詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

この実験手順の全体的な目標は、固定組織サンプリングを使用して、脊椎動物のセグメンテーションクロックの時空間遺伝子発現ダイナミクスをマッピングすることです。この方法は、前体節中胚葉の振動遺伝子動態を偏りなく評価することを可能にし、これは脊椎動物の体性形成を支配する分子メカニズムを理解するために重要です。この技術の主な利点は、多くのサンプルを同時に生成および処理できるため、固定組織における遺伝子発現ダイナミクスの高度な3部構成の解析が可能になることです。

その手順を実演するのは、私の研究室の元ポスドクであるシャーロット・ベイリー博士です。テキストプロトコルに従ってマウス子宮角を取得した後、実体顕微鏡下で、湾曲したはさみを使用して子宮角の厚い筋肉膜を切断し、各胚を慎重に抽出しました。湾曲したハサミと細い鉗子を使用して、各胚から羊膜嚢を解剖します。

次に、手術針または湾曲したハサミを使用して、胚を後肢の芽の前方に切断することにより、各胚から尾組織を採取します。尾組織の腹側を下にしてバランスを取ります。次に、針で穏やかな揺れ運動を使用して、尾組織を正中線に沿って2つに切開することにより、PSM外植片のペアを生成します。

神経管、脊索、およびPSM組織が2つの外植片間で均等に分割されていることを確認してください。次に、各反対側のPSM外植片を、予め温めた少量の培地で35mmのプラスチック製培養皿蓋の下側にピペットで移します。皿を蓋の上部に置き、すばやく反転させて、PSM組織が蓋から吊り下げられた媒体の滴に吊り下げられるようにします。

次に、PSM外植片を摂氏37度の加湿チャンバーで1〜2時間培養します。PSM外植片のペアを24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに移します。次に、PBS中の4%パラホルムアルデヒドをサンプルに加え、プレートを室温で1時間、またはロッキングプラットフォーム上で摂氏4度で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、PBSを使用して、ロッキングプラットフォーム上でサンプルウェルを室温で洗浄します。細かいプラスチック製パスツールピペットを使用して、サンプルのPBS溶液を3〜4回交換します。免疫組織化学を行うには、各胚ペアのPSM外植片1つにPBS中の2%Triton X-100を添加し、サンプルをロッキングプラットフォームで室温で1時間インキュベートして洗浄します。

PBSを使用して、サンプルを短時間すすぎます。次に、PBSをブロッキング溶液に交換し、サンプルを摂氏4度でロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートします。ワーキングバッファーを使用して、目的の一次抗体を希釈します。

この例では、Delta-like 1およびNotch1に対する抗体を1:25の希釈で使用します。抗体を外植片に加え、摂氏4度のロッキングプラットフォーム上でサンプルを3〜5日間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを使用してサンプルを2回、それぞれ5〜10分間洗浄します。

次に、0.3%Triton X-100をPBS溶液の0.3%Triton X-100を室温でロッキングプラットフォームで3回洗浄します。ワーキングバッファーで二次抗体を希釈した後、抗体凝集体を含む可能性のある最後の数マイクロリットルの溶液を使用しないように注意しながら、各サンプルウェルに250〜500マイクロリットルの抗体溶液を追加します。錫箔でプレートを覆い、4°Cの暗所でサンプルを二次抗体溶液中で3〜5日間インキュベートします。

インキュベーション後、PBSTを使用してサンプルを2回、それぞれ10分間洗浄します。次に、PBSを使用して、ティッシュを室温で1回、ロッキングプラットフォームで5分間洗浄します。テキストプロトコルに従って、エタノールPBST希釈シリーズを通じて、残りの反対側のPSM外植片を脱水および再水和します。

0.1%PBST中のプロテイナーゼK1ミリリットルあたり10マイクログラムを外植片に加え、組織を5分間攪拌せずにインキュベートします。次に、プロテイナーゼK溶液を迅速に取り出し、PBSTを使用してサンプルを短時間すすぎます。PBST中の4%ホルムアルデヒドと0.1%グルタルアルデヒドをPSM外植片に加えてポストフィックスし、サンプルを30分間インキュベートします。

次に、PBSTを使用してサンプルを2回、各10分間洗浄した後、50%ハイブリダイゼーションミックスを組織に加え、攪拌せずに摂氏65度で10分間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってサンプルとハイブリダイゼーションミックスをインキュベートした後、溶液を取り出し、既知のセグメンテーションクロック成分に対してジゴキシゲニン標識アンチセンスRNAプローブを含む0.25〜0.5ミリリットルの予め温めたハイブリダイゼーションミックスを加えます。粘着テープを使用してプレートを密封し、サンプルを摂氏65度で2晩インキュベートします。

インキュベーション後、TBSTで予め加温した50%ハイブリダイゼーションミックスを使用して、サンプルを15分間洗浄します。次に、TBSTを使用してサンプルを2回すすぎ、TBSTで組織を室温のロッキングプラットフォームで30分間インキュベートします。次に、外植片をブロッキング溶液で最低2時間事前にインキュベートします。

次に、溶液を、1:200に希釈したHRB標識抗ジゴキシゲニン抗体を含む新しいブロッキング溶液と交換します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、TBSTを使用してサンプルを室温で3回すすぎ、新しい24ウェル組織培養プレートの個々のウェルに移します。

次に、TBSTを使用して、外植片を3回、それぞれ1時間ずつ洗浄します。チラミドシグナル増幅キットを使用して、イメージング用のサンプルを調製する前に、検出されたmRNAを可視化します。厚さ0.12mmのイメージングスペーサーから接着ライナーを取り外し、スライドガラスに貼り付けて、各外植片ペアに1つの帯電接着スライドを準備します。

テキストプロトコルに従ってスライド上にペアまたは外植片を配置した後、組織が完全に乾燥することなく粘着性で半透明に見え始めるまで、サンプルをスライドに45〜60秒間接着させます。その間に、鉗子を使用してスペーサーから残りの接着ライナーを取り外し、スペーサーの中央にあるサンプルにデュアルファンクション封入剤と清澄溶液を大量に追加します。サンプル全体に円形のカバースリップを貼り、封入剤が均等に分散し、すべてのエッジがスペーサーに接触するようにします。

次に、カバースリップを逆さまにして、糸くずの出ない紙の上に置きます。カバーガラスがスペーサーに完全に密着し、余分な封入剤が取り除かれていることを確認するために、しっかりと押し下げてください。封入剤が紙を滲ませなくなるまで、このプロセスを繰り返します。

スライドを清掃してラベルを付け、イメージングするまで暗闇に保管します。次に、テキストプロトコルに従ってイメージングと分析を実行します。この実験では、Delta-Like 1およびNotch1タンパク質の発現は、各外植片ペアの半分で検出されるNotch調節セグメント化クロック遺伝子イントロン狂人フリンジの新生転写に従って胚を一時的に配置することにより、同期性なく振動することが示されています。

パネルは、セグメンテーション クロック サイクルのフェーズ 1、2、および 3 に従って配置されます。PSMの前後軸に沿ったDelta-Like 1、Notch1、およびintronic lunatic fringeの発現ドメインの範囲は、色分けされたバーで区切られています。ここに示すように、PSM の前後軸に対する Delta-Like 1、Notch1、および intronic lunatic fringe 信号強度を定量化するためのプロットが生成され、クロック サイクル全体にわたる PSM の軸方向の変動と信号強度が示されています。

キモグラフは、多数のPSMにわたるDelta-Like 1、Notch1、およびイントロンルナティックフリンジの空間分布を視覚化します。キモグラフの各行は、個々のPSM外植片の信号強度を表します。PSMの前後軸に対するDelta-Like 1、Notch1、およびイントロンルナティックフリンジ信号強度の定量化により、これらのターゲットの明確な振動発現ダイナミクスが明らかになります。

最後に、これらのキモグラフは、多数のPSMにわたるNotch受容体NICDの切断および活性化型、Delta-Like 1、intronic lunatic fringe、およびNotch1の空間分布を示しています。この技術は、脊椎動物の有糸分裂学の分野の研究者が、ニワトリとマウスの体節前中胚葉におけるセグメンテーション遺伝子の振動ダイナミクスをよりよく理解するのに役立ちました。この手法を習得すると、多数のサンプルに対して実行でき、目的の複数のmRNAおよびタンパク質の発現プロファイルを同時に分析できます。

この手順に続いて、画像データをさらに定量化することで、遺伝子発現の時間的遅延や、研究者が関心のあるRNAシグナルとタンパク質シグナルの両方の細胞内局在を理解できます。このビデオを見れば、厚膜組織サンプリングを使用して脊椎動物のセグメンテーションクロックの時空間遺伝子発現ダイナミクスをマッピングする方法を十分に理解できるはずです。これに続いて、テキストプロトコルで詳しく説明されているように、自動画像分析を行うことができます。

この手順を試みる際には、PSM外植片間でPSM、脊索、神経管が均等に分布していることを確認し、開始前に抗体の希釈を慎重に最適化することが重要です。ホルムアミド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。個人用保護具を着用し、該当する場合はドラフトで作業するように注意してください。