歯髄の評価のための直接覆髄モデルの開発、創傷治癒およびマウスにおける修復象牙質形成
2017年1月12日
我々は、in vivoでの歯髄創傷治癒と修復象牙質形成の評価のために、マウスの歯の上にキャッピング直接パルプを行うステップ・バイ・ステップ方式を説明します。
このプロトコルの全体的な目標は、マウスでの直接歯髄キャッピング手順を提示することです。この方法は、露出したパルプにトラップされた歯髄キャッピング材料を配置すると、歯髄がどのように治癒するか、修復象牙質がどのように形成されるかなど、歯髄生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒトで実際に行われる直接歯髄キャッピング手順を、マウスでもまったく同じ方法で実行できることです。
この技術の意味するところは、根管治療など、より侵襲的な治療になる運命にある歯を救うための材料特性の改善にまで及びます。処置のためにマウスに適切に麻酔をかけた後、マウスホルダーを口の中に配置し、頭が上を向くようにもう一方の端をテーブルに固定します。適切な照明とステレオスコープを使用して、最初の上顎大臼歯を観察します。
次に、200, 000 rpmの高速ハンドピースでクォーターラウンドバーを使用して、歯のエナメル質の中央領域を、透明な象牙質を通して歯髄が見えるまで取り除きます。パルプに浸透しないように注意してください。次に、no を使用します。
15歯内療法K-ヤスリ、象牙質を通して穿孔し、歯髄を露出させます。破片をパルプに押し込まないでください。これを回避するには、K-Fileを四半期ごとにローテーションし、K-Fileを引き出します。次に、MTAを準備し、エクスプローラーを使用してMTAを配送し、ペーパーポイントの裏側と軽くたたいて露出領域に詰めます。
次に、35%リン酸エッチング液を充填したシリンジを使用して、歯肉組織を避けて歯をエッチング液で覆い、エッチング液を15秒間作動させます。15秒後、歯からエッチング液を吸い取り、水で湿らせたコットンアプリケーターで残ったエッチング液を拭き取ります。すべてのエッチング液が取り除かれるまで、吸い込んで拭きます。
続いて、ペーパーポイントの裏側を使用して歯科用接着剤を塗布します。接着剤層に圧縮空気を数秒間吹き付けて薄くします。次に、適切な光で接着剤を30秒間硬化させます。
次に、エクスプローラーの先端を使用して少量のコンポジットを歯に置き、コンポジットを歯の溝に流します。塗布したら、複合材料を30秒間硬化させます。マウスを安楽死させ、上顎全体を切除した後、顎をpH 7.4のPBS中の4%パラホルムアルデヒドに入れます。
ティッシュを摂氏4度に一晩保ち、翌朝、処理できるようになるまで70%エタノールに移して保管します。上顎のマイクロCTスキャンを撮るには、まず上顎を70%エタノールに浸したガーゼで固定し、次に15ミリリットルの細胞培養チューブに詰めます。次に、チューブをマイクロCTスキャンステージに取り付けます。
次に、X 線源を 145 マイクロアンペアの電流と 55 ピーク キロボルトを 200 ミリ秒供給するように設定します。0.5mmのアルミフィルターを使用して、20ミクロンの解像度で画像を取得します。スキャンが完了したら、5%EDTAと4%のスクロースをPBSに溶かし、pH 7.4で上顎骨の脱灰を開始します。
この反応を摂氏4度で2週間放置します。上顎を埋め込んだ後、5ミクロンの厚さのスライスを作ります。パルプキャッピング領域は通常、遠位口蓋根と一致し、ランドマークとして使用できます。
光学顕微鏡で組織型を調べ、その結果をマイクロCTスキャンと比較することにより、関心のある正確な領域を決定します。H&E染色の場合は、パラフィンを除去し、スライドをキシレンの2つの浴でそれぞれ数分間再水和します。次に、それらを一連の段階希釈されたエタノールに通します。
各バスは1分間だけ適用する必要があります。水分補給の後、すすぎます。次に、ヘモトキシリン溶液を2分半塗布します。
すすぎで染料を取り除き、スライドを95%エタノールに1分間入れます。次に、スライドをエオシン溶液で1分間染色し、洗い流します。エタノールから始めて、染色された組織を脱水するための水分補給ステップを逆にします。
次に、キシレンで処理します。その後、スライドをマウントして画像化できます。記載された手順を用いて、8週齢マウスにパルプキャッピングを行った。
6週間後、彼らの上顎骨が収穫され、検査されました。興味深いことに、H&E染色では、歯髄室と根管全体に象牙質が形成されていることが明らかになりました。それに比べて、キャップのない大臼歯は同じ象牙質の形成を示さなかった。
蓋状大臼歯では、象牙質様と骨状の両方の形成の特徴があり、象牙質尿細管と骨細胞の両方が修復象牙質に見られ、損傷した歯髄は、存在する歯芽細胞と移動した骨芽細胞の両方によって石灰化される可能性があることを示唆しています。DMP1免疫組織化学染色の使用により、修復性象牙質を形成する細胞の活性の増加がさらに確認されました。実際の歯科臨床診療と同様に、アシスタントがいることは非常に役立ちます。
例えば、アシスタントを使えば、このテクニックは一度習得すれば、わずか10分で完了することができます。重要なのは、歯髄を露出させるときは、バーではなくエンドファイルを使用することを忘れないでください。また、MTAを渡すときは注意してください。
パラホルムアルデヒドのような固定剤の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。
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概要
この記事では、マウスの歯に直接パルプキャッピングを行うための詳細なプロトコルを提示し、in vivoでのパルプ創傷治癒と修復性デンチンの形成を研究することを目的としています。この方法により、研究者は治癒過程や材料相互作用など、パルプ生物学の主要な側面を調査することができます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 歯科
- 神経科学
- 再生医療
背景
- 直接パルプキャッピングは、パルプの活性を保存することを目的とした歯科処置です。
- この技術は人間とマウスの両方のモデルに適用できます。
- パルプの治癒を理解することで、歯科治療の改善につながる可能性があります。
- この研究は、キャッピング材料に対するパルプの反応に焦点を当てています。
研究の目的
- 直接キャッピング後のパルプの治癒過程を評価すること。
- キャッピング材料に反応して形成される修復性デンチンを評価すること。
- in vivoでパルプ生物学を研究するための信頼できる方法を提供すること。
使用された方法
- 処置のためのマウスの麻酔と位置決め。
- 処置中のマウスを安定させるためのマウスホルダーの使用。
- 露出したパルプにパルプキャッピング材料を適用すること。
- ステレオスコープを使用して第一上顎臼歯の観察。
主な結果
- このプロトコルは、マウスに一貫してパルプキャッピングを適用することを可能にします。
- 歯髄の治癒能力に関する洞察を提供します。
- 修復性デンチンの形成を効果的に監視できます。
- この技術は歯科材料の改善に影響を与える可能性があります。
結論
- この方法は、パルプ生物学を研究するための貴重なツールです。
- 人間と動物の歯科処置の間のギャップを埋めます。
- 将来の研究では、より良い歯科治療結果を得るために材料特性を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic investigation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in a murine model, supporting target validation in regenerative dentistry. By allowing use of transgenic and knockout mice, it facilitates preclinical screening of biocompatible materials and de-risks translational pathways for pulp-protective therapeutics. The model addresses a key gap in dental R&D by providing an in vivo system to evaluate molecular mechanisms underlying dentin regeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular and molecular pathways involved in pulp healing and dentinogenesis.
- Operational Value: Supports functional validation of targets using genetic models to assess causal roles in reparative dentin formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized in vivo assay to evaluate biocompatibility and inductive potential of pulp-capping materials.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of dentin formation via micro-CT and histology for material screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges ex vivo findings to physiological relevance by modeling human pulp-capping outcomes in mice.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of lead materials for pulp vitality preservation and dentin repair.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in regenerative dentistry.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on signaling pathways regulating odontoblast and osteoblast recruitment during pulp repair.
- Screening: Enables standardized evaluation of material-induced reparative dentin formation as a functional readout.
- Analytics: Generates quantitative micro-CT and histological outputs to compare material efficacy and healing kinetics.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation of pulp-capping agents prior to IND-enabling studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative material optimization and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in material performance by capturing complex tissue-level healing responses.
- Operational Value: Delivers a reproducible, standardized procedure for cross-laboratory material comparison.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in pulp-regenerative approaches.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of pulp therapeutics based on in vivo dentin regeneration evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dental procedures, anesthesia, and microsurgical techniques.
- Dependent on access to high-speed handpieces, stereoscopes, micro-CT, and histological processing equipment.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent pulp exposure and material placement.
- Adaptation considerations include variations in mouse strain, age, and pulp-capping material viscosity.
- Practical limitations include technical difficulty due to small murine tooth size and potential variability in healing responses.
