微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

この手順の全体的な目標は、回転する壁容器バイオリアクターによって提供される微小重力下で培養されたヒト腸粘膜の多細胞 3D 器官型モデルの開発を説明することです。この方法は、健康と疾患の両方における発見のツールとして幅広い可能性を秘めています。病原体との相互作用、抗原輸送、炎症過程などが含まれます。

この技術の主な利点は、ネコの表現型の多様性を模倣することと、栄養素と酸素の効率的な拡散を可能にするD-12血管バイオリアクターの使用です。まず、培養容器の充填ポートからキャップを緩め、PMIの50ミリリットルを追加します。容器がいっぱいになったら、キャップを元に戻し、こぼれた媒体を70%エタノールで拭きます。

容器を室温で少なくとも15分間から一晩インキュベートします。続行する準備ができたら、充填ポートを使用して培地を廃棄し、30ミリリットルの3D培地を容器に加えます。充填ポートのキャップを元に戻し、こぼれた媒体を70%エタノールで拭き取ります。

インキュベーターからヒト臍帯静脈内皮細胞とヒト結腸線維芽細胞を含むコンフルエントフラスコの近くを取り出し、PBSで2回洗浄します。次に、0.05%トリプシンEDTAを含む0.25%トリプシン溶液を使用して細胞を覆うことにより、細胞を剥離します。細胞が剥離したら、30%FBSを含む30ミリリットルのDMEMを予め充填した50ミリリットルのチューブに細胞を回収します。

チューブを10分間遠心分離して、細胞をペレット化します。次に、30%FBSを含む30ミリリットルのDMEMに細胞を再懸濁します。次に、再懸濁した細胞の20マイクロリットルを20マイクロリットルのトリパンブルー色素で希釈します。

血球計算盤に細胞混合物をロードし、生存細胞の濃度をカウントします。次に、FBSを30%含有するDMEMで、各細胞タイプを1ミリリットルあたり5000万〜8000万細胞で再懸濁します。まず、適切な数の培養インサートを6ウェルプレートのウェルに入れます。

次に、まず10x DMEM、10x Reconstitution Media、200ミリモルのL-グルタミン、および熱不活化FBSを50ミリリットルのコニカルチューブに添加して、コラーゲン混合物を調製します。次に、ウシコラーゲン1型、ラミニン、4型コラーゲン、フィブロネクチン、ヘパリン硫酸プロテオグリカンを加え、最後に水酸化ナトリウムを加えて溶液のpHを中和します。混合物が黄色がかった酸性の外観を発症した場合は、滅菌1の正常水酸化ナトリウムを数滴加えて混合物を中和します。

チューブを閉じ、気泡の形成を避けながら溶液を数回反転させて混合します。混合しないときは、溶液が重合しないように氷の上に置いてください。混合したら、細胞懸濁液をコラーゲン製剤に加え、気泡の形成を避けるためにチューブを数回穏やかに反転させてチューブを混合します。

次に、それらを氷の上に戻します。コラーゲン溶液を含む細胞を各インサートに4〜5ミリリットル加え、コラーゲンがフード内でゲル化し、1時間ほとんどまたはまったく動かないようにします。1時間後、6ウェルプレートをインキュベーターに移し、さらに1〜2時間待ちます。

次に、プレートを組織培養フードに戻し、滅菌鉗子とメスを使用して、インサートからメンブレンを無菌的に切断します。ゲルを含む細胞をメンブレンから剥がし、次に剥がしたゲルを小さな正方形に切ります。コラーゲンの正方形を含む小さなセルを、充填ポートを使用して、事前に充填された50ミリリットルの容器の1つに加えます。

次に、添付のテキストプロトコルに記載されているように、HCT-8ヒト上皮細胞の懸濁液を調製します。細胞を1ミリリットルあたり1,000万個の細胞の濃度で、30%FBSを含むDMEMに再懸濁します。次に、充填ポートを使用して、HCT-8細胞懸濁液1ミリリットルを50ミリリットル容器に加えます。

細胞を追加した後、さらに20ミリリットルの3D培養培地を容器に追加して、容器がほぼいっぱいになるようにします。キャップを元に戻し、充填ポートのリップを70%エタノールで濡らします。次に、3〜4ミリリットルの3D培養培地を含む5ミリリットルのシリンジを容器の一方のポートに入れ、空の5ミリリットルのシリンジをもう一方のポートに置きます。

空のシリンジに引っ張って目に見える気泡を取り除き、ほぼ同じ量の媒体がもう一方のシリンジから容器に注入されます。すべての空気を取り除いたら、容器をバイオリアクターに入れ、電源を入れて、速度を毎分13〜14回転に設定します。細胞が血管壁に接触しないように、必要に応じて速度を調整します。

微小重力下で細胞を培養し、3〜4日ごとに培地を交換します。培地を交換するには、デュアルシリンジ法を使用して、使用済みの培地の約30ミリリットルを新鮮な3D培地と交換します。培養で3〜5日後、添付のテキストプロトコルに記載されている末梢血単核細胞を単離します。

次に、バイオリアクターから血管を取り出し、リンパ球と単球からなる約2,000万個の細胞を充填ポートを介して血管に追加します。容器をバイオリアクターに戻し、さらに4〜6日間培養します。培養の9日目頃に、リンパ球と単球からなる2,000万個の細胞を追加で容器に追加し、さらに最大12日間培養を続けます。

実験の最後に、トランスファーピペットを使用して、現在はコンストラクトと呼ばれる各小さなゲルフラグメントを回収し、10ミリリットルの10%ホルマリンバッファーを含む6ウェルプレートのウェルに入れます。コンストラクトを室温で3時間固定した後、標準的な組織学的包埋、切片化、染色のプロトコルに進みます。このビデオで紹介されている方法は、ヒト腸粘膜の多細胞3D器官型モデルを作成します。

微小重力培養では、細胞は20日目までによく分化し、規則正しい絨毛のような特徴を形成します。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6時間で習得できます。この手順を試行する際には、適切な細胞培養ガイドラインを遵守することを忘れないでください。

生存率、マイコプラズマ汚染、および細胞増殖挙動の変化について細胞を系統的に制御することが重要です。この手順に続いて、免疫組織化学などの他の方法を実行して、系統および細胞分化のマーカーを同定することができます。このビデオを見れば、微小重力下で培養されたヒト腸粘膜の多細胞3D器官型モデルの開発方法について十分に理解できるはずです。