Name: マウスモデルを用いた急性電離放射線による皮膚毒性の定量的評価のための光学分光拡散 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学ぶ拡散光学分光法によるマウスモデルを用いた急性放射線誘発性皮膚毒性の定量的評価法。この客観的バイオマーカーは、放射線治療における皮膚反応の予測と管理に有用です。

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この作業は、Abbott CARO(カナダ放射線腫瘍医協会)のUro-Oncologic Radiation AwardsおよびAlan E. Tiffin FoundationからSKLに授与された研究助成金によって支援されました。EKは、フレデリック・バンティング・アンド・チャールズ・ベスト・カナダ大学院奨学金、前立腺がん研究のスカス大学院フェローシップ、ポール・スタリタ大学院生フェローシップの支援を受けました。

以下の方法は、サニーブルック研究所動物実験倫理委員会のガイドラインに従っています。 1.拡散反射分光システム<ol><li>以前に記載されているハンドヘルド、光ファイバープローブとポータブル分光取得システム（Kim ら2010）を用いて拡散反射スペクトルを収集し、簡単に完全1,2については、 図1（及び関連するキャプション）に概説されています。 </li></ol>急性放射線皮膚損傷のマウスモデルの作製<ol><li>そして彼らは、実験を開始する前の週のための動物施設に順応することを可能にする（例えば、無胸腺またはSKH-1として好ましくは毛のない、）注文6週齢のマウス。リザーブ非照射対照群では、少なくとも3匹のマウスと照射群5匹のマウス。 </li><li>ベースラインDOSの測定および照射前に、耳パンチまたは永久的なマーカーメートルを使用して、マウスをラベル尾部にarkings。マウスがヌードでない場合は、フランク皮膚の2cmのパッチで2センチメートルの毛を削除するが、これは皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。 </li></ol> 3.拡散光分光データ集録<ol><li>電子機器への電源供給をオンにします。 </li><li>マウスの皮膚の場合は、ボックスカーフィルタの幅の収集時間を25ミリ秒、信号平均化のための25と1を入力して収集ソフトウェア用の信号パラメータを設定します。これらのパラメータは、ノイズに取得時間と信号との間の合理的なバランスを提供しています。 </li><li>カスタムプログラムされた収集ソフトウェアを使用して、自動的に、2光源-検出器分離距離でのバックグラウンド読み取り、RのBG（LED消灯）と拡散反射率を獲得し、「取得」ボタンをクリックすることにより、RのMEAS（260ミクロン、520ミクロン）。総取得時間は約2秒です。 </li><li>測定を行う前に、室内灯スイッチを押して、すべての室内蛍光灯のスイッチをオフにします。 注：FluorescENTの室内光検出信号（これらの光は、時間的に変化する光強度を生成し、従って、バックグラウンド信号として減算することは困難である）に干渉する。なお、白熱電球は、（ノイズと悪い信号）高いバックグラウンドレベルを回避するために、DOSプローブからある距離に光を保つ使用してもよいです。 </li></ol> 4.動物麻酔およびベースラインDOS測定<ol><li>すべての接続を調べて、液体イソフルランレベルが適切であることを保証することによって麻酔マシンを準備します。 DOSプローブの快適な手の届くところに滅菌し、そっとパッド入りの表面までテープで固定することができる接続チューブおよびノー​​ズコーンで麻酔導入チャンバーを使用します。 </li><li> 30秒間、4％イソフルランで誘導することにより、誘導チャンバ内の時間でのマウスのケージをAnaesthetize。次の2分間、2％のイソフルラン量を下げます。マウスが後肢のつま先をつまんからの応答を観察しないことにより、麻酔されていることを確認します。 </li><li>早く滅菌DOSプロービング領域に1マウスを移動し、その側の上に置き、ノーズ​​コーンにその鼻を固定し、麻酔の流れ（2％イソフルラン）にノーズコーンチューブを開きます。 注：手順は、長い1以上かかる場合 - 2分、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。 </li><li>マウス皮膚測定値を取得する前に、70％エタノールで拭くことによって、プローブを滅菌します。皮膚を殺菌しないでください。 </li><li>地元の血管系の分散を避けるために確認して脇腹肌に優しくプローブを配置します。測定時間のために手でプローブを保持します。 </li><li>ダイ上に5ドット形成に従って、2 cmの（被照射領域）で約2cmの脇腹皮膚領域をプロービングすることによって反射率データを取得します。すべての後続の測定のために一貫性のあるこのプロービングパターン、エリア、プローブ圧力と本体側（左または右）を保管してください。 注：完全なスキャンは約60秒かかります。プローブ圧はリットルを分散させずにスキャンを取得するだけで十分なはずですOCAL血管系。 </li><li>回復ケージにマウスを移動し、DOSプロービングエリアの隣に、マウスを上に移動。すべてのマウスが測定されるまで、4.6 - を繰り返して、4.2を繰り返します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。 </li></ol> 5.動物の照射注：このプロトコルは、照射の使用を必要とし、動物の準備は、照射装置のニーズを満たすように調整される必要があり得ます。照射中、フランク皮膚の小さな領域のみを放射ビームにさらされるべきです。照射は、滅菌施設に配置する必要があり、それらの無菌住宅エリアにマウスを返すとき、適切なケージ滅菌が観察されるはずです。 <ol><li> （ステップ4.1のように - 4.2）麻酔器を準備し、照射のためにそれを準備する前に誘導室で一度に1つずつのマウスをanaesthetize。 </li><li>誘導室、GENからマウスを削除しますTLYフラップを形成し、延伸皮膚の上や下にフランク皮膚や場所テープをつまみます。 </li><li>プレキシガラスのステージ上にマウスを置き、カスタムリードジグで体をカバー（ワーキングデザインが脇腹の皮膚が貫通引かれることを可能にするサイドウィンドウと一緒に、有底の長方形の箱であり、少なくとも1つの端オープン）。ジグの窓から皮膚弁を引き出し、ゆっくりとステージにフラップをテープで固定します。 注：カスタムリードジグマウスを固定化するのに十分に小さいです。全体の照射にわたって固定化マウスを維持する腹腔内注射を介して - （12.5ミリグラム/ kgの10） - カスタム治具が完全にマウスを固定しない場合には、追加のレストレーナーを使用し、および/またはケタミン投与（80を100mg / kg）およびキシラジンを手順。 </li><li>照射への治具やマウスでプレキシガラスのステージを配置します。設定（X線源、電圧、継続時間およびアンペア数から皮膚までの距離）を決定し、所望の用量を送達（ 例えば、160 kVpのx軸から11センチメートル6.3ミリアンペアで2.5分間線源）。 注：火傷やDNAの損傷を避けるために、マシンの使用のガイドラインに従うことにより、X線源と注意を使用してください。 注：胸腺欠損ヌードマウスは、14日の周り湿性落屑を開発35 Gyのに応じて照射を投稿したが、17 Gyを持つ唯一のマイナーな斑状落屑。 </li><li>照射のうち、装置およびマウスを取り、シールドを取り外し、テープを除去して、個々の回復ケージに入れてください。それは麻酔から回復した後、通常の共有ケージにマウスを返します。繰り返しは5.2手順 - すべてのマウスのための5.4、および対照マウスに偽手術を行います。 </li><li>照射後、彼らの定期的な条件で動物を収容します。異常行動は（痛みを意味例えば 、猫背の姿勢を、）開発した場合は、問題を診断するために獣医師に相談してください。痛みの緩和が0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン皮下または獣医師が監督としての投与を含むことができます。重量損失は、通常のBの20％を超える場合ODY質量、独自のケージ内の別々の家にそれを、高栄養食品を提供します。 </li></ol> 6.フォローアップDOS測定<ol><li>監視および定量DOS技術を使用して皮膚反応の強度を測定します。皮膚の変化と前作の目視検査6の周囲（ベースラインと比較して）DOSパラメータの大きな変化が期待できることを示唆している-照射3,4次の12日間。かなりの変化がモデルによっても前または後に行うことができるので、他の測定時点で調査するのに有用であり得ます。 </li><li> DOS機器およびセクション4で説明したように麻酔器とは、DOSの測定値を取得3.Prepareセクションで説明したようにキャリブレーションを設定します。 </li></ol> 7.ポスト取得処理注：以下のセクションのすべてのステップは、高性能ソフトウェア環境で作成されたカスタムプログラムを使用して行われます。標準化された命名修道院各スペクトルの取得ファイルのイオンは、バッチ処理を可能にするために使用されます。すべてのステップは、図2に示されています。 <ol><li>バックグラウンドの読みを含むすべての測定スペクトルからベースライン（ノイズフロア）を引きます。 </li><li>測定スペクトルは、R MEASからステップ3.3で得られたバックグラウンド読み取り、RのBG（LED消灯）を、減算。 注：この資料の残りの部分については、全てのスペクトルがノイズ・フロアと背景であると仮定されている減算およびR corrのと呼ばれます。 </li><li>第1節での文献1,2に記載されているように、絶対反射率、R 絶対にR CORRを変換します。 <ol><li>相対反射率測定値を得る、Rrelは、イントラリピド、20％ファントム（フレゼニウスカービ、スウェーデン）で48％まで、3％のアリコート画分の増加と共にファントム（ すなわち、3％、6％、9％、...、48％）とイントラリピッド濃度に対するRrelのプロットを作成します。 </li><li> ＆R対絶対の絶対的プロットを生成します＃956; s &#39; を反射するための拡散方程式を使用して14。 </li><li>両方の曲線のピークと一致し、Rの腹筋 x軸と一致するようにRrelのx軸を調整します。 </li><li>所与の波長及び光源 - 検出器の分離に使用したY軸スケール： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq2.jpg" /> 注：以下のセクションでは、すべての測定値のフィッティングは、R 腹筋を参照します。 </li></ol></li></ol> 8.スペクトルデータのフィッティング注：以下のセクションでは、マウスの皮膚の機能的パラメータを抽出するために利用理論とフィッティングアルゴリズムの概要を説明します。用いられるすべての理論については、その中に以下の記事14-18及び参考文献を参照してください。すべての式は、一般的に、物理学や工学の研究室で使用される（事前にプログラムモジュールを含む）、ハイエンドの科学的なソフトウェア環境でプログラムされているものとします。 <ol><li> Aプログラムを記述機能bsorptionスペクトルは、式を用いて、関心のスペクトル範囲内の関連する個々の発色団の和として皮膚の（λ）をμ： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq4.jpg" /> STO 2は 0から1までの範囲の単位なしの酸素飽和度であるが、ここで、H bは 、総ヘモグロビン濃度（G / L）です。 </li><li>オキシを取得し、 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq5.jpg" /> 、およびデオキシ、 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq6.jpg" />プラール19のオンラインコレクションから（テキストファイルとして保存されている）、ヘモグロビンスペクトル。 </li><li>プログラムの皮膚の散乱スペクトルを説明する機能、 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq7.jpg" /> 、（センチ-1）= 1 nmのoを λでμ 秒 &#39;の値であり、kは、メディア依存の力率であるべき乗則依存性を、使用して16。 </li><li>順モデル関数に8.3（ すなわち 、R（rは、（λ）、S &#39;（λ、μμ -プログラムのステップからのスペクトルの式を組み込む参照14からの式に基づいて拡散反射率の順モデルのための数学関数8.2 ））= R（R、H、B、STO 2、A、K）。 注：さまざまなモデルが存在するが、定常状態拡散理論方程式は、組織内の光分布の簡単かつ正確な説明を提供します。 </li><li>プログラムの四角は、前方の差は8.4項および測定反射スペクトルから反射スペクトルをモデル化機能。 </li><li> 8.5節での最小二乗差関数が最小になるまで反復してH bの 、STO 2、A、及びkを変更します。 MATLABのlsqcurvefitは、自動的にこのステップを実行するために使用することができます。 </li><li> Repeaすべての測定された反射率データセットのDOSパラメータ（H bの 、STO 2、A、及びk）を得るために、8.6 - tは8.5ステップ。 </li><li> 5正規化されたプローブのスポット測定 - 3の各マウスのセットの平均値を用いて、対応するユニークなベースライン測定値とDOSパラメータの相対的な変化をプロットします。これらのプロットは、MATLABのplotコマンドを使用して作成されます。 </li></ol> 9.ビジュアル放射線皮膚炎スコアリング期間<ol><li> （ -照射後24時間1も変更3を観察することができる）毎に48時間照射後（ダグラスとファウラー評価尺度20を参照） を監視し、定性的な評価尺度を用いた皮膚反応の強さを獲得。二つ盲検研究者らは理想的です。手持ちカメラと基準スケール（ すなわち、定規）で写真を取得したことで評価を支援することができます。 </li><li>注：2日毎照射後の得点肌がfoの最適なDOSの測定時間を決定するのに役立つことがありモデルrを。より頻繁なスコアリングモデルや研究の質問に応じて重要なデータをもたらすことができます。 </li><li>各時点で、各群の中央値をプロットします。特定の時点または各曲線下の中央値は、全体的な領域でグループを比較してください。 </li><li>マウスが所望される皮膚の治癒の点（ 例えば 、4週間）に続いされた後、適切な（承認）法により、マウスを安楽死させます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

定量的光学バイオマーカーを用いた放射線皮膚毒性を評価するためのDOSのアプローチが提示されています。ビジュアル皮膚毒性のスコアリングシステムは、専門家の訓練を必要とし、その後も観察者間の変動と主観になりやすいです。 DOSシステムと解析ソフトウェアを使用するのは簡単です、最小限のトレーニングを必要とし、皮膚における生理学的変化を解釈するための客観的な機能パラメータを返します。また、代わりに単一のパラメータとして皮膚病変の外観を説明するの、DOSはスペクトル形状、光学特性および現在の定性的な採点方法では利用できない感度と特異性の追加度を提供する機能/微細構造のパラメータで豊富な情報を提供しています。セクション1,7は、光バイオマーカーの定量的なフィッティングのために利用することができる絶対的なスペクトルデータを取得するための主要な処理ステップをハイライト。背景とベースライン減算は、ユーザーが実行できるようにするために不可欠です通常の照明条件の下でDOSの測定。セクション8は、X線照射前と後の無胸腺マウスを記述するために必要な必要なモデルと方程式を提供します。ここでは、適切な吸収剤の選択は、測定されたスペクトルの正確な説明のために不可欠です。ユーザーが徹底的に文献に波長範囲と前光学バイオマーカーフィッティングモデルを構築するに与えられた研究で使用し、目的の組織を支配する主要な吸収を調査することをお勧めします。最後に、セクション3-5は、DOSの取得中に無胸腺マウスの取り扱いについて説明します。地元の血管系を破壊しないようにするには、マウスの皮膚表面上のDOSプローブを配置するために穏やかな力を使用しています。 ハイパースペクトルカメラシステム3,4に比べて比較的安価ながら、記載DOSアプローチの明確な制限は、拡散反射率を測定するための点プローブの使用です。皮膚とこの反射ジオメトリ必需穏やかな接触と一貫性のある、プローブ - 皮膚圧力が使用されていない場合、脈管構造を分散させて測定の不確かさを導入する可能性を有します。 DOSプローブの将来の設計は、一貫した結果を維持するために圧力センサを組み込むことができます。近い光源 - 検出器分離（&lt;2〜3ミリメートル）の使用は、皮膚表面に特定の光学プロービング深さを可能にしつつ、さらに、改善された特異性は、2Dハイパースペクトルイメージングに比べて空間分解能の損失に来ます。この制限を最小限に抑えるために、全体的な照射量を捕捉する5点の象限​​のスキャンを使用しました。空間分解能の欠如にもかかわらず、マウス5の前の仕事は、光学バイオマーカーの能力を示した照射と非照射皮膚だけでなく、Vasculotide 6などの介入薬を温存皮膚の影響だけでなく、区別するために疎の領域にわたって平均。 全体のシステム設計は、異なる肌のために変更することができるが、それは、ことに留意すべきです<html>モデルは、基礎となる基礎スペクトルおよび散乱の形状を最適化する必要があるかもしれません。具体的には、オキシおよびデオキシHbはよく無胸腺マウスモデル、最適なフィッティングのためのメラニンの添加を必要とすることがより暗い皮膚に同じモデルのアプリケーションを記述しています。また、&gt; 950 nmの高い波長にDOS帯域幅の拡張は、より高い波長で支配する水の添加を、必要であろう。また、別の皮膚の厚さの動物モデルは、深さ感度を最適化するために、異なる光源 - 検出器の分離を必要とし得ます。最後に、毛のない機能はアルゴリズムが簡単になります。非無毛モデルは、特定の研究課題のために最適であるかもしれないが、それらは結果に影響を与える可能性があり、このプロセスからDOS測定前脱毛、皮膚刺激を必要とします。総免疫機能は、免疫応答性ヘアレスマウス不可欠である研究のために（ 例えば、SKH-1）は、そのeuthymic性質に優れたモデルとしての役割を果たすことができます。 ENT &quot;&gt; DOSプローブ測定のための重要な考慮事項は、一貫性のあるRTと照射領域の推定である。温度変動は、組織ヘモグロビンとSTO 2のレベルに影響を与えることができる。各データ収集時間で3非照射動物の群の測定は、ベースラインとしての役割を果たすことができますパラメータ値の意図しない環境変動を正規化することができる。また、照射領域は、（皮膚弁の準備が一貫していなかった場合）損傷が視覚的に5日目（40 Gyの）周りにマニフェストを開始する前に推定することは困難かもしれない。に黒の油性ペンを使用している場合放射線に曝露された皮膚の境界をドット、読みを損なう可能性インク汚れを防止するために、余分なインクの使用を避けます。 システムの追加機能は、散乱特性からの吸収を分離する能力です。代替ハイパースペクトル撮像システムはまた、オキシヘモグロビン及びヘモグロビン濃度、ハイパースペクトルイメージングiの自由空間の形状を監視する能力を提供するが<html>散乱の変化を解決することができませんね。散乱の大幅な変更が原因で紅斑（赤み）に発生した場合、この制限は返さオキシヘモグロビン、ヘモグロビンとSTO 2パラメータの不正確になることがあります。さらに、DOSを使用して散乱の変化のモニタリングは、紅斑の評価のための追加の光学バイオマーカーを提供することができます。 図6に示すように、ヨハンら （2014）の初期の結果は、Aとは、視覚的スコアリングシステムのような他の代替方法から観察された傾向と相関しない電離放射線以下の時間的傾向を示すkのことを示しています。これは、散乱変化が視覚的にわかりやすい方法で示さないと、実際には独立した生物学的プロセスを説明することができることを示しています。したがって、代替の方法に比べ、DOSは、表面的な散乱の変化のための高分解能、通常のHbベースの測定から分離することができる新たな皮膚損傷のバイオマーカーを調査するための手段を提供します。 jove_content &quot;&gt;我々のモデルは、（むしろ臨床設定で使用されている複数の小さな分画用量よりも）大きな単一の放射線量を使用するが、これは急性ヒト皮膚放射能毒性21の病態生理を模倣する。さらなる最適化で、DOSを提供し得ることが想定されます放射線誘導性の皮膚反応の自動化と標準化されたスコアリングのための定量的アプローチは、この技術を習得した後、将来のアプリケーションは、 例えば、皮膚の放射線防護のための制御および実験的治療の間にオキシヘモグロビンレベルを比較する、または創傷治癒促進のため（皮膚温存治療法との違いを監視含んでいてもよいです）。動物モデルにおける高スループット薬物スクリーニングのための理想的な間、DOS系起因使い勝手の容易さ及び通常の照明条件下で測定する能力を臨床環境に潜在的に適用可能である。この場合、プローブ設計のわずかな変更を必要とするかもしれません考慮して若干大きくオプトード分離と人間の皮膚の厚さが増加。臨床DOSシステムは、痛みを伴う皮膚反応を最小限に抑え、患者の快適性とコンプライアンスを向上させることができ介入療法のオンライン評価を可能にするであろう。将来的には、慢性放射線誘発される皮膚損傷（ 例えば、線維症）の特徴にDOSベースの定量化を拡大することは興味深いかもしれません。

同時に周囲の正常な構造を温存しながら、放射線療法（RT）の計画および配信における技術の改善は今、腫瘍領域に配信される高度にコンフォーマルな治療用量を可能にします。高用量のターゲットが皮膚に近接しているとき、まだ、時には急性および重度の毒性は避けられません。十分な重度の場合は、結果の正常組織の損傷は、負のRT治療結果と生活1,2の患者の品質に影響を与えることができます。 有害な結果にもかかわらず、放射線皮膚紅斑の存在管理が被害につながる基礎となる生物学的メカニズムを無視クリームまたは軟膏を用いて、非特異的なままです。これらのアプローチは、原因ではなく、症状を最小限に抑えることに基づいています。また、インターベンション治療のタイミングおよび投与は、放射線皮膚損傷の評価の定性的および主観的な性質によって複雑になります。いくつかは認識しているが組織（RTOG、EORTC）視覚的等級の推奨事項を提供し、金融機関は、それによってメタ分析の目的のために正常組織の毒性の比較を曖昧に、好適なスコアリングの彼らの選択に変化します。さらに、このようなグレーディングシステムは、放射線障害の重症度の差が毒性低減戦略を評価する研究で視認できてもよいように、原油および観察者間変動を受けやすいです。 むしろ視覚的に照射皮膚に紅斑の程度を説明するよりも、別のアプローチは、定量的に臓器で発生する根本的な生理学的変化を記述するパラメータを測定することです。血中ヘモグロビン（Hb）は、組織の酸素飽和度（STO 2）又は酸素化ヘモグロビン（オキシヘモグロビン）のレベルは、マウス3-6に照射誘導性の紅斑のプロキシとして使用されています。照射後、総Hbレベルが変動を受けるが、オキシヘモグロビンまたはSTO 2は続いて、特徴的な初期の急激な上昇を受け、秋と別のより持続的な上昇3,6。刺激は、皮膚紅斑を誘導するために使用される場合、血管オキシヘモグロビンレベルが直接局所紅斑および炎症7の重症度と相関します。 光学分光法（DOS）びまん生体組織成分の生化学的および微細構造構成要素に関する機能的情報を提供するために、近赤外光を使用します。この定量的、非侵襲的な光学技術は、Hb ​​濃度とSTO 2の機能サロゲートを介し紅斑中に発生する血管のサイトカイン誘導性血管拡張を測定するための方法を提供しています。対照臨床スコアリング方法8-11でDOS測定されたパラメータを比較した最近の研究では、現在の等級に固有の限界を克服するための技術の可能性を示します システム。 ここでは、定量的にDETEための機能サロゲートを採用し、社内、ポータブル、DOSシステムを記述します前臨床マウスモデル5で放射線誘発皮膚毒性の違いをcting。記載プラットフォームは、早期発見と介入薬物反応の微妙な区別のために高感度で標準化された紅斑スコアの手段を提供することができます。また、わずかな改造で、計測器は、最終的に、リアルタイムの臨床モニタリングのために臨床的に使用されてもよいです。

<table><tbody><tr><td>ヌードマウス</td><td>例えば、チャールズリバー</td><td>アティミックヌードCrl:NU(NCr)-Foxn1nu、または免疫適格ヌードCrl:SKH1-Hr小</td><td></td></tr><tr><td>動物照射器&nbsp;</td><td>例えば、Faxitron X-Ray Corp.</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>動物麻酔&nbsp;</td><td></td><td></td><td>誘導室付きのイソフルラン気化器を使用する場合は、チューブとノーズコーンが必要です。</td></tr><tr><td>リードジグとプレキシガラスステージ</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>照射装置が動物の全身を放射線にさらす場合、皮膚のフラップのみを露出させるために鉛シールドを使用する必要があります。</td></tr><tr><td>医療用テープ&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>油性マーカー/イヤーパンチャーMatlab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mathworks Inc.、マサチューセッツ州</td><td></td>ネイティック<td>、StatisticsToolbox&nbsp;</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments, Vaudreuil-Dorian, QB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOS system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical multiplexer</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Model MPM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Model S200</td><td></td></tr><tr><td>White light source</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Model LS-1</td><td></td></tr><tr><td>Intralipid-20%</td><td>Kabi Pharmacia、ニューヨーク、NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反射率標準</td><td>INO、ケベックシティ、QB</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスモデルを用いた急性電離放射線による皮膚毒性の定量的評価のための光学分光拡散

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

電離放射線(IR)による急性皮膚毒性は、外部放射線療法(RT)の治療コースからの一般的な副作用であり、患者の生活の質と長期生存に悪影響を及ぼします。 正常組織毒性に関連する生物学的経路の理解の進歩により、介入薬の開発が可能になりましたが、現在の反応研究は、皮膚反応の重症度を評価するための定量的指標が不足しているため、制限されています。 ここでは、放射線に対する皮膚反応の定量的な光学バイオマーカーを提供する拡散光分光法(DOS)アプローチを紹介します。 DOSシステムの計測設計と、光学パラメータを抽出するための反転アルゴリズムについて説明します。 最後に、臨床的有用性を実証するために、放射線誘発性紅斑の前臨床マウスモデルからの代表的なデータを提示し、その結果を一般的に使用される視覚的スコアリングと比較します。記載されているDOS法は、臨床現場に変換可能な機能的反応を介して、皮膚毒性の客観的で高いスループット評価を提供します。

DOSの反射率の技術は、放射線誘発性皮膚毒性を評価する従来の定性的な方法に客観的な代替手段を提供します。測定された反射率スペクトルの大きさと形状の両方の変化として存在する放射線の毒性用量以下の皮膚外観の視覚的変化。どちらも、基本となる携帯微細構造と生理的組織状態の機能的変化に関連しています。このセクションでは、ヨハンら。2014年5によって以前に発表された研究からの代表的な結果が見直されています。 図3（左）代表スペクトル（薄い青色の線）を示して6日40 Gyの照射後の皮膚紅斑の無胸腺マウスモデルにおいて260μmの源分離で測定しました。前照射（ 図3、右パネル）と比較すると、〜550〜650 nmのスペクトル形状の違いは、リクを観察していますエリー酸化ヘモグロビンの増加による。絶対反射率の小さな上昇は、電力散乱組織の増加に相関していることが分かります。 0.75の視覚的な肌のスコアと相関し、照射後6日目に観察されたスペクトル。 選択波長での照射後の反射率の変化の評価は、完全な反射スペクトルを利用すること、また、ノイズ感度の潜在的な問題を搬送しません。しかし、完全なスペクトルをフィッティングすると、直感的な光学バイオマーカー（H bの 、STO 2）に変換するデータ・セット全体を可能にする。3が提示方程式を用いて測定したデータの得られるフィット（緑の実線）（細い回線にノイズが多い）を示す図第4節で優秀な契約が基本発色団の選択と散乱形状が適切にマウスの皮膚モデルを記述していることを確認し、観察されます。 。図4は、皮膚における相対的な変化を示します。照射したマウスのコホートにおける様々な時点（6、9、12日）のためのSTO 2（N = 8） 図5は、対応する定性的な皮膚反応スコアを示しています。 STO 2の漸進的増加は、事前照射全3日間の値（p &lt;0.05）と比較して統計学的に異なっていることが観察されます。これらの傾向は、ピークは12日目（〜の平均スコアが3）視覚的スコアリングサロゲート（ 図5）としてSTO 2の可能性を実証することを皮膚損傷の重症度を目視で観察増加を反映しています。 統計的に有意な変化が返さ光学バイオマーカーのいずれについても見られなかったことに留意すべきです非照射対照群（n = 3）を測定した12日間（データは示さず）。 A及びKの変化は、（ 図6）経時的にモニターすることができ、これらは、皮膚の散乱特性は、放射線に応答して変化していることを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig1.jpg" /> 1. DOS計装図 。拡散反射率測定ジオメトリーの（A）の回路図（B）の光ファイバープローブ：光プローブは、18 Gの金属針にバンドルされており、離れて260μmの間隔をあけている200μmのコア光ファイバの線形アレイで構成されています。検出用ファイバが光学分光計に接続されている二つのソースファイバは、二つの広帯域発光ダイオードに接続されています。順次ソースの各々をオンにすることで、分光計は、260ミクロンの距離で拡散反射率を収集することができますし、ソースファイバの各々から520ミクロン（C）、ラップトップを含む完全なDOSシステム、添付の光ファイバープローブと光学ボックス：自動データ取得プログラムは、スペクトルの連続収集を駆動するために使用されます。エレクトロニクスは、SMAコネクタを介して光ファイバープローブに接続し、取得ボックス内に収容されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig2.jpg" /> 図2 のスペクトル処理すべてのx軸のスケールはnm単位である：（A）生の相対的なスペクトル、ベースラインは900との間で約読んでいる-千nmおよびバックグラウンド信号にほぼ等しい（B）相対背景読書（C。。。。 ）背景とベースラインが相対秒を減算しました<html> pectra。（D）は絶対に（C）に示した処理されたスペクトルのスケーリング以下のスペクトルを較正し。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig3.jpg" /> 測定間の図3. 非照射の典型的な白色光反射スペクトル（左）と、照射（右）マウスの皮膚は6日、照射を投稿してください。優秀な契約（騒々しい青）とフィット（固体グリーン）は、典型的に観察されました。 - 600nmの絶対反射率と2の1）全体的な増加）550の間のスペクトル形状が明らかに変化：二つの重要な違いは、2つのグループの間で見られました。ヨハンら。2014年5から許可を得て。&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig4.jpg" /> 40 Gyの照射後のマウスの皮膚の酸素分中の 図4. 変更 。両群間のベースライン正規化平均差は、（マウス当たり）日数6（ボックス1）、9（ボックス2）と12（ボックス3のために重要です）。ヨハンら。2014年5から許可を得て。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig5.jpg" /> 図5.平均定性的な皮膚反応スコア（N = 8）40 Gyの照射されたマウスの皮膚を、次の日の関数として示します 。ヨハンら。2014年5から適応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig6.jpg" /> 図6.相対Aの変化や日数6（ボックス1）、9（ボックス2）と12（ボックス3）に40 Gyの照射後のマウスの皮膚のK。（左側）の変化及びk（右側） 6日目（ボックス1の左右両側）に有意な（p &lt;0.026）であることが見出されました。ヨハンら。2014年5から許可を得て。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

私たちは、放射線に対する皮膚の反応の定量的な光学バイオマーカーを提供する拡散光学分光法(DOS)アプローチを提示します。放射線誘発性紅斑の前臨床マウスモデルから代表的なデータを得るために必要なDOS機器設計、光学パラメータ抽出アルゴリズム、および動物取り扱い手順について説明します。

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

この拡散光スペクトロスコピー技術の全体的な目的は、急性放射線誘発性紅斑を記述するための定量的なバイオマーカーを開発することです。この手法は、放射線治療の分野において、重度の放射線皮膚毒性のリスクがある患者を特定するための予測バイオマーカーとして利用できます。したがって、この技術の主な利点は、放射線皮膚毒性を定量化するための客観的かつ体系的な指標を提供できる点にあります。ここでは、拡散光分光法について実演します。マウスの操作は、Loo研究室の研究員であるElinaが行います。電子機器の電源を入れ、システムの起動を待ちます。次に、室内の蛍光灯をすべて消し、測定装置から離れた位置に白熱灯を配置して、作業用の照明を確保します。次に、マウス皮膚からの測定を行うための装置設定を行います。信号パラメータを次のように設定してください。収集時間を25 millisecondsに、信号平均回数を25に、ボックスカーフィルター幅を1に設定します。これらのパラメータは、データ取得時間と信号対雑音比の合理的なバランスを実現します。次に、カスタムプログラムされた取得ソフトウェアを使用して、LEDをオフにした状態でバックグラウンド値を自動的に取得します。その後、2種類の光源-検出器間距離で拡散反射率の測定値を取得します。260 µmで1回、520 µmで2回目の測定を行います。総取得時間は約2秒となります。マウスを麻酔させた後、滅菌済みのDOSプローブ領域に移動させます。個体を横向きに固定し、吻部をノーズコーンに装着して2% isofluraneガスを投与し、麻酔を維持させます。次に、プローブを70% ethanolで滅菌します。ただし、皮膚の滅菌は行わないでください。滅菌したプローブを側腹部の皮膚に軽く当てます。プローブの圧力で局所の血管系が分散してはいけないため、強く押しすぎないようにしてください。プローブを保持したまま、照射予定の2 cm四方の領域で反射データを取得します。サイコロの目のように、5点の配置でデータを収集してください。以降のすべての測定において、このパターンとプローブ圧を一定に保ってください。測定後、マウスを回復用ケージに戻します。マウスの回復を待つ間に、次のマウスで同様の手順を繰り返します。この手順は、使用可能な照射装置に合わせて調整されています。皮膚の狭い範囲に照射する場合は、必要に応じて調整してください。マウスを麻酔した後、側腹部の皮膚を軽くつまみ、伸ばした皮膚をテープで固定してフラップを作成します。次に、マウスをプレキシガラス製ステージの上に置き、カスタマイズした鉛製治具で体を覆います。2方向からアクセス可能で、皮膚を照射するためのウィンドウがある鉛ボックスを使用してください。その後、皮膚のフラップを治具のウィンドウから引き出し、フラップをステージにテープで固定します。マウスがジグで固定されない場合は、麻酔薬を注射してください。その後、ジグとマウスを載せたステージを照射装置に入れます。必要な照射線量を算出してください。例えば、11 cm離れた位置に配置した160 peak kilovoltageのX線源を用い、6.3 milliampsで2.5分間照射すれば、皮膚を十分に照射することができます。その後、算出された線量を投与します。動物への投与後、回復用ケージに戻します。麻酔から回復後、マウスを通常の共同飼育ケージに戻します。マウスへの照射および測定は、上述の方法で行いました。照射前に、皮膚の無胸腺マウスモデルを用いて、光源間隔 260 micron でベースラインスペクトルを測定しました。太い緑色の線は、細い青色の線の数学的なフィッティングを示しています。40 grayの照射から6日後に行われた測定と比較して、550から600 nanometersの間でスペクトル形状に差異が観察されましたが、これはおそらく酸化ヘモグロビンの増加によるものです。また、絶対反射率のわずかな上昇も見られ、これは組織の散乱能の増加と相関している可能性があります。フィッティング後のデータから、照射後の時間経過に伴って追跡可能な定量的光学バイオマーカーが得られます。例えば、組織酸素飽和度の測定値は、照射後に段階的に上昇しました。この定量データは、同様に照射後に段階的に上昇した皮膚毒性の視覚的グレードと相関していました。このビデオを視聴することで、放射線による皮膚毒性の定量的なスコアリングに拡散光スペクトロスコピー（DOS）をどのように活用するかについて、十分に理解できるはずです。習得すれば、適切に行った場合にこの手法は2〜3分で完了させることができます。この手順を行う際は、血管系を分散させないよう、DOSプローブをそっと押し当てることが重要です。この手法は、放射線治療の分野において、正常組織の放射線反応を記述するための生理学的パラメータを関連付ける方法として利用できます。

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