乳癌の肝転移を研究するためのポータル静脈注射モデル

この手順の全体的な目標は、乳がん肝転移の実験的モデリングのために、腫瘍細胞をマウス肝臓に直接送達することです。この方法は、マウス肝臓の転移カスケードの後期を研究するために使用できます。これには、乳がん細胞の血管外漏出、播種、死亡、増殖、休眠の決定、および伸長が含まれます。

この技術の主な利点は、脾臓の除去やそれに伴う多臓器転移なしに、腫瘍細胞を直接肝臓に送達することです。門脈注射には直接的な解剖学的監視に依存する正確な操作が必要なため、この方法を視覚的に示すことは非常に重要です。この手続きで私を手伝ってくれるのは、Pepershadineの研究室の大学院生であるAlexandra Quackenbushです。

手術を開始する前に、手術部位のすべての表面を10%漂白剤で拭き取ります。注射の1時間前に、8〜15週齢のbalb / c雌マウスを100マイクロリットルの鎮痛剤で治療し、痛みの管理のために皮下投与します。.動物の目に軟膏を塗ります。

その後、マウスを仰臥位にし、つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認します。次に、尾を含む動物の手術領域と周辺領域を、滅菌ガーゼに浸した2%クロルヘキシジンワイプ3枚とアルコール準備パッドワイプ2枚を交互に使用して消毒します。最後のクロルヘキシジンワイプの後、滅菌メスを使用して、マウスの左側の正中面と矢状面の間の皮膚に1インチの切開を行い、肋骨のすぐ下から始まり、4番目の鼠径乳腺乳頭の上で終わり、続いて腹膜を通じて同様の1インチの切開を行います。

次に、腫瘍細胞を数回上下にピペットで動かして細胞溶液を再懸濁し、32ゲージの針を装備した25マイクロリットルの取り外し可能なニードルシリンジに10マイクロリットルの細胞をロードします。細胞が針の先端に来て、プランジャーが注射に適した量になるまでプランジャーを押し下げます。ロードされた針の外側を滅菌アルコールパッドで拭いて、針が刺さらないように注意しながら、外部の腫瘍細胞を取り除きます。

次に、切開部の中央側の皮膚と腹膜の内層を鉗子で保持し、滅菌綿棒を使用して、滅菌生理食塩水に浸した滅菌ガーゼに大腸と小腸を慎重に移動します。生理食塩水に浸したガーゼで内臓を覆い、内部の水分と無菌性を維持します。門脈が見えたら、助手が滅菌綿棒で門脈を露出させるように腸をそっと保持し、針を肝臓の約10ミリメートル下の門脈に3〜5ミリメートル挿入し、斜角を上にして5度未満の角度で

腫瘍細胞の全量をゆっくりと注入し、血液が針頭を数秒間通過して流れるようにして、腫瘍細胞が静脈から逆流するのを防ぎます。門脈への適切な視覚化、アクセス、および注入が不可欠であるため、注射を試みる前に、針に対する門脈の位置が満足のいくものであることを確認するために時間をかけてください。すべての細胞を注入したら、滅菌綿先アプリケーターで静脈に穏やかな圧力をかけると同時に、針を抜きます。

次に、新しい滅菌綿チップアプリケーターを使用して、0.5〜1センチメートル四方の止血ガーゼを注射部位に保持します。5分後、ガーゼを慎重に持ち上げて静脈の閉鎖を評価します。血流が完全に止まったら、ガーゼをはがし、腸を腹腔に戻します。

単純な連続縫合糸または中断縫合糸パターンを使用して、滅菌済みの4つのゼロビクリル縫合糸で腹膜の内壁を閉じ、テーパーします。同様に皮膚を閉じた後、切開部位に沿って100マイクロリットルの局所麻酔薬を注入し、続いて0.5ミリリットルの滅菌生理食塩水を皮下送達します。門脈の正確な解剖学的同定と門脈内注射の成功は、インドインクまたは同様の染料で注射プロトコルを実践することによって確認できます。

門脈から正しく注入することで、インクが肺に広がることなく、すぐに肝臓に特異的に送達されます。GFPでタグ付けされたマウスメモリー腫瘍細胞を使用すると、注射後90分で肝臓全体への腫瘍細胞の分散が明らかになり、肝臓への門脈送達が成功したことが確認されます。腫瘍細胞は、正弦波内だけでなく、門脈の血液が肝臓に入る門脈トライアドに近接した肝実質内にも見られ、この時点で活発な腫瘍細胞の血管外漏出が起こっていることを示唆しています。

これらの生存曲線が示すように、侵攻性乳腺腫瘍細胞株の養子縁組門脈移植は、侵攻性の低い腫瘍細胞株を注射したマウスと比較して、無転移生存率を短くする。これらの動物からの転移は、肝臓を250ミクロンレベルで切片化し、その後のサンプルのH&E分析によって確認することができます。さらに、免疫蛍光分析は、これらの代表的な画像で示されているように、CD45陰性、Heppar-1陰性、およびCK18陽性であるD2A1腫瘍株などのタグなしシンジェニック株のミクロおよびマクロ転移性病変解析に有用です。

一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば、マウスあたり12〜14分で完了することができます。この手順を試みるときは、注射を試みる前に、門脈を適切に視覚化してアクセスするために必要な時間をかけることを忘れないでください。この手順に続いて、腫瘍細胞注射後の生体内イメージングなどの他の方法を実行して、腫瘍細胞がlubramicro環境とどのように相互作用するかについての追加の質問に答えることができます。

その開発により、この技術により、転移の分野の研究者は、マウスのさまざまな癌の転移カスケードの後期段階を探求することができます。このビデオを見た後、外科的切開を行う場所、門脈にアクセスするために内臓を穏やかに動かす方法、および門脈内注射を行う方法についてよく理解しているはずです。忘れてはならないのは、腫瘍細胞を装填した注射器での作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には針刺しを避けるために予防措置を講じる必要があることです。