微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

本手順の全体的な目的は、回転壁型BVS（Rotating Wall Vessel）バイオリアクターによって提供される微小重力下で培養された、ヒト腸粘膜の多細胞3D器官型モデルの開発について記述することである。この手法は、病原体との相互作用、抗原輸送、および炎症プロセスを含め、健康および疾患の両面における発見のためのツールとして幅広い可能性を有している。

この手法の主な利点は、猫の表現型の多様性を模倣できること、および栄養素と酸素の効率的な拡散を可能にするD-12 vesselバイオリアクターを使用することです。まず、培養容器の充填ポートからキャップを外し、50 millilitersのPMIを加えます。容器がいっぱいになったら、キャップを戻し、こぼれた培地を70%ethanolで拭き取ってください。

容器を室温で少なくとも15分間から一晩インキュベートします。次の工程に進む準備ができたら、注入ポートを使用して培養液を廃棄し、30 millilitersの3-D培養液を容器に加えます。注入ポートのキャップを閉め、こぼれた培養液を再度70%ethanolで拭き取ります。

ほぼコンフルエントになったヒト臍帯静脈内皮細胞およびヒト結腸線維芽細胞を含むフラスコをインキュベーターから取り出し、PBSで2回洗浄します。次に、0.05%trypsin EDTAを含む0.25%trypsin溶液を加えて細胞を被せ、細胞を剥離させます。細胞が剥離したら、30%FBSを含むDMEM 30 mLをあらかじめ入れておいた50 mLチューブに回収します。

チューブを10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。その後、30% FBSを含む30 millilitersのDMEMで細胞を再懸濁します。次に、再懸濁した細胞20 microlitersを、20 micro-litersのトリパンブルー染料で希釈します。

ヘモサイトメーターに細胞混合液をロードし、生存細胞の濃度をカウントします。次に、30%FBSを含むDMEMを用いて、各細胞タイプを1mLあたり5,000万〜8,000万個の濃度で再懸濁します。まず、6ウェルプレートのウェルに適切な数の培養インサートを配置します。

次に、まず50 mLコニカルチューブに10x DMEM、10x Reconstitution Media、200 millimolar L-glutamine、および熱不活化FBSを加え、コラーゲン混合液を調製します。続いて、牛コラーゲンタイプ1、ラミニン、コラーゲンタイプ4、フィブロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを加え、最後に水酸化ナトリウムを加えて溶液のpHを中和します。調製過程で混合液が黄色味を帯びた酸性外観になった場合は、滅菌済みの1 normal 水酸化ナトリウムを数滴加え、混合液を中和してください。

チューブを閉じ、気泡の混入を避けながら数回反転させて溶液を混合します。混合していない間は、重合を防ぐために溶液を氷上で保持してください。混合後、細胞懸濁液をコラーゲン調製液に加え、チューブをゆっくりと数回反転させて、気泡が入らないように混合します。

その後、それらを氷上に置きます。コラーゲンを含む細胞懸濁液を各インサートに4〜5 mL加え、フード内でほとんどまたは全く動かさない状態で1時間放置し、コラーゲンをゲル化させます。1時間後、6ウェルプレートをインキュベーターに移し、さらに1〜2時間静置します。

次に、プレートを組織培養フードに戻し、滅菌鉗子とメスを用いて、インサートからメンブレンを無菌的に切り離します。細胞を含むゲルをメンブレンから剥離させ、剥離したゲルを小さな正方形に切り分けます。充填口を使用して、細胞を含む小さなコラーゲン正方形を、あらかじめ準備した50 milliliter容器のいずれかに入れます。

次に、付属のテキストプロトコルに従って、HCT-8ヒト上皮細胞の懸濁液を調製します。30%FBSを含むDMEMを用いて、細胞濃度を10 million cells/mLとなるように再懸濁します。その後、50 mL容器の充填ポートからHCT-8細胞懸濁液を1 mL加えます。

細胞を添加した後、容器がほぼ満たされるまで、3-D培養液をさらに20 milliliters加えます。キャップを閉め、充填口の縁を70%ethanolで湿らせます。次に、3～4 millilitersの3-D培養液が入った5 milliliterシリンジを容器の一方のポートに挿入し、もう一方のポートに空の5 milliliterシリンジを挿入します。

もう一方のシリンジからほぼ同量の培地を容器内に注入しながら、空のシリンジへ引き込み、目に見える気泡をすべて除去します。すべての空気が除去されたら、容器をバイオリアクターに設置し、電源を入れて回転速度を13〜14 rpmに設定します。細胞が容器壁に接触しないよう、必要に応じて速度を調整してください。

細胞を微小重力下で培養し、3〜4日ごとに培養液を交換します。培地を交換する際は、デュアルシリンジ法を用いて、使用済みの培地約30 millilitersを新鮮な3-D培養液に置換します。培養開始から3〜5日後、付随するテキストプロトコルに従って末梢血単核細胞を単離します。

次に、容器をバイオリアクターから取り出し、充填ポートを通じてリンパ球と単球からなる約20 million個の細胞を容器に加えます。容器をバイオリアクターに戻し、さらに4～6日間培養します。培養9日目あたりに、リンパ球と単球からなるさらに20 million個の細胞を容器に加え、最大12日間さらに培養を継続します。

実験の最後に、トランスファーピペットを用いて、コンストラクトと呼ばれる各小型ゲル断片を回収し、10 mLの10%ホルマリン緩衝液が入った6ウェルプレートのウェルに入れます。室温で3時間コンストラクトを固定し、その後、標準的な組織学的包埋、切片作成、および染色プロトコルに従って処理します。本ビデオで提示した手法により、ヒト腸粘膜の多細胞3D器官型モデルが作製されます。

微小重力培養において、細胞は分化が進み、20日目までに秩序ある絨毛様の構造を形成します。この手法を習得すれば、適切に実施することで6時間で完了させることが可能です。本手順を行う際は、良好な細胞培養ガイドラインを遵守することが重要です。

細胞の生存率、マイコプラズマ汚染、および細胞増殖挙動の変化を系統的に管理することが不可欠です。本手順の後、免疫組織化学などの他の手法を用いて、系統マーカーや細胞分化の特定を行うことができます。このビデオを視聴することで、微小重力下で培養されたヒト腸粘膜の多細胞3D器官模倣モデルを構築する方法について、十分な理解を得ることができます。