皮膚外科神経切除：皮膚病のマウスモデルにおける神経のための要件をテストする方法
2016年6月26日
この記事には、マウスの皮膚の遺伝的標識、外科的除神経、皮膚生検、およびホールマウントβ-ガラクトシダーゼ染色による標識上皮の可視化のための詳細なプロトコルが含まれています。これらの方法は、正常皮膚と病理学的皮膚のマウスモデルで神経の必要性をテストするために使用できます。
この手順の全体的な目標は、正常な皮膚と病理学的な皮膚に対する神経の影響を調べることです。この方法は、皮膚神経が恒常性や疾患に影響を与えるかどうかなど、正常な皮膚生物学における重要な質問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、同じ動物の無傷の皮膚サンプルと除神経された皮膚サンプルを比較できることです。
この手法を視覚的に示示することは、神経を認識して除去するのが難しく、周囲の組織への損傷を最小限に抑えることが重要であるため、非常に重要です。まず、マウスに麻酔をかけ、つま先をつまんで適切な鎮静面に達したことを確認します。また、マウスが正常な呼吸と心拍を示すことを確認します。
次に、無菌手術エリアの加温パッドに動物を置きます。電動クリッパーを使用して、生検が行われる背側から慎重に毛を取り除きます。次に、ベタダインとアルコールワイプを使用して剃った部分を拭きます。
すべての髪の毛の切り抜きがサイトから取り除かれていることを確認します。次に、黒いマーカーを使用して生検部位の輪郭を描きます。毛包の縦断面を取得するには、生検の長い方の端が背側正中線の前方から後方のパラセティダルに走る必要があります。
メスを使用して、下にある筋膜を損傷することなく全層切除を行います。出血は通常最小限です。生検サンプルには、表皮、真皮、皮下脂肪、および肉球脂肪が含まれている必要があります。
切除した皮膚サンプルを、真皮を下にして乾いたペーパータオルで平らにします。余分なペーパータオルを切り取り、他のサンプルを収集する必要がある場合は、サンプルを冷たいTBSに最大1時間保管します。マウスに戻り、約3mm間隔で60本のナイロン縫合糸を使用して生検部位を縫合します。
次に、マウスが意識を取り戻すまで、回復ケージでマウスを監視します。指定された施設の動物ケアに従って鎮痛薬を使用し、マウスが苦痛を感じているように見える場合は、そのガイドラインに従ってください。手術後7〜10日以内に、縫合糸を抜いてください。
組織学またはホールマウント染色のための生検の処理に進みます。動物に麻酔をかけ、背側の皮膚全体を剃り、生検手順と同様にその領域をきれいにします。次に、首の付け根から尾の約半センチメートル上まで背側正中線に沿って滅菌メスを使用して切開を行います。
滅菌鈍い鉗子を使用して、左側の皮膚を脇腹から離してゆっくりと引っ込め、首の近くの肩甲骨脂肪パッドから後肢のすぐ上まで下にある組織を視覚化します。次に、解剖光学顕微鏡で背側皮膚神経を特定します。これらは、胴体壁の半透明の筋膜を尾側に移動する白いストランドとして現れ、その後、鋭く曲がり、皮膚の下の緩い結合組織に入ります。
次に、超極細鉗子を使用して、解剖学的部位T3からT12に位置する動物の左側から神経を切除し、体幹壁でセグメントが曲がるところから皮膚への侵入部位まで神経を摘み取ります。鉗子を垂直に向け、曲げ部位から約半センチメートル下の神経をつかみます。つかんだら、上に引っ張って神経を伸ばし、周囲の組織から分離して神経を取り除きます。
隣接する血管を傷つけないようにしてください。0.9%の生理食塩水を定期的に滴下することにより、手順全体を通して組織を湿らせておくようにしてください。.体幹壁から皮膚に伸びるすべての神経を引き続き取り除きますが、体幹壁の密集した筋膜内の神経を乱さないでください。
次に、露出した皮膚フラップから神経を取り除きます。これらの繊維は、背側皮膚神経の遠位枝を構成し、皮膚フラップの真皮側の結合組織内に散発的に位置する白い分岐鎖として現れます。これらの細い枝を取り除くには、鉗子を真皮表面とほぼ平行に配置し、神経をつかんで上向きに摘み取ります。
この方法で、目に見えるすべての神経を取り除きます。血管や皮膚に穴を開けないでください。このステップでは、隣接する血管が破裂しないようにすることが重要です。
血管が隣接している神経を見つけた場合は、最終的には隣接する血管がない領域まで神経をたどり、摘み取って取り除きます。次に、背側正中線切開の右側にある皮膚を緩めますが、神経は取り除かないでください。これは、対側の偽の手術制御として機能します。
最後に、動物を縫合し、以前と同様に術後にモニターします。その後、手術の数週間後に神経の安定した喪失を確認するために、滅菌済みの皮下注射針を使用して除神経領域を優しく刺します。動物が反応するかどうか、通常は身震いしたり、頭を回したりするかどうかに注意してください。
皮膚領域が安定して除神経されている場合、動物はほとんどまたはまったく反応を示しません。反応のない領域と反対側の偽側から皮膚生検を採取し、実験サンプルと対照サンプルを一致させます。生検から、複数の組織切片をサンプリングして、偽標本と除神経標本の間のタッチドームの存在量または形態の潜在的な違いを特定することが重要です。
グリーブワンクリーERT2マウス系統は、タッチドーム上皮などの高いヘッジホッグ経路活性を示す皮膚の領域に、タモキシフェン誘導遺伝子組換えの標的化を可能にします。これらのマウスを交配して、アボラクシレポーターマウスにタッチドーム上皮を視覚化するように誘導しました。ノードは、通常のタッチドームとそれに関連するメルケル細胞の両方を維持するために重要です。
これは、通常のタッチドームの形態が徐々に失われ、除神経後にケラチン8つの沈着細胞が失われることによって実験的に実証されています。神経は、グリーブ1クリーERE2表現、および偽の皮膚と除神経された皮膚の両方からの家庭用ベータ集団の側面染色によって監視されるように、タッチドームでハリネズミの信号伝達を促進するためにも重要です。このビデオを見た後、背側皮膚神経が正常な皮膚機能に関与しているかどうか、または病気を調節するかどうかをテストするために、これらの神経を外科的に切除する方法をよく理解しているはずです。
一度習得すれば、この技術は動物へのストレスを最小限に抑えながら、日常的かつ確実に行うことができます。この手順の後、アミノ蛍光染色などの方法を使用して、神経が皮膚から完全に切除されているかどうか、および遺伝子発現が影響を受けているかどうかを確認することができます。
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概要
この記事では、マウスの皮膚の遺伝子ラベリング、外科的神経切断、および皮膚生検のプロトコルと、全マウントβ-ガラクトシダーゼ染色によるラベル付けされた上皮の視覚化方法を紹介します。これらの技術は、正常および病理学的な皮膚状態における神経の役割を調査するために不可欠です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 皮膚科学
- 病理学
背景
- 皮膚生物学における神経の影響を理解することが重要です。
- 皮膚神経は皮膚の恒常性と疾患において役割を果たす可能性があります。
- 完全および神経切断された皮膚の比較分析は洞察を提供できます。
- 神経を認識することが難しいため、視覚的技術が必要です。
研究の目的
- 正常な皮膚生物学における神経の役割を調査すること。
- 病理学的な皮膚状態における神経の影響を評価すること。
- 神経の識別と除去のための信頼性の高い方法を開発すること。
使用された方法
- マウス皮膚の遺伝子ラベリング。
- 外科的神経切断技術。
- 皮膚生検手順。
- 視覚化のための全マウントβ-ガラクトシダーゼ染色。
主要な結果
- 皮膚サンプルにおける神経識別の方法を示しました。
- 神経切断および完全な皮膚を比較するためのプロトコルを提供しました。
- 皮膚の健康における神経の存在の重要性を強調しました。
- 神経と皮膚の相互作用に関するさらなる研究を促進しました。
結論
- 神経は皮膚の生物学と病理学に大きな影響を与えます。
- 開発された技術は神経機能の理解を深めることができます。
- 将来の研究では、これらの方法に基づいてより深い洞察を得ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables direct comparison of innervated and denervated skin from the same animal, providing a controlled approach to assess nerve-dependent mechanisms in skin homeostasis and disease. By isolating the variable of nerve presence, it supports mechanistic de-risking in target validation for dermatological pathways. The technique is applicable to mouse models of skin pathology, offering translational relevance for preclinical evaluation of neurocutaneous interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding nerve-skin signaling in cutaneous mechanosensory organs like touch domes.
- Operational Value: Enables functional validation of neuronal targets by comparing denervated and sham controls within identical genetic backgrounds.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether neuronal targets drive pathology or homeostasis in skin disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems with quantifiable outputs such as touch dome morphology and gene expression for compound screening.
- Reproducibility: Generates matched experimental and control samples from the same animal, reducing inter-subject variability in assay results.
- Scalability: Allows repeated sampling over time to monitor disease progression, supporting longitudinal assay design.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Adaptable to mouse models of skin pathology including atopic dermatitis, psoriasis, and cancer to test nerve dependence.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by maintaining consistent nerve manipulation across study phases.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by determining whether observed phenotypes require intact innervation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neuroimmune or neuroepithelial pathways in skin.
- Discovery Biology: Tests whether cutaneous nerves are required for touch dome maintenance or gene expression, supporting pathway de-risking.
- Screening: Produces denervated and intact skin samples suitable for standardized whole-mount staining and imaging-based readouts.
- Analytics: Enables quantitative comparison of structural and molecular endpoints between conditions to assess biological significance.
- Translational Research: Applies nerve ablation to disease models to evaluate continuity of nerve-dependent mechanisms from discovery to preclinical stages.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nerve manipulation platform applicable across multiple skin disease models and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating nerve contribution to skin phenotypes.
- Operational Value: Standardizes nerve removal and control procedures, improving reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target engagement in a pathophysiologically relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurocutaneous targets based on functional requirement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and nerve identification under dissection microscopy.
- Dependent on sterile surgical infrastructure and postoperative animal care protocols.
- Necessitates standardization of denervation extent and validation methods (e.g., sensory testing) across users.
- Must account for variability in nerve regeneration or compensatory innervation when interpreting longitudinal data.
- Limited to accessible dorsal skin regions; adaptation to other sites may require modified surgical approaches.
