Name: 乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ乳癌の肝転移研究法。マウス門脈注射モデルを用いて免疫能保有宿主における転移カスケードの後期段階を詳細に解析し、腫瘍細胞の動態と微小環境との相互作用を明らかにする。

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著者は、ビデオプロトコルの撮影中に外科的処置を支援してくれたAlexandra Quackenbush氏、組織学的サポートを提供してくれたHadley Holden氏、方法開発中の腫瘍と肝臓の病理に関する意見を提供してくれたSonali Jindal氏、そして原稿の批判的なレビューを提供してくれたBreanna Caruso氏に感謝したいと思います。D2A1およびD2.OR乳腺腫瘍細胞はAnn Chambers博士から、D2A1-GFP腫瘍細胞はJeffrey Green博士から、4T1腫瘍細胞はHeide Ford博士から贈られました。イメージングには、Jungers CenterのOHSU Advanced Light Microscopy Coreが利用されました。この原稿に含まれる作業には、NIH/NCI NRSA F31CA186524(ETGへ)およびNIH/NCI 5R01CA169175(PSへ)からの資金提供が含まれています。

この記事のすべての動物の手順を見直し、オレゴン健康科学大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 手術領域と楽器の作製<ol><li> 30分間124℃でオートクレーブではさみ、ピンセット、および止血剤を準備し、1 - 計画された手術の2日前。手術後の回復のためのオートクレーブ滅菌または滅菌寝具、ケージ、および食料へのアクセスを確認してください。 </li><li>好ましくは、層流フードで、無菌手術領域を準備します。 <ol><li> 10％の加熱パッド、光源、麻酔チューブとノーズコーンを含む漂白剤、及びそれが実行されている間に外科手術に近接なり手術室の他の部分と手術領域の全ての表面を拭います。 </li><li>無菌手術領域では、滅菌ドレープ、光源、麻酔チューブおよびノー​​ズコーン、インスリン注射器で洗浄、加熱パッドを配置1cm 2の小片、はさみ、鉗子、止血剤、4-0ビクリル縫合糸- 0.5にカットし、1ミリリットル注射器、ブピバカイン、人工涙液、滅菌生理食塩水、2×2」、滅菌ガーゼスポンジ、4×4 &quot;滅菌ガーゼ、止血ガーゼオートクレーブ処理容器内のテーパー針、および50ミリリットルの2％グルコン酸クロルヘキシジンと。 </li><li>氷の上に保存されている準備された腫瘍細胞のために、このスペースに余裕があることを確認してください。 </li><li>手術領域に隣接したベンチに、第二の加​​熱パッドと滅菌寝具付きの清潔なケージでリカバリ領域を準備します。 注：このエリアには、例えばビーズ滅菌器などの項目を収容することができます。 </li></ol></li></ol> 2.ポータル静脈注射<ol><li>疼痛管理のために皮下0.015 mg / mlでブプレノルフィン、100μlのと15週、 - 計画された注射への一時間前、8高齢者のBalb / c雌マウスを扱います。 注：この注入プロトコルは、適切なを使用して、任意の年齢で女性または男性マウスの任意の株にも適用することができます株への変更のための細胞株。 </li><li>選択した細胞株または腫瘍外植片のためのプロトコルに基づいて、注射のための腫瘍細胞を準備します。動物コロニーに、そのような病原体を導入するリスクを低減するために、マウスの病原体の存在のために、投与前に、すべての腫瘍細胞株をテストします。 <ol><li> 3日間注射前に10cmの組織培養プレートにD2A1、D2.OR、および4T1腫瘍細胞、解凍細胞を含む同系のBalb / cの腫瘍細胞株のためのそのような翌日、細胞は約90であることを - 100％コンフルエント。 </li><li> 1日1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回、腫瘍細胞融解洗浄細胞を次の5分間、37℃で、0.05％トリプシンを2mlを用いて、コンフルエント腫瘍細胞をトリプシン処理。完全培地10mlの新鮮な10cmディッシュに8の完全培地ミリリットル（DMEM高グルコース、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン）および通路1:10加えます。 </li><li>注射の日に、1×PBSおよびトンで細胞を1回洗浄上記のようにrypsinize。 </li><li>再懸濁し、5mlの1×PBS中にメディアを再懸濁を削除し、1500×gで5分間スピン、完全培地8mlに細胞をトリプシン処理しました。 </li><li>生存能力評価のためのトリパンブルー排除を使用して、血球計数器上の細胞を数えます。事前に決定された濃度と体積で1×PBSでの注射のために細胞を再懸濁します。 注：5 - 小さい注入量は、肝臓への不要な損傷を防ぐように10μlを推奨します。 </li><li>注射の期間中、氷上で細胞を保管してください。注射の完了後、生存能力を確保するために、1日の完全培地中で培養中の研究室への細胞のサンプルを返して置きます。 </li></ol></li><li>酸素で配信2.5％イソフルラン（2-クロロ-2-（ジフルオロメトキシ）-1,1,1-トリフルオロ - エタン） - 2で麻酔下にマウスを置きます。加熱パッドを使用して体温を維持。つま先のピンチに反応するために評価することにより、完全な麻酔を確認し、anestheを維持2.5％のイソフルラン - 2でSIA。 注：呼吸数の動物を監視し、手順全体応じイソフルラン流量を調整することが重要です。 </li><li>外科手術中に目の過度の乾燥を避けるために、それぞれの目の上に人工涙液または獣医軟膏の少量を置きます。 </li><li>露出した腹部とその背中に、仰臥位でマウスを置きます。 </li><li>化学脱毛の領域を拭いて4 番目の鼠径部乳腺の乳首まで第2リブ空間から齧歯類の腹左側に髪を削除します。 2分した後、この手順は1行うことができガーゼとH 2 Oで完全に削除- -数多くの手術が予定されている場合は、時間を節約するために、事前に2日間脱毛は1のために座ってできるようにします。 </li><li> （2％クロルヘキシジンに浸した）1 2×2 &quot;滅菌ガーゼスポンジを取り、脱毛部位にマウスを拭いてください。全体の周囲を滅菌、尾を含め、細菌続きを最小限にするために楽器のアミノ化。 </li><li>脱毛の部位とアルコールの準備パッドとダウン周辺エリアを拭いてください。 </li><li>もう一度2％クロルヘキシジンとアルコールの手順を繰り返し、最終的なクロルヘキシジンで仕上げ3 2％クロルヘキシジンおよび2アルコールプレップパッドの洗浄の合計のために拭いてください。最終クロルヘキシジンは、化学物質が内臓にクロルヘキシジンとなることを避けるために、手術部位の周りに滴下しないように拭いてください。注：クロルヘキシジンアルコール皮膚および周囲の毛の大量のアプリケーションの体温の有意な低下をもたらし得ます。ステップ2.7から2.9の間に過剰量で拭かないでください。加熱パッドで体温を維持。 </li><li>滅菌手袋、滅菌刃で滅菌メスを用いて、マウスの左側の中央値と矢状面との間の皮膚への単一の1インチの切開を行い、ちょうど肋骨の下から始まり、ちょうど第四鼠径部の平面の上に終わります乳腺乳頭。 </li><li>オートクレーブ処理またはビーズ滅菌ハサミやピンセットを使用して、腹腔に類似した1インチの切開を行います。乳房脂肪パッドに切断避け、腸、肝臓、または横隔膜をカットしないように確認してください。 </li><li>切開は、内部器官をガーゼの上に置き、周囲の皮膚または手術部位に接触しないことができるようになされた、マウスの左側の滅菌生理食塩水に浸漬した4×4 &quot;ガーゼパッドを置きます。 </li><li>腫瘍細胞は、マウスの準備中に沈降するように上下に数回ピペッティングにより腫瘍細胞を準備します。腫瘍細胞を25μlの取り外し可能な針注射器および32ゲージの針を準備します。腫瘍細胞が針の先端にあり、プランジャが注射のための適切な音量になるまで注射器に押し込みます。気泡の注入を避けます。 </li><li>任意の外部腫瘍細胞を除去するために、無菌のアルコールパッドで針の外側を拭いてください。針刺しを回避するために、十分に注意してください。 </li><li>中央値SIDを保持しますさておき鉗子で皮膚および腹膜ライニングを含む切開の電子と、慎重に滅菌生理食塩水に浸した滅菌ガーゼ上に置く、大腸及び小腸を引き出すために滅菌綿棒を使用しています。門脈が可視化されるまで、大腸及び小腸を引き出します。 </li><li>内部の水分や無菌性を維持するために生理食塩水に浸したガーゼで臓器をカバーしています。 </li><li>また、滅菌手袋を着用し、アシスタントを持って、静かに滅菌綿が完全に門脈を明らかにするために綿棒をひっくり返して邪魔にならないように生理食塩水に浸したガーゼに包まれた腸を保持します。さらに、切開部の中央側の脇に組織を保持するために、オートクレーブ止血鉗子または鉗子を使用する必要があるかもしれません。 </li><li>傘を上に向けて、静脈に5°&lt;角度で肝臓下の10ミリメートル〜門脈に5ミリメートル - 〜3腫瘍細胞を装填した針を挿入します。ゆっくりと腫瘍細胞を含むフル・ボリュームを注入します。血液が針の時間を過ぎて流れることを可能にします静脈からの腫瘍細胞の逆流を避けるために数秒間EAD。注入中の静脈に針を動かす最小限に抑えます。ここでも、針刺しを回避するために注意してください。 注：好ましい場合、門脈の可視化倍率なしで行われ、ただし、立体顕微鏡を使用してもよいです。 </li><li>同時に圧力で静脈に滅菌綿棒を配置しながら、針を外します。静脈に注射部位の上に1cm 2の止血ガーゼ-アシスタントがまだわき腸を保持して0.5の1枚を配置します。 注：止血粉は、プロトコルのこのステップのためにしようとしましたが、注射後の静脈血の損失を止めるのに効果的ではなかったです。 </li><li> 5分間の滅菌綿棒からの圧力で、注射部位での止血ガーゼを保持します。 </li><li>ガーゼは、周囲の組織にsteril少量のスティック場合は、慎重に止血ガーゼを持ち上げて静脈の閉鎖を評価しますE生理食塩水を浸漬し、ガーゼを持ち上げるために使用することができます。 </li><li>血液の損失がこの時点で発生した場合は、さらに5分間圧力を持つサイトでの止血ガーゼの追加部分を配置します。血流が完全に停止したときに、マウスからガーゼを除去します。 注：外科的処置中の血液損失は慎重にマウスがしばらく心臓灌流によって、麻酔下で安楽死させなければなりません評価し、合計許可血液損失量に達するか超えた場合（研究者の治験審査委員会の規制標準操作手順に基づいて）する必要があります。 </li><li>注射部位は、注射部位を残していない血液で、そのままと判断すると、静かに戻って腹腔内に内臓を配置します。 </li><li>腹膜ライニングと、単純な連続または結節縫合パターンを用いて、滅菌4-0ビクリル縫合糸とテーパー針で皮膚を縫合。一般的に、切開部を閉鎖することは10-15縫合が必要です。 </li><li> bupiの100μLを注入しますインスリン注射器を用いて局所疼痛管理のための切開部位に沿ってvacaine（5 mg / mlで）。滅菌生理食塩水を皮下水和26ゲージ針を有する1mLの注射器を用いて0.5mlのを注入します。完了するまでに25分 - 手術は15を取ります。 </li><li>手術全体の無菌状態を維持するために、手袋をはめた手を含め、すべてのツールや材料をマウスに接触していることを確認し、接触する前に適切に洗浄されます。可能な場合は使用無菌材料と手袋、または最小限にきれいにする70％エタノール溶液または10％の漂白剤溶液を利用します。 </li><li>複数の手術は、単一のセッションのために計画されている場合は0.5に、新しい滅菌ドレープ、インスリン注射器で1ミリリットル注射器、滅菌生理食塩水、2×2」、滅菌ガーゼスポンジ、4×4 &quot;滅菌ガーゼ、止血ガーゼカットを最初の手術領域をリメイク - 1cm 2の個、テーパー針で4-0ビクリル縫合糸、および2％のクロルヘキシジン。手術の間にはさみ、鉗子、止血剤をビーズ滅菌および許可適切に再利用する前に冷却します。 </li></ol> 3.げっ歯類の健康を監視回復、およびエンドポイント分析<ol><li>手術手順が完了した後、20分の最小のための寝具のない、きれいなケージに回復のための加熱パッド上でマウスを維持します。麻酔から覚ますために4分 - マウスは、通常、2を取ります。 </li><li>それは完全に麻酔から回復するまで他の動物との共同居住に手術を受けた動物を返さないでください。動物は胸骨横臥位で自分自身を維持する能力を回復するまで、それは意識を取り戻している間に無人の動物を離れて監視しないでください。 </li><li>疼痛管理のために最大72時間毎に6-12時間後に手術を、0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン - マウスに0.05を与えます。 </li><li>彼らは治癒中に無傷のまま確実にするために毎日の縫合糸を確認してください。縫合糸がほどけてくる場合には、残りの縫合糸を取り外し、交換し、麻酔下にマウスを置きます。感染またはinflammの場合ationが獣医スタッフに相談してください。 注：感染または炎症は、このプロトコルに遭遇していません。 </li><li>転移研究のために、転移性疾患の外向きの兆候を含めて観察されたが、これらに限定されないまで、毎日の健康チェックを実行：&gt; 10％の重量損失/利得、だらしなさ、周囲への注意の喪失、腹部浮腫/腹水、淡い目と耳、または猫背の姿勢。 注：転移のタイムラインが十分に理解されるまで、新たな細胞株または細胞濃度で使用するためのモデルを開発する際デイリーヘルスチェックは特に重要です。 </li><li>研究のエンドポイントで、頸椎脱臼に続いてCO 2吸入によりマウスを安楽死させます。 注：研究者」監督委員会によって承認された安楽死の別の方法は、麻酔下にある間、1×PBSで灌流を含め、使用することができます。肝臓の灌流は、門脈をカニューレ挿入下大静脈をつむ、および1×PBS番目を押すことによって行われます循環血液と白血球を除去するために2分 - 1分間4ミリリットル/の速度でラフな肝血管系。 注：研究では、細胞株、および使用される濃度のエンドポイントに応じて、顕性肝転移がまたは剖検で明らかであってもなくてもよいです。微小転移病変は、肝臓の組織学的分析で明らかにすることができます。エンドポイントは、研究デザインによって異なります。 </li><li>最初の胆嚢を除去することにより、ハサミやピンセットで肝臓を抽出し、その後肝臓に優れた下大静脈を切断。大静脈、門脈、および肝臓に劣る肝動脈を切断。 </li><li>優しく肝臓全体を削除し、1×PBSで5回洗浄します。 </li><li>左、右、中央値、および尾状葉に肝臓を分離します。 </li><li> 48時間、10％中性緩衝ホルマリン中にホルマリン固定肝室温で振とうしながら。プロセスが集中し、キシレンを増加させるのにアルコールの一連の組織します。パラフィンは、固定された組織71を埋め込みます</s&gt;アップ。 注：別の方法として、肝臓は最適切断温度（OCT）式とcryomoldに組織を配置し、95％エタノール中に沈め、ドライアイスペレットに凍結することによって急速冷凍することができます。 <ol><li>ミクロトームを使用して、組織のマッチヘッドサイズが明らかにされるように、パラフィン包埋組織ブロックにカット。 </li><li> 5 4ミクロンの連続切片をカットし、これは、分析のための最初のレベルを構成しています。 </li><li>組織の250ミクロンを切って、廃棄物中のこれらのセクションを投げます。 </li><li> 250ミクロンで、5 4ミクロンの連続切片の第二のレベルをカット。 </li><li>肝臓全体を通してセクションに、必要に応じて繰り返します。ヘマトキシリンおよびエオシン染色あらゆるレベルの最初のセクションでは、転移72のために評価しました。 注：スナップ凍結組織についてのセクションをカットするクライオスタットを使用しています。 注：微小転移疾患の検出は、腫瘍細胞特異的染色が必要になります。 </li></ol></li><li>切開シットでの腫瘍の成長がある場合、調査からマウスを削除しますE、これは注射後腹膜腔への腫瘍細胞の漏出を示しました。 注：この問題は観察されませんでした。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もなく、競合する金銭的利益はないと宣言している。

BALB / cマウスポータル静脈注射モデルは、交絡多臓器転移の不在下で、完全に免疫適格宿主に肝臓での乳腺癌病変の研究が可能になります。私たちのプロトコルは、直接肝臓16,55,56への腫瘍細胞の注射のための門脈へのアクセスを許可する以前に公開された外科的手技の進歩です。我々が行った一つの進歩は著しく/注入万の腫瘍細胞を≤する≥1×10 5細胞/ダウン注射16,55,56から注入された腫瘍細胞の数を減少させることです。また、肝臓への乳癌転移の研究のためのモデルを拡大しています。このプロトコルを使用して、既知の転移の可能性を有する2つの乳癌細胞株は、より静止乳腺腫瘍細胞株よりも短い待ち時間で肝転移を発症します。また、初期の時点で、腫瘍細胞は、単一のCEの単一または小グループとして肝実質全体に分散されています腫瘍細胞注射後LLS。肝臓でのマイクロ転移性と明白な転移性疾患の発展に貢献し、すべての表現型 - モデルは、腫瘍細胞の血管外漏出、細胞の生存、休眠、および増殖などの転移効率の問題に対処する態勢を整えています。 研究を開始する前に門脈注入プロトコルの多くの側面を考慮することが重要です。慎重細胞株、細胞濃度、総細胞数、およびより小さな探索研究に基づいて関心のエンドポイントを決定することを強くお勧めします。さらに、免疫コンピテント宿主と同系の細胞株の使用は、宿主 - 腫瘍細胞の相互作用を理解するために最も重要です。脳下垂体前葉から新たに開発した「光るヘッド」のeGFPを発現するマウスとルシフェラーゼが、外因性のeGFP、ルシフェラーゼに対する宿主応答を排除するための重要なツールである、タンパク質は、しばしば乳腺腫瘍株75をタグ付けするために使用します</sup&gt;。 「光る頭 &quot;マウスと同系の使用は、腫瘍細胞がeGFPをまたはルシフェラーゼに対する炎症反応の心配なしIHCによって、単一の播種された細胞の容易な同定および微小転移巣を容易にするタグ付けされました。同様に、最小限の抗または薬物治療計画からプロ腫瘍への影響を確実にするために慎重に疼痛管理戦略を選択することを強くお勧めします。このプロトコルでの重要なステップは、これは任意の結果を混乱させるだろうとして、感染症が発生しないことを確実にするために手術を通じて無菌状態を維持することが含まれます。腫瘍細胞が肝臓に送達されることを保証するために、針が適切に門脈内に配置されていることも重要です。このような墨汁などの染料とのプロトコルを練習すると、この問題に役立ちます。皮膚切開部位での腫瘍の増殖は、不適切な針の配置が発生したことを最良の指標です。最後に、門脈からの血液損失を適切に制御し、suturiに完全に前に停止していることが重要です動物ngの。止血ガーゼの使用が大幅に注射後の門脈から制御されていない血液損失のリスクを減少させます。私たちの手で、手続きに関連する死亡による失血に門脈から次の注入は、止血ガーゼを使用したマウスの2％に30％から低下しました。 ポータル静脈注射モデルは完全な転移カスケードを複製しないことに注意することが重要であるが、腫瘍細胞の血管外漏出、血管外漏出および腫瘍の成長を以下の腫瘍細胞ニッチの相互作用の研究に限定されています。患者に起こるような正確に肝臓への完全な転移カスケードを複製するモデルは、緊急に必要とされています。門脈注射モデルの追加の制約は、それが疾患の進行76,77に影響することが知られている創傷治癒と、ホスト上の手術の影響によって混乱されることです。 門脈注入モデルは、他の注射の改善を示します心臓内および脾臓内モデルを含む肝転移を研究するためのモデル、。具体的には、門脈注入モデルは、多くの場合、他の組織の同時転移によって制限されている心臓内モデル、より疾患進行のより広い範囲の研究を可能にします。脾臓内モデルで行われているように、さらに、門脈モデルは、脾臓の除去によって複雑化されていません。 門脈注入モデルは、一般的には肝転移の研究のための有用なツールを証明することができます。肝転移は、特に高い膵臓癌料金（転移の85％が肝臓にある）、結腸および直腸腺癌（&gt; 70％）、ならびに胃と食道（&gt; 30で、全体の腺癌における転移の最も頻度の高いサイトです％）1。膵臓癌および結腸腺癌の自発的および同所性原発腫瘍モデルはより容易に肝臓78,79に転移するが、門脈静脈注射モデルはPROVあり腫瘍細胞の制御された送達として、これらの癌の転移過程を理解するための有用なeは、腫瘍細胞の到着後、指定した時間に、生化学的分子および組織学的評価を可能にします。要約すると、門脈注射モデルは、乳癌の利用可能な肝転移モデルの重要な改善を示し、また、一般に、肝転移の分野にも適用可能です。

肝臓への乳癌転移 肝臓、骨および肺1-3とともに、乳癌転移の一般的な部位です。乳癌患者における肝転移は4.8から15ヶ月6-9に肝転移範囲を有する乳癌患者の生存期間の中央値として、非常に予後不良4,5のための独立した予後因子です。これとは対照的に、肺または骨転移を有する乳癌患者は9 27.4ヶ月8,9及び16.3〜56ヶ月それぞれ8,10-12、メジアン生存率を有します。転移は、原発腫瘍における腫瘍細胞の播種で始まりによる遠隔臓器13-15内の循環腫瘍細胞の播種および成長に患者の死亡率で終わる転移カスケードと呼ばれる多段階プロセスです。 10％ - 転移のげっ歯類モデルは、転移カスケードのみが0.02で、著しく非効率的であることを明らかにしました顕性転移16,17を確立する腫瘍細胞を循環させます。転移性の非効率性の1つの主要なボトルネックを理解部位特異的転移の重要性を強調し、転移性ニッチ18と呼ばれる、セカンダリサイトでのユニークな組織微小環境によって決定されます。転移性のニッチの再発部位に特有であり、かつ、部分的には、別個の細胞外マトリックスタンパク質19,20の堆積、種々の免疫細胞集団21-23の浸潤、および多数のサイトカインの調節不全の生産を含む改変された組織の恒常性によって特徴付けられます、ケモカイン、および成長因子15,18,24,25。このように、組織特異的転移性のニッチを理解することは、転移性疾患を対象とする方法の理解を先行します。しかし、肝転移の堅牢なモデルが欠けています。さらに、肝転移の改善されたモデルは、乳癌患者ののwiのための新たな標的と効果的な治療を識別するために不可欠となります第肝臓転移。 肝臓への乳癌転移を研究するためのモデルを確立 現在、肝臓に乳癌転移を研究するための利用可能なモデルは、免疫不全マウスにおけるヒト癌細胞の異種移植片を含みます。 - / - 、またはSCID免疫低下マウスホスト26〜29これらのモデルは、典型的には、MCF-7及びMDA-MB-231およびヌード、RAG1としてよく研究ヒト乳癌細胞株を使用します。異種移植モデルは、ヒト由来の癌細胞株を含むことの利点を提供し、しかし、転移30-32および治療抵抗33-35で免疫細胞のための最近の感謝を与え、完全に免疫適格宿主における転移の研究は非常に重要です。または外科手術せずに、乳房脂肪パッドに同系の腫瘍細胞（ 例えば 、4T1とD2A1細胞株）の同所性注入を含む免疫有能なホストで肝臓に乳癌転移を研究するためのモデル原発腫瘍の切除、および転移36-38のその後の評価。注目すべきは、同所移植モデルからの肝転移の速度は、肺39,40のような他の転移部位に比べて非常に低いか、存在しない、または肺転移が確立された後に発生し、肝臓特異的転移37,39の研究を複雑。 自発的な遺伝子操作された乳癌モデル由来の腫瘍外植片が同系の腫瘍細胞としてナイーブ宿主の乳房脂肪パッドに再注入することができます。例えば、それは最近、同所野生型宿主に注入した場合、K14 のCre ECAD F / Fの P53のF / Fマウスからの自発的な腫瘍がどのモデル浸潤性小葉乳癌、腫瘍を発症することが報告されました。それらが15mm 2に達すると、これらの腫瘍の外科的切除に続いて、マウスの18％は、肝転移40,41に進行しました。肝転移の利用をモデル化するための第三のアプローチ遺伝子操作されたマウスにおける自然転移。現在までに、容易に肝臓に広がっ乳癌転移の自発的なマウスモデルの報告はまれです。例外は、H19-IGF2、p53のfpの/ FP MMTV-CreをWAPベースのCre、およびK14 のCre ECAD F / Fの P53を含むF肝転移がマウスの低い割合で発症遺伝子操作されたマウスモデルで、f / 38,41- 43。遺伝子操作したマウスモデルは、転移カスケード、強力かつ臨床的に関連するモデルを提供するのすべての段階の研究を促進しつつ、それらが原因で肝転移38の低い速度に制限されています。 いくつかの転移モデルは、原発腫瘍と血管内からの腫瘍細胞の播種を含む転移カスケードの初期段階をバイパスします。これらのモデルは、血管外漏出からセカンダリサイトでの腫瘍の確立に、転移カスケードの後のステップへの調査を可能にします。 int型racardiac注入モデルは、大動脈を介して循環系に腫瘍細胞を分配する左心室の中に腫瘍細胞を送達します。心臓内注射は、注射部位の超音波ガイド付きイメージングまたはそのようなルシフェラーゼの生物発光などの他の画像診断法は、細胞が成功した注射を確認するためにタグ付けさが必要です。左心室を介した腫瘍細胞の注射は、他の器官44-48の間、骨、脳、肺、および/または肝転移をもたらすことができます。そのため、多臓器転移のため、これらのマウスは頻繁に完全に肝内転移性増殖を調査する能力を否定、前顕性肝転移の発展に安楽死させる必要があります。大幅マルチサイト転移の発生を最小限に別のアプローチは、脾臓内注射モデルです。脾臓内注射は門脈49,50になるために上腸間膜静脈と合流脾静脈を介して腫瘍細胞を提供します。動物はoutgrのために監視することができます肝臓での転移病巣のowth他の部位の転移の形成は稀であるため、結果として、動物の全体的な健康状態は49,50を維持されています。しかし、脾臓内モデルは、脾臓腫瘍49,50、衝撃免疫機能の手順を避けるために、脾臓摘出を必要とすることに留意することが重要です。例えば、心筋虚血再灌流障害は、脾臓に由来し、虚血51,52以下の創傷治癒中の貪食およびタンパク質分解活性を担当しているLy6C +単球サブセットの浸潤を特徴とします。脾臓摘出により、52創傷治癒に役立つ単球集団で観察された減少があります。さらに、脾臓摘出は、具体的に循環し、腫瘍内CCR2 +のCD11b + Ly6C +単球骨髄の数の減少を介して、非小細胞肺癌モデルにおける原発性腫瘍増殖および肺転移を減少させることが示されていますID細胞53。さらに、結腸癌細胞の脾臓内注射後の脾臓摘出は、腸間膜リンパ節および高い肝転移54における抗腫瘍NK細胞のレベルの低下をもたらしました。要するに、これらの知見は、脾臓摘出術は、転移性細胞の運命に対するその後の影響で免疫システムの役割を損なうことを示唆しています。 肝転移のポータル静脈注射モデル マウスによる多臓器転移に損なわれない条件下で完全に免疫コンピテント宿主における肝臓への乳癌転移を調べるために、門脈注射モデルを開発しました。門脈内注入モデルは、結腸直腸55,56およびメラノーマ16細胞株の肝転移を研究するために以前に使用されてきました。ここでは、同系の乳腺腫瘍細胞の転移をモデル化するために門脈内注入の適用を説明します。このモデルは、研究するために使用することができます明白な病変に死/増殖/休眠、および成長に関する乳癌細胞溢出と播種、腫瘍細胞の運命決定を含む、転移カスケードの後期。このモデルでは、同系の乳腺腫瘍細胞株は、免疫適格のBalb / c雌マウスの門脈、脾臓を除去することなく、肝臓に最初に直接腫瘍細胞に送達する方法を介して注入されます。 D2.OR、D2A1、および4T1を、とに緑色蛍光タンパク質（D2A1-GFP）でタグ付けD2A1を採用している：このモデルを、ローからハイへの転移能力の範囲で4乳腺腫瘍細胞株の使用は、使用した開発するために、腫瘍細胞注射後の早い時点を調べます。 4T1は自発的にMMTV +のBalb / c雌マウス36,37で発生したと乳房脂肪パッド原発腫瘍39,57,58から肺、肝臓、脳、および骨に転移410.4腫瘍由来高転移性細胞株です。 D2A1腫瘍細胞WEReはまた、元々 D2過形成肺胞結節細胞の移植後のBalb / c系ホストで発生する自発的な乳腺腫瘍に由来し、そして肺59,60に原発腫瘍からの転移であることが確認されています。彼らは原発腫瘍を脱出し、セカンダリサイトに到着したもののD2.OR腫瘍細胞は、それらがめったに遠隔転移60,61を確立していない、D2A1ラインに非転移性の姉妹ラインであると。 加えて、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）の間、または外科的処置の後などの一般的に用いられる疼痛管理薬の使用を回避することが重要です。 NSAIDは、特定の乳癌において62-65の抗腫瘍活性を有し、NSAIDのいくつかのクラスは、潜在的に肝転移、肝臓転移性ニッチの研究を損なう、肝毒性66,67のリスクを高めます。さらに、研究は、NSAIDが直接プロ転移性の内線を削減、組織微小環境に影響を与えることを示唆していますracellularマトリックスタンパク質テネイシンC 68および繊維状コラーゲン62,65。代替的に、オピオイド誘導体、ブプレノルフィンの使用は、オピオイド、抗腫瘍活性70を有しているという証拠の欠如に起因するげっ歯類疼痛管理69とで、その有効性を使用しました。肝臓への不要な損傷を避けるために、10μlの - このポータル静脈注射モデルは5のより小さな注入量のために最適化しました。モデルはまた、小さい直径（≥32ゲージ）とすぐに処置中の血液損失を最小限に抑えるために、注入後の止血ガーゼを使用して針を含むように最適化されました。これらの最適化された注入パラメータとは対照的に、細胞数は、細胞株の腫瘍形成能に基づいて、個別に決定されるべきです。しかし、10,000細胞/長期試験のための注射が推奨さ≤から始まります。短いエンドポイント（ 例えば、24時間後の注射）のために、かなり多くの腫瘍細胞（ 例えば 、1×10 5 -保証される場合、1×10 6）を用いることができます。要約すると、ここでは詳述し門脈注入モデルは、肝臓への乳癌転移の研究のための有用なツールを表し、他の肝転移モデルの多くの制限を回避します。このモデルは、腫瘍細胞の血管外漏出、播種、免疫適格マウス宿主中で生存、増殖、および休眠、および転移性成長の初期の運命決定の研究を促進します。

<table><tbody><tr><td>1 mLシリンジ w/ 26ゲージ ニードル</td><td>BD シリンジ</td><td>309597</td><td>皮下ブプレノルフィン注射用; 注意、シャープ</td></tr><tr><td>なアルコール準備パッド</td>を使用 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-669-62</td><td>外科的切開前の腹部の洗浄用</td></tr><tr><td>万能スポンジ、滅菌ケン</td><td>ドール</td><td>8044</td><td>4インチ x 4 インチ、滅菌生理食塩水に浸して大腸と小腸を保護し、水分補給しながら使用します。手術</td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>ラグビー</td><td>370114</td><td>鉱物油 15%、白色ワセリン 83%; 手術中に目を保護するために使用</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン HCl、0.3 mg/ml</td><td>製造 レキット ベンキーザー</td><td>NDC-12496-0757-1</td><td>0.05 - 0.1 mg/kg 体重で使用、1 日 1 - 2 回、72 時間、皮下注射</td></tr><tr><td>ブピバカイン HCl、0.5% (5 mg/ml)</td><td>製造、ヒュミラ社</td><td>NDC-04091163-01</td><td>0.5%、手術直後の1倍、10 &mu;l 切開部位に皮下注射&nbsp;</td></tr><tr><td>抗CD45抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td>転移性病巣Celox&tradeの同定において白血球を除外するための多重免疫蛍光法での使用</td></tr><tr><td>。迅速止血ガーゼ</td><td>Medtrade製品株式会社</td><td>FG08839011</td><td>5 mm&sup2にカットします。ピースは、注射後の圧力で門脈からの血流を停止するために使用します</td></tr><tr><td>化学脱毛剤</td><td></td><td></td><td>手術領域から髪の毛を取り除くために使用します。複数の供給</td></tr><tr><td>者 クロルヘキシジン、2% ソリューション</td><td>獣医 1</td><td>1CHL008</td> 注意して、マウスの抗CK18抗体アブカムab53118<td>の粘膜や耳にクロルヘキシジンを取得しないでください</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>転移性病巣を同定するためのマルチプレックス免疫蛍光法での使用</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター、滅菌</td>済み <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-400-114</td><td>6インチ木製シャフト 2個/エンベロープ</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>D2A1、D2.OR、および4T1乳腺腫瘍細胞株で使用するための細胞培養培地ベース</td></tr><tr><td>ドライガラスビーズ滅菌器</td><td></td><td></td><td>手術の合間に使用してステンレス製の工具を滅菌し、注意して使用してください。複数の供給者</td></tr><tr><td>エタノール、70%溶液</td><td></td><td></td><td>可燃性に注意して使用してください。必要に応じて手術部位の清掃に使用してください; 複数の供給者</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>D2A1、D2.OR、および4T1乳腺腫瘍細胞株で使用するための細胞培養培地添加剤、DMEM高グル</td></tr><tr><td>コースガーゼ、滅菌ケン</td><td>ドール</td><td>2146</td><td>で10%使用2インチ x 2インチ、クロルヘキシジンに浸して使用 外科的切開の前に腹部の洗浄のために2%溶液</td></tr><tr><td>抗緑色蛍光タンパク質抗体</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>BA0702</td><td>GFPタグ付きD2A1または他の乳腺腫瘍細胞株の染色に使用</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>D2A1、D2.OR、および4T1乳腺腫瘍細胞株で使用するための細胞培養培地添加剤、 DMEM高グルコース</td></tr><tr><td>加熱パッド、x 2 - 3</td><td></td><td></td>で2 mM(1x)で使用 <td>手術および回復中に体温を維持するために使用;複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>1483</td><td>細胞をカウントするための細胞培養に使用するため</td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td></td><td></td><td>ステンレス鋼;複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>抗Heppar-1抗体</td><td>Dako</td><td>M7158</td><td>転移性病巣の同定において肝細胞を除外するためのマルチプレックス免疫蛍光法</td></tr>での使用 <tr><td>インスリンシリンジ、0.3 ml、29ゲージ</td><td>BD&nbsp;&nbsp;</td><td>324702</td><td>縫合部位でのブピバカイン注射の場合、注意、シャープ</td></tr><tr><td>なイソフルラン</td><td>ピラマル</td><td>NDC-66794-017-25</td><td>2.5%イ</td></tr><tr><td>ソフルラン気化器</td><td>VetEquip</td><td>911103</td><td>注意して、麻酔ガスを気化させます</td></tr><tr><td>光源</td><td></td><td></td><td>手術野を視覚化するために使用 中</td></tr><tr><td>性緩衝ホルマリン、10%</td><td>Anatech株式 会社。</td><td>135</td><td>注意、毒性、転移エンドポイントの組織固定剤としての使用、および組織学Opal&tradeによる転移負荷の評価</td></tr><tr><td>; 4色fIHCキット</td><td>PerkinElmer、Inc.</td><td>NEL794001KT</td><td>マウス肝臓の転移を検出するためのHeppar-1/CD45/CK18の多重免疫蛍光法に使用</td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td></td><td></td><td>ステンレス鋼; 注意して、鋭く使用; 複数の供給者</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン、100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>D2A1、D2.OR、および4T1乳腺腫瘍細胞株で使用するための細胞培養培地添加剤、DMEM高グル</td></tr><tr><td>コースリン酸緩衝生理食塩水で1倍で使用</td><td></td><td></td><td>注射前に腫瘍細胞を再懸濁するために1xで使用、複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>取り外し可能なニードルシリンジ、25 &mu;l、モデル 1702</td><td>ハミルトン</td><td>7654-01</td><td>門脈注射用; 腫瘍細胞負荷針での作業中は特に注意して使用してください。針が取り付けられている場合は鋭利</td></tr><tr><td>メス ハンドル</td><td></td><td></td><td>ステンレス鋼; 複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>メス ブレード、#15</td><td></td><td></td><td>炭素鋼、滅菌済み、サイズ 15; 複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>スモール ハブ リムーバブル ニードル、32 ゲージ</td><td>ハミルトン</td><td>7803-04</td><td>門脈注射用、長さ1インチ、ポイントスタイル4、12°C;角度、33〜34ゲージの再利用可能な針も使用できます。腫瘍細胞をロードした針、鋭い</td></tr><tr><td>次亜塩素酸</td><td></td><td></td>ナトリウム <td>使用注意、腐食性; ワークスペースと表面を消毒するために10%で使用</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-212</td><td>0.9% NaCl 溶液; あるいは、自家製で滅菌ろ過された</td></tr><tr><td>手術用手袋、滅菌</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>にすることができます縫合糸、滅菌&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 27"コーティングvicryl w / 22ミリメートル1 / 2cテーパーエタロイ針;注意、シャープ</td></tr><tr><td>なテーブルトップポータブル麻酔器</td><td>VetEquip 901801</td><td></td>マウス麻酔親指ドレッシング鉗子<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>のためのイソフルラン気化器と使用ステンレス鋼<td>、鋸歯状、鈍い;複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>タオルは、滅菌&nbsp;</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>18" x 26"は、加熱パッドをカバーし、手術中に無菌ワークスペースを提供します</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズT10282</td><td>生存率を評価するために細胞培養で使用するには、1x PBS</td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA、0.05%の</td>細胞と1:1を使用します (1x) <td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>組織培養プレートから腫瘍細胞を分離するための細胞培養での使用</td></tr></tbody></table>

乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

乳癌は、世界中の女性の癌関連死亡の主要な原因です。 15ヶ月 - 肝転移のみ4.8の平均生存率と予後不良の乳癌の転移を有する例30％の上向きにし、その結果に関与しています。原発腫瘍細胞異種移植片と自発腫瘍モデルを含む、乳癌転移の現在のげっ歯類モデルは、まれに肝臓に転移しません。心臓内および脾臓内注射モデル肝転移を生じないが、しかし、これらのモデルは、注射部位での腫瘍の成長を回避するために起因する脾臓の除去に付随する二次部位への転移によって、または妥協免疫によって混乱することができます。改良された肝転移モデルの必要性、開発された肝臓に最初に直接腫瘍細胞に送達するマウス門脈注入法に対処します。このモデルは、他の臓器や脾臓の除去における同時転移の合併症なしで肝臓に腫瘍細胞を提供します。オプト血液損失を制御するために、注射部位を10μl、≥32ゲージの針、および止血ガーゼ - imized門脈プロトコルは、5の小さな注入量を採用しています。様々な転移の可能性の3同系乳腺腫瘍株を使用したBalb / c雌マウスにおける門脈注入アプローチを試験しました。高転移性4T1細胞、中程度の転移性D2A1細胞、および低転移性D2.OR細胞。あまり積極的なD2.ORラインのためのより高い転移性4T1とD2A1線で肝転移の開発のための40日間、および&gt; 55日 - 20〜の待ち時間で≤10,000細胞/注入結果の濃度。このモデルは、肝臓への乳癌転移を研究するための重要なツールであり、しばしば、結腸直腸および膵臓腺癌を含む肝臓に転移する他の癌にも適用可能です。

腫瘍細胞は、外科的処置を介して肝臓に直接送達する門脈注入モデルは、門脈に腫瘍細胞の注射を可能にします。消毒条件下で、麻酔したマウスに、A〜1インチの外科的切開がちょうど第鼠径乳腺乳頭の面上に始まり、中央値と矢状面との間に、マウスの左側に形成されているだけ肋骨下に終了します。大腸及び小腸を穏やかに門脈（ 図1A）の可視化を提供するために切開部を通して引っ張られます。門脈と成功イントラポータル注射の正確な解剖学的同定は、墨又は類似の染料で注入プロトコルを実施することによって確認することができます。門脈を経由して、正しい注射は肝臓に即座にかつ特異的に送達されるインクになりますし、肺に墨汁の広がりにはなりません（Figu）1B再。さらに、GFPでタグ付けD2A1マウス乳腺腫瘍細胞を用いて、肝臓全体、腫瘍細胞の分散は、肝臓（ 図1C）の門脈注射送達を確認する、90分後注射は明らかです。高い倍率では、それは90分注射後に、腫瘍細胞は正弦波の中だけでなく、門脈血液が肝臓（ 図1C）に入るポータル三和音に近接し、中肝実質内で発見されていることが明らかになりました。これらのデータは、活性腫瘍細胞の血管外遊出を90分後に腫瘍細胞注入で発生していることを示唆しています。まとめると、これらのデータは、門脈注射モデルは肝臓および肺への注入量のないかなりの輸送全体に分散したインクまたは腫瘍細胞を、肝臓に直接注入量を送達することを確認します。 門脈注射モデルの頑健性を評価するために、3つのSEPAR同系マウス乳腺腫瘍細胞株は、成体の雌のBalb / cマウスで試験した食べました。これらの乳腺腫瘍株は、乳房脂肪パッドモデルでその特徴の行動に基づいており、非常に攻撃的かつ転移性4T1細胞株、あまり積極的な転移性D2A1ライン、および低/非転移性D2.ORラインを含む選択した37,61,73 、74。注射当たり2,000と10,000個の細胞は、これらの低細胞濃度で明白な転移の発生までの時間でno顕著な違いを用いて試験しました。肝転移の有無をイントラポータル配信を確認するため、肝臓および他の器官の視覚的評価によって確認された際に、これらの研究のために、転移の代理マーカーは、剖検を正当化するために、このようなグルーミングの欠如、蒼白、および体重減少として使用しました。これらのデータは、より短い無転移生存率が観察される4T1とD2A1細胞株を注射したマウスと比較して、より積極的な乳腺腫瘍株を表すという以前の報告を確認しますあまり積極的なD2.ORライン（ 図2A）で。マウス〜30による明白な肝転移開発4T1またはD2A1腫瘍細胞を注射- D2.OR細胞を注射した1匹のマウスだけが持っていたのに対し、早ければ18日後、注射（ 図2A）として40日後、注射、およびいくつかの先進転移をポスト腫瘍細胞注射65日 - 60だった、試験終了により顕性肝転移を開発しました。転移は、その後、250ミクロンレベルの肝臓を通して切片ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色した切片（ 図2B-D）を分析することにより確認しました。 マウス肝臓における明白な転移病変の検出に加えて、門脈モデルは、溢出次単一細胞/細胞クラスターの検出、および微小転移病巣の形成を含む、転移カスケードの以前の事象を研究するために利用することができます。多重免疫蛍光染色を使用しましたH＆Eは、小さな病変の存在を確認するのに十分ではないとして、彼らは、単一細胞またはマイクロ転移病巣として存在しているときに、肝臓で4T1、D2A1、およびD2.OR乳腺腫瘍細胞を検出します。 図3Aは、肝細胞マーカーHeppar-1のための汎免疫マーカーCD45について陰性、上皮ケラチンCK18用正、負でありD2A1腫瘍細胞の推定上の微小転移巣を持つ代表的なBALB / cマウスの肝臓を示しています。肝細胞はまた、この染色パネルでHeppar-1の使用を必要とする、CK18に陽性染色します。一つの重要な注意事項は、胆管上皮と肝臓前駆細胞は門脈周囲領域（ 図3A）を評価する場合は特に、腫瘍細胞および胆管の間慎重に差別を必要とする、CK18のための陽性に染色することです。単一の播種細胞および微小転移巣を同定するために免疫蛍光を多重化する代わりに、強化緑色蛍光でタグ付けされた同系の乳腺腫瘍株を利用することですタンパク質（EGFP）および/またはルシフェラーゼとタグ（ 図1C）のためのIHCを行います。原因のeGFP、ルシフェラーゼ、および他のタンパク質の免疫原性のために、それは、脳下垂体前葉75における新規免疫有能な「光る頭"のeGFPを発現するマウスとルシフェラーゼのようなこれらのタンパク質に対して寛容化されたマウスモデルを、使用することが不可欠です。このようなD2A1腫瘍株としてタグなし同系ラインのmacrometastatic病変の同定のために、CK18 / Heppar-1 / CD45多重免疫蛍光（ 図3B）に最適です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg"> 図1： ポータル静脈注射は、肝臓に腫瘍細胞を直接提供します。 A）ポータル静脈注射。切開は第四鼠径乳腺乳頭の平面の上、ちょうど里の下に終わるから、中央値と左矢状面との間に形成されていますBケージ。 PBS注射（左）とB）のBalb / cの肝臓。門脈を経由してインドのインク注入後、肝臓（中央）ではなく、肺（右）のインクを占めます。 C）門脈を介して1×10 6個の腫瘍細胞の90分後注射でBALB / cマウスの肝臓におけるGFPでタグ付けD2A1マウス乳腺腫瘍細胞の代表的な薄切片像。肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋、切片、及び腫瘍細胞の検出のために、抗GFP抗体で染色しました。上部パネルは、アスタリスクは、中心静脈周囲に非特異的な肝細胞の染色を示し、肝臓全体に分散し、暗褐色の染色された腫瘍細胞（矢印）を示します。スケールバー=300μmの。下のパネルは依然として密接に血管系に関連した90分後注射での腫瘍細胞の代表的な画像を示します。 =50μmのスケールバー。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： ポータルの静脈注射後の肝臓におけるマウス乳癌細胞株の伸長。 2,000〜10,000 4T1、D2A1、またはD2.ORマウス乳腺腫瘍細胞を注射したマウスでは無転移生存率を示すA）カプランマイヤー曲線。マウスは、腫瘍細胞を注射し、グルーミングの欠如、淡い目、および体重変化などの転移の徴候をモニターしました。転移は、肝臓の組織切片に剖検時およびH＆Eで確認しました。 N = 2 4T1 2000細胞; 2 4T1細胞10,000個。 N = 2 D2A1 2000細胞; 3 D2A1 10,000細胞。 N = 3 D2.OR 2000細胞; 3 D2.OR 10,000細胞。 26日目での代表的なBのH＆E画像）4T1病変21日で10,000細胞の注射後、C）D2A1病変万腫瘍細胞の注射後、およびD）D2.OR病変で59日10,000個の細胞の注射後、スケールバー=75μmです。 2,000 4T1またはD2A1腫瘍細胞を注入した場合にも同様の病変が観察されます。いいえ病変は2,000 D2.OR細胞で検出されませんでした。他の臓器または外科的切開部位での転移の証拠は、これらの研究上の任意のマウスでは見られませんでした。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg"> 図3：マルチプレックス免疫蛍光を用いて、マウス肝臓での単一細胞および転移性病変の検出。門脈注射モデルを使用して90分後注射でBALB / cマウスの肝臓におけるD2A1腫瘍細胞のA）代表的なマルチプレックス免疫蛍光。染色は、マルチプレックスキットを用いて行きました。左から右に、DAPIを示す図です。 CD45は、白血球をマークします。 Heppar-3月1日にk個の肝細胞;そしてCK18は、腫瘍細胞、肝細胞、胆管上皮をマークします。 CD45 - -密接ポータルトライアドに関連付けられているD2A1腫瘍細胞マージされた画像は、CK18 + Heppar-1の推定上のクラスタを示しています。アロー= D2A1腫瘍細胞、アスタリスク=胆管上皮; =25μmのスケールバー。隣接する肝細胞はCK18 + Heppar-1 +であるのに対し、B）A.腫瘍細胞と同じ染色パネルを使用した代表的な明白なD2A1転移病巣は+ CK18です。 =25μmのスケールバー。画像は、顕微鏡ソフトウェアを使用して、×0.8 20で顕微鏡で40×1.3、および60×1.4目標とCCDカメラを捕獲しました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

門脈注射を通じてマウスの肝臓に乳腺腫瘍細胞を送達するための外科的処置が開発されました。このモデルでは、腫瘍細胞の血管外漏出、播種、生存、肝臓での転移性伸長など、完全に免疫力のある宿主における肝転移の後期段階の調査が可能になります。

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

この手順の全体的な目標は、乳がん肝転移の実験的モデリングのために、腫瘍細胞をマウス肝臓に直接送達することです。この方法は、マウス肝臓の転移カスケードの後期を研究するために使用できます。これには、乳がん細胞の血管外漏出、播種、死亡、増殖、休眠の決定、および伸長が含まれます。この技術の主な利点は、脾臓の除去やそれに伴う多臓器転移なしに、腫瘍細胞を直接肝臓に送達することです。門脈注射には直接的な解剖学的監視に依存する正確な操作が必要なため、この方法を視覚的に示すことは非常に重要です。この手続きで私を手伝ってくれるのは、Pepershadineの研究室の大学院生であるAlexandra Quackenbushです。手術を開始する前に、手術部位のすべての表面を10%漂白剤で拭き取ります。注射の1時間前に、8〜15週齢のbalb / c雌マウスを100マイクロリットルの鎮痛剤で治療し、痛みの管理のために皮下投与します。.動物の目に軟膏を塗ります。その後、マウスを仰臥位にし、つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認します。次に、尾を含む動物の手術領域と周辺領域を、滅菌ガーゼに浸した2%クロルヘキシジンワイプ3枚とアルコール準備パッドワイプ2枚を交互に使用して消毒します。最後のクロルヘキシジンワイプの後、滅菌メスを使用して、マウスの左側の正中面と矢状面の間の皮膚に1インチの切開を行い、肋骨のすぐ下から始まり、4番目の鼠径乳腺乳頭の上で終わり、続いて腹膜を通じて同様の1インチの切開を行います。次に、腫瘍細胞を数回上下にピペットで動かして細胞溶液を再懸濁し、32ゲージの針を装備した25マイクロリットルの取り外し可能なニードルシリンジに10マイクロリットルの細胞をロードします。細胞が針の先端に来て、プランジャーが注射に適した量になるまでプランジャーを押し下げます。ロードされた針の外側を滅菌アルコールパッドで拭いて、針が刺さらないように注意しながら、外部の腫瘍細胞を取り除きます。次に、切開部の中央側の皮膚と腹膜の内層を鉗子で保持し、滅菌綿棒を使用して、滅菌生理食塩水に浸した滅菌ガーゼに大腸と小腸を慎重に移動します。生理食塩水に浸したガーゼで内臓を覆い、内部の水分と無菌性を維持します。門脈が見えたら、助手が滅菌綿棒で門脈を露出させるように腸をそっと保持し、針を肝臓の約10ミリメートル下の門脈に3〜5ミリメートル挿入し、斜角を上にして5度未満の角度で挿入します。腫瘍細胞の全量をゆっくりと注入し、血液が針頭を数秒間通過して流れるようにして、腫瘍細胞が静脈から逆流するのを防ぎます。門脈への適切な視覚化、アクセス、および注入が不可欠であるため、注射を試みる前に、針に対する門脈の位置が満足のいくものであることを確認するために時間をかけてください。すべての細胞を注入したら、滅菌綿先アプリケーターで静脈に穏やかな圧力をかけると同時に、針を抜きます。次に、新しい滅菌綿チップアプリケーターを使用して、0.5〜1センチメートル四方の止血ガーゼを注射部位に保持します。5分後、ガーゼを慎重に持ち上げて静脈の閉鎖を評価します。血流が完全に止まったら、ガーゼをはがし、腸を腹腔に戻します。単純な連続縫合糸または中断縫合糸パターンを使用して、滅菌済みの4つのゼロビクリル縫合糸で腹膜の内壁を閉じ、テーパーします。同様に皮膚を閉じた後、切開部位に沿って100マイクロリットルの局所麻酔薬を注入し、続いて0.5ミリリットルの滅菌生理食塩水を皮下送達します。門脈の正確な解剖学的同定と門脈内注射の成功は、インドインクまたは同様の染料で注射プロトコルを実践することによって確認できます。門脈から正しく注入することで、インクが肺に広がることなく、すぐに肝臓に特異的に送達されます。GFPでタグ付けされたマウスメモリー腫瘍細胞を使用すると、注射後90分で肝臓全体への腫瘍細胞の分散が明らかになり、肝臓への門脈送達が成功したことが確認されます。腫瘍細胞は、正弦波内だけでなく、門脈の血液が肝臓に入る門脈トライアドに近接した肝実質内にも見られ、この時点で活発な腫瘍細胞の血管外漏出が起こっていることを示唆しています。これらの生存曲線が示すように、侵攻性乳腺腫瘍細胞株の養子縁組門脈移植は、侵攻性の低い腫瘍細胞株を注射したマウスと比較して、無転移生存率を短くする。これらの動物からの転移は、肝臓を250ミクロンレベルで切片化し、その後のサンプルのH&E分析によって確認することができます。さらに、免疫蛍光分析は、これらの代表的な画像で示されているように、CD45陰性、Heppar-1陰性、およびCK18陽性であるD2A1腫瘍株などのタグなしシンジェニック株のミクロおよびマクロ転移性病変解析に有用です。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、マウスあたり12〜14分で完了することができます。この手順を試みるときは、注射を試みる前に、門脈を適切に視覚化してアクセスするために必要な時間をかけることを忘れないでください。この手順に続いて、腫瘍細胞注射後の生体内イメージングなどの他の方法を実行して、腫瘍細胞がlubramicro環境とどのように相互作用するかについての追加の質問に答えることができます。その開発により、この技術により、転移の分野の研究者は、マウスのさまざまな癌の転移カスケードの後期段階を探求することができます。このビデオを見た後、外科的切開を行う場所、門脈にアクセスするために内臓を穏やかに動かす方法、および門脈内注射を行う方法についてよく理解しているはずです。忘れてはならないのは、腫瘍細胞を装填した注射器での作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には針刺しを避けるために予防措置を講じる必要があることです。

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