ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

この手順の全体的な目的は、ハイスループットスクリーニング法を用いて、目的の基質をリン酸化するキナーゼを同定することです。これは、まず、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合キナーゼを発現するプラスミドを細胞に導入し、次にGSTキナーゼプルダウンを行うことで達成されます。

次に、サンプルをゲルにロードし、電気泳動を行った後、クマシーブリリアントブルーで染色します。最終ステップとして、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーフィルムに感光させます。最終的に、得られたフィルムを現像して解析することにより、各レーンが個別のキナーゼアッセイに対応しているため、キナーゼと基質のペアを特定することができます。

既知のリン酸化基質に対応するキナーゼを特定する既存の手法には、バイオインフォマティクス的手法を用いて基質内のコンセンサス部位を探索する方法、生化学的手法を用いてキナーゼと基質の複合体を検出する試行錯誤的なアプローチ、あるいは既知の生物学的機能に基づいてコンセンサス基質を探索する方法などがあります。これらのアプローチは時間がかかり、必ずしも成功するとは限りません。本手法では、機能的な結果に基づいてキナーゼと基質のペアを迅速に特定することが可能です。

この手法を最初に考案した際、in vitroでの特異性が不十分ではないかという懸念がありました。しかし実際には基質特異性は非常に高く、スクリーニングにおいて特定の基質をリン酸化できるのは同じファミリーのキナーゼのみである場合が多いことが分かりました。これは、各スクリーニングで複数の基質を用いてマルチプレックス化した際に特に顕著であり、本手順の有効性を示しています。私の研究室の技術者であるCourtneyが、テキストプロトコルに記載されている試薬、プレート、および細胞の調製から手順を開始します。

キナーゼプラスミドを含むプレートを凍結させていた場合は、室温で解凍し、1900 ×gで3分間遠心分離してウェル底部の水分を集めます。10 µLの低血清培地を含むキナーゼプラスミドの96ウェルプレートの各ウェルに、8.6 mLの低血清培地と312.7 µLの脂質ベースのトランスフェクション試薬を混合した液を加え、5分間静置します。

小容量カセットを装着した自動液体分注機を用い、還元血清培地含有トランスフェクション試薬混合液を1ウェルあたり10 µL添加し、プレートを20～45分間静置します。次に、293T細胞を完全Dulbecco修飾イーグル培地（DMEM）で0.75 million cells/mLに再懸濁し、標準容量カセットを装着した自動液体分注機を用いて、細胞懸濁液を1ウェルあたり100 µLずつ添加します。顕微鏡下でウェル内の細胞が均一に分布していることを確認した後、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻し、24時間培養します。

GSTキナーゼプルダウン実験を開始します。0.2 Mのバナジン酸ナトリウム60 µLと水540 µLを混合し、4 mMのバナジン酸溶液を作成します。別のチューブに、30%過酸化水素2.7 µLとリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1.4 mLを混合します。これら2つの溶液を合わせ、使用前に15分間静置させます。

マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに0.25 molarの塩化カルシウムを2 µL分注し、続いて証明済みの日付溶液を2.5 µL分注します。各プレートを37 °Cで10分間インキュベートした後、氷上に置いて冷却し続けます。各ウェルから培地を除去し、直ちに氷冷したライシスバッファーを1ウェルあたり50 µLずつ真空吸引を用いて加えます。

標準カセットを装着した自動液体分注機を使用し、プレートを氷上で30分間静置して溶解させます。4 °Cで1900 ×g、3分間遠心分離した後、マルチチャンネルピペットを用いて各ウェルから細胞を回収し、適切にラベル付けされたvbo. 96ウェルプレートに全内容物を移します。プレートを4 °Cで1900 ×g、10分間遠心分離します。遠心分離の間に、グルタチオンコートプレートの各ウェルに氷冷した溶解バッファーを100 µLずつ満たします。

洗浄の間、プレートは氷上に保持します。底面プレートの遠心分離後、グルタチオンプレートをシンクの上で逆さまにしてライシスバッファーを振り出し、ペーパータオルで吸い取ります。プレートを傾け、マルチチャンネルピペットを使用して、V底プレートからグルタチオンプレートへライシスバッファーを移します。この際、底面のペレットを乱さないように注意してください。

その後、プレートに蓋をし、氷上で最低2時間静置します。2時間の結合ステップの終了近くに結合させるため、放射性物質を取り扱う際の必要な安全上の注意事項を確認した上で、放射能作業ステーションを準備します。ハイブリダイゼーションオーブンを30 °Cに設定します。

グルタチオンプレートをシンクの上で逆さまにし、溶解バッファーを振り落としてから、ペーパータオルで吸い取ります。PMSFを含まない溶解バッファー 100 µL を用いて、ウェルを3回洗浄してください。ウェルを乾燥させないようにしてください。

次の工程に進むまで、洗浄液に浸したままにしておきます。次に、テキストプロトコルに従って、1X キナーゼバッファー（1X KB）を 55 milliliters 用意します。標準ボリュームカセットを装着した自動分注機を使用して、プレートの各ウェルに 50 microliters の 1X KB を添加します。

次に、テキストプロトコルに従い、目的の基質と myelin basic protein または MVP を含む溶液Aを、それぞれ個別に調製します。プレートをシンクの上で反転させて 1XKB 洗浄液を取り除き、ペーパータオルで吸い取った後、すぐに少容量カセットを装着した自動液体分注機を用いて、溶液Aを 30 µL 添加します。プレートは氷上で保持してください。

次に、テキストプロトコルに従い、放射能作業エリアで溶液Bを調製し、1ウェルあたり20 µLの溶液Bを分注します。リピーターピペットを使用すると、吐出時の力で混合が促進されます。プレートを30 °Cのハイブリダイゼーションオーブンに入れ、30分間インキュベートします。30分後、プレートを氷上に戻します。

次に、マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルに 50 µL の 2x 硫酸ナトリウムドデシル（SDS）溶解バッファーを加えます。このセクションのすべての操作は、放射性物質専用の区域で行ってください。ハイブリダイゼーションオーブンを起動し、85 °C に設定します。

オーブンが設定温度に達したら、プレートをオーブンに移し、サンプルを変性させるために10分間インキュベートします。次に、26ウェルのプレキャストゲルに、各反応液を15 µLずつロードします。

マルチチャンネルピペットを使用して一度に複数のウェルに充填する場合、すべてのチップが対応するウェルに正しく配置されているか十分注意してください。サンプルを添加する前に、ゲルを150 Vで電気泳動させます。未結合のATPが含まれているため、青いラインがゲルの底から流れ出ないようにしてください。その後、ゲルを解体し、フィルムへの露光時にゲルを暗くしてしまう原因となる未結合のATPを除去します。

ゲルをラベル付きの容器に入れ、クマシー染色液で15分間染めます。次に、クマシー染色液を除去します。ゲルを水で軽くすすぎ、脱色溶液を加えます。

タンパク質がはっきりと視認できるまで、ゲルを脱色します。各サンプルにおいて、MVPのバンドと基質のバンドが視認できるはずです。ゲルを乾燥させるには、大きめのろ紙を切り出し、乾燥機の上に置きます。

セロファンシートを蒸留水で濡らし、滑らかでしわがない状態にしてから、ペーパーの上に置きます。ゲルの順序を記録しながら、セロファンシートの上にゲルを配置します。2枚目のセロファンシートを濡らし、ゲルの上に重ねます。

気泡をすべて取り除き、表面を均一にします。フラップを閉じ、真空ポンプを起動して、80 °Cで3時間ゲルを乾燥させます。ゲルの乾燥後、スクリーンの増感処理を行い、二重乳剤オートラジオグラフィーフィルムで露光します。

カセットをサランラップまたはプラスチック袋で包み、テープで密封して霜を防いでから、-80 °Cで一晩保存します。翌日、カセットをフリーザーから取り出し、室温で解凍させます。提示されているメーカーの指示に従い、暗室でフィルムプロセッサーを用いてフィルムを現像します。

以下は、180種類のキナーゼを対象としたスクリーニングの代表的な結果である。Kreb調節転写共役活性化因子2（CRTC2）のアミノ酸268番から283番に対応するGSTタグ付きペプチド基質と、標準的なキナーゼアッセイ基質であるミエリン塩基性タンパク質（MBP）を用いてスクリーニングを行った。その結果、MARK2と、極めて近縁なキナーゼであるMARK3のみがCRTC2ペプチドをリン酸化した。MBPは、多くのリン酸化可能残基を含み、ゲルの下方である18 kilodaltonsで泳動されるため、すべてのアッセイにおいて内部コントロールとして含まれている。

これにより、特異性の解釈が可能になります。一部のキナーゼは、基質およびMVPを強力にリン酸化します。ここで注目すべき点は、GSTのみを含むウェルからは、常に何らかの内因性キナーゼ活性が精製されることです。

したがって、本アッセイでは常にバックグラウンドのリン酸化が存在します。これにより基質のリン酸化が実際のものではないと断定されるわけではありませんが、in vitroの環境下ではキナーゼの選択性が低下する可能性が示唆されます。キナーゼの基質特異性に関する結論を導き出すには、分子量の異なる複数の基質を含めることが特に有益です。

本スクリーニングはin vitroで実施されており、in vivoではさらに複雑な要因が関与するため、候補キナーゼは細胞内で検証される必要があります。例えば、ある候補キナーゼがin vitroで基質をリン酸化する能力を持っていたとしても、その基質と同じ細胞型や同一コンパートメント内の同一サブ細胞内に発現していない可能性があります。これは通常、RNAiを介した候補因子のサイレンシングを用いて行われます。

また、基質の非リン酸化可能変異体を用いて二次スクリーニングを行い、特異性を確認することも可能です。