出し、ペーパータオルで吸い取ります。プレートを傾け、マルチチャンネルピペットを使用して、V底プレートからグルタチオンプレートへライシスバッファーを移します。この際、底面のペレットを乱さないように注意してください。その後、プレートに蓋をし、氷上で最低2時間静置します。2時間の結合ステップの終了近くに結合させるため、放射性物質を取り扱う際の必要な安全上の注意事項を確認した上で、放射能作業ステーションを準備します。ハイブリダイゼーションオーブンを30 °Cに設定します。グルタチオンプレートをシンクの上で逆さまにし、溶解バッファーを振り落としてから、ペーパータオルで吸い取ります。PMSFを含まない溶解バッファー 100 µL を用いて、ウェルを3回洗浄してください。ウェルを乾燥させないようにしてください。次の工程に進むまで、洗浄液に浸したままにしておきます。次に、テキストプロトコルに従って、1X キナーゼバッファー（1X KB）を 55 milliliters 用意します。標準ボリュームカセットを装着した自動分注機を使用して、プレートの各ウェルに 50 microliters の 1X KB を添加します。次に、テキストプロトコルに従い、目的の基質と myelin basic protein または MVP を含む溶液Aを、それぞれ個別に調製します。プレートをシンクの上で反転させて 1XKB 洗浄液を取り除き、ペーパータオルで吸い取った後、すぐに少容量カセットを装着した自動液体分注機を用いて、溶液Aを 30 µL 添加します。プレートは氷上で保持してください。次に、テキストプロトコルに従い、放射能作業エリアで溶液Bを調製し、1ウェルあたり20 µLの溶液Bを分注します。リピーターピペットを使用すると、吐出時の力で混合が促進されます。プレートを30 °Cのハイブリダイゼーションオーブンに入れ、30分間インキュベートします。30分後、プレートを氷上に戻します。次に、マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに 50 µL の 2x 硫酸ナトリウムドデシル（SDS）溶解バッファーを加えます。このセクションのすべての操作は、放射性物質専用の区域で行ってください。ハイブリダイゼーションオーブンを起動し、85 °C に設定します。オーブンが設定温度に達したら、プレートをオーブンに移し、サンプルを変性させるために10分間インキュベートします。次に、26ウェルのプレキャストゲルに、各反応液を15 µLずつロードします。マルチチャンネルピペットを使用して一度に複数のウェルに充填する場合、すべてのチップが対応するウェルに正しく配置されているか十分注意してください。サンプルを添加する前に、ゲルを150 Vで電気泳動させます。未結合のATPが含まれているため、青いラインがゲルの底から流れ出ないようにしてください。その後、ゲルを解体し、フィルムへの露光時にゲルを暗くしてしまう原因となる未結合のATPを除去します。ゲルをラベル付きの容器に入れ、クマシー染色液で15分間染めます。次に、クマシー染色液を除去します。ゲルを水で軽くすすぎ、脱色溶液を加えます。タンパク質がはっきりと視認できるまで、ゲルを脱色します。各サンプルにおいて、MVPのバンドと基質のバンドが視認できるはずです。ゲルを乾燥させるには、大きめのろ紙を切り出し、乾燥機の上に置きます。セロファンシートを蒸留水で濡らし、滑らかでしわがない状態にしてから、ペーパーの上に置きます。ゲルの順序を記録しながら、セロファンシートの上にゲルを配置します。2枚目のセロファンシートを濡らし、ゲルの上に重ねます。気泡をすべて取り除き、表面を均一にします。フラップを閉じ、真空ポンプを起動して、80 °Cで3時間ゲルを乾燥させます。ゲルの乾燥後、スクリーンの増感処理を行い、二重乳剤オートラジオグラフィーフィルムで露光します。カセットをサランラップまたはプラスチック袋で包み、テープで密封して霜を防いでから、-80 °Cで一晩保存します。翌日、カセットをフリーザーから取り出し、室温で解凍させます。提示されているメーカーの指示に従い、暗室でフィルムプロセッサーを用いてフィルムを現像します。以下は、180種類のキナーゼを対象としたスクリーニングの代表的な結果である。Kreb調節転写共役活性化因子2（CRTC2）のアミノ酸268番から283番に対応するGSTタグ付きペプチド基質と、標準的なキナーゼアッセイ基質であるミエリン塩基性タンパク質（MBP）を用いてスクリーニングを行った。その結果、MARK2と、極めて近縁なキナーゼであるMARK3のみがCRTC2ペプチドをリン酸化した。MBPは、多くのリン酸化可能残基を含み、ゲルの下方である18 kilodaltonsで泳動されるため、すべてのアッセイにおいて内部コントロールとして含まれている。これにより、特異性の解釈が可能になります。一部のキナーゼは、基質およびMVPを強力にリン酸化します。ここで注目すべき点は、GSTのみを含むウェルからは、常に何らかの内因性キナーゼ活性が精製されることです。したがって、本アッセイでは常にバックグラウンドのリン酸化が存在します。これにより基質のリン酸化が実際のものではないと断定されるわけではありませんが、in vitroの環境下ではキナーゼの選択性が低下する可能性が示唆されます。キナーゼの基質特異性に関する結論を導き出すには、分子量の異なる複数の基質を含めることが特に有益です。本スクリーニングはin vitroで実施されており、in vivoではさらに複雑な要因が関与するため、候補キナーゼは細胞内で検証される必要があります。例えば、ある候補キナーゼがin vitroで基質をリン酸化する能力を持っていたとしても、その基質と同じ細胞型や同一コンパートメント内の同一サブ細胞内に発現していない可能性があります。これは通常、RNAiを介した候補因子のサイレンシングを用いて行われます。また、基質の非リン酸化可能変異体を用いて二次スクリーニングを行い、特異性を確認することも可能です。

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生物学

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自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

学ぶハイスループットスクリーニングによるキナーゼ基質ペアの同定法。GSTキナーゼプルダウンとオートラジオグラフィーを用いて、哺乳類細胞から精製したキナーゼの活性を迅速に解析し、リン酸化シグナル伝達を理解する。

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

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