詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

この実験手順の全体的な目的は、固定組織サンプリングを用いて、脊椎動物の分節時計における時空間的な遺伝子発現動態をマッピングすることです。この手法により、前体節中胚葉における振動性の遺伝子動態を偏りなく評価することが可能となり、これは脊椎動物の体節形成を制御する分子メカニズムを理解する上で極めて重要です。この技術の主な利点は、多くのサンプルを同時に作成および処理できるため、固定組織における遺伝子発現動態の高精度な3部構成分析が可能になることです。

実演を行うのは、私の研究室の元ポストドクターであるCharlotte Bailey博士です。テキストのプロトコルに従ってマウスの子宮角を回収した後、実体顕微鏡下で曲剪を用いて子宮角の厚い筋膜を切断し、各胚を慎重に取り出します。曲剪と微細鑷子を用いて、各胚から羊膜を剥離します。

次に、外科用針または曲剪（カーブシザー）を用いて、胚の後肢芽の前方で切断し、各胚から尾部組織を採取します。尾部組織を腹側を下にして静置します。その後、針を用いて緩やかな揺り動作を加えながら、尾部組織を正中線に沿って2等分に解剖し、PSM外植体（エクスプラント）のペアを作成します。

神経管、脊索、およびPSM組織が2つの外植片に均等に分割されていることを確認します。次に、それぞれの対側PSM外植片を、少量の予熱済み培養液とともに、35mmプラスチック培養皿の蓋の裏側にピペットで滴下します。皿を蓋の上に置き、速やかに反転させることで、PSM組織が培養液の吊り滴（ハンギングドロップ）状態で蓋から吊り下げられるようにします。

次に、PSM外植片を加湿チャンバー内で37 °Cで1〜2時間培養します。PSM外植片のペアを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに転移します。その後、サンプルにPBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを加え、プレートを室温で1時間、またはロッキングプラットフォームを用いて4 °Cで一晩インキュベートします。

インキュベーション後、ロッキングプラットフォーム上で室温にてPBSを用いてサンプルウェルを洗浄します。細いプラスチック製パステールピペットを使用して、サンプルのPBS溶液を3～4回交換します。免疫組織化学染色を行うには、各胚ペアから1つのPSM外植片にPBSで調製した2% Triton X-100を加え、ロッキングプラットフォーム上で室温にて1時間インキュベートして洗浄します。

PBSを用いてサンプルを軽くすすぎます。次に、PBSをブロッキング溶液に置換し、サンプルをロッキングプラットフォーム上で4°Cで一晩インキュベートします。ワーキングバッファーを用いて、目的の一次抗体を希釈します。

この例では、Delta-like 1およびNotch1に対する抗体を1:25の希釈倍率で使用します。抗体を外植片に加え、サンプルをロッキングプラットフォーム上で4°Cで3〜5日間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを用いてサンプルを5〜10分間ずつ2回洗浄します。

次に、室温でロッキングプラットフォームを用い、0.3% Triton X-100含有PBSで3回洗浄します。二次抗体をワーキングバッファーで希釈した後、各サンプルウェルに250-500 µLの抗体溶液を添加します。この際、抗体凝集塊が含まれている可能性がある溶液の最後数µLは使用しないように注意してください。プレートをアルミホイルで覆い、二次抗体溶液中で4 °C、暗所で3〜5日間インキュベートします。

インキュベーション後、PBSTを使用してサンプルを10分間ずつ2回洗浄します。その後、PBSを用いて、室温のロッキングプラットフォーム上で組織を5分間1回洗浄します。テキストプロトコルに従い、残りの対側PSM外植片をエタノールPBST希釈系列を用いて脱水および再水和させます。

0.1% PBSTで調製した10 µg/mLのProteinase Kを外植片に加え、組織を静置した状態で5分間インキュベートします。その後、Proteinase K溶液を速やかに除去し、PBSTを用いてサンプルを短時間洗浄します。PSM外植片にPBSTで調製した4%ホルムアルデヒドおよび0.1%グルタルアルデヒドを加え、後固定を行い、サンプルを30分間インキュベートします。

次に、PBSTを用いてサンプルを10分間ずつ2回洗浄し、組織に50%ハイブリダイゼーションミックスを加え、65°Cで振盪せずに10分間インキュベートします。テキストのプロトコルに従ってサンプルとハイブリダイゼーションミックスをインキュベートした後、溶液を除去し、既知のセグメンテーションクロック構成要素に対するジゴキシゲニン標識アンチセンスRNAプローブを含む、あらかじめ温めておいたハイブリダイゼーションミックスを0.25〜0.5 mL加えます。プレートを粘着テープで密封し、サンプルを65°Cで2晩インキュベートします。

インキュベーション後、TBSTで調製しあらかじめ加温した50%ハイブリダイゼーションミックスを用いて、サンプルを15分間洗浄します。次に、TBSTでサンプルを2回すすぎ、組織をTBST中で室温のロッキングプラットフォーム上で30分間インキュベートします。続いて、外植体をブロッキング溶液中で最低2時間プレインキュベートします。

次に、HRB標識抗ジゴキシゲニン抗体を1:200に希釈して含む新鮮なブロッキング液に置換します。サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、室温でTBSTを用いてサンプルを3回洗浄し、新しい24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移します。

次に、TBSTを用いて、外植体を1時間ずつ3回洗浄します。イメージング前のサンプル調製として、タイラミド信号増幅キットを使用して検出したmRNAを可視化します。0.12 mm厚のイメージングスペーサーから粘着ライナーを剥がしてガラススライドに貼り付け、外植体のペアごとに1枚の帯電付着ガラススライドを用意します。

テキストプロトコルに従ってスライド上に一対の外植片を配置した後、組織が完全に乾燥せずに粘着性が出て半透明に見え始めるまで、45〜60秒間、試料をスライドに密着させます。その間に、ピンセットを用いてスペーサーから残りの粘着ライナーを取り除き、スペーサー中央の試料に、封入剤と透明化溶液のデュアル機能を持つ溶液を大きく一滴加えます。円形のカバーガラスを試料の上に載せ、封入剤が均等に広がり、すべての端がスペーサーに接触していることを確認してください。

次に、カバーガラスを載せたスライドを、低糸くずのペーパーの上に逆さまに置きます。カバーガラスがスペーサーに完全に密着し、余分な封入剤が取り除かれるように、しっかりと押し付けます。ペーパーに封入剤が染み出さなくなるまで、この操作を繰り返します。

スライドを洗浄してラベルを貼り、イメージングまで暗所に保存します。その後、テキストプロトコルに従ってイメージングと解析を行います。本実験では、各外植片ペアの片側で検出された、Notch調節下の分節時計遺伝子であるintronic lunatic fringeの新生転写に基づいて胚を一時的に配列させることで、Delta-Like 1およびNotch1タンパク質の発現が非同期に振動することが示されます。

パネルは、セグメンテーションクロックサイクルのフェーズ1、2、および3に従って配置されています。PSMの前後軸に沿ったDelta-Like 1、Notch1、およびintronic lunatic fringeの発現ドメインの範囲が、色分けされたバーで示されています。ここに示されているように、PSMの前後軸に関連したDelta-Like 1、Notch1、およびintronic lunatic fringeの信号強度を定量化したプロットが作成されており、クロックサイクルを通じてPSM全体における軸方向の変動と信号強度が例示されています。

カイモグラフにより、多数のPSMにおけるDelta-Like 1、Notch1、およびintronic lunatic fringeの空間分布が可視化されます。カイモグラフの各行は、個々のPSM外植片の信号強度を表しています。PSMの前後軸に関連したDelta-Like 1、Notch1、およびintronic lunatic fringeの信号強度の定量化により、これらのターゲットにおける明確な振動発現ダイナミクスが明らかになります。

最後に、これらのカイモグラフは、多数のPSMにおける、切断および活性化されたNotch受容体NICD、Delta-Like 1、intronic lunatic fringe、およびNotch1の空間分布を示しています。この手法は、脊椎動物の有糸分裂の研究者が、ニワトリおよびマウスの前体節中胚葉における分節化遺伝子の振動ダイナミクスをより深く理解することに寄与してきました。この手法を習得すれば、多数のサンプルに対して実施することが可能になり、関心のある複数のmRNAおよびタンパク質の発現プロファイルを同時に解析できます。

この手順に続き、画像データをさらに定量化することで、遺伝子発現の時間的な遅れや、研究者が目的とするRNAおよびタンパク質シグナルの細胞内局在を理解することができます。このビデオを視聴することで、厚い組織サンプリングを用いて、脊椎動物の分節時計における時空間的な遺伝子発現ダイナミクスをマッピングする方法を十分に理解できるはずです。その後は、テキストプロトコルに詳述されている自動画像解析を行うことができます。

この手順を行う際は、PSM外植片の間でPSM、脊索、および神経管が均等に分配されるようにし、開始前に抗体希釈を慎重に最適化することが重要です。ホルムアミド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドの取り扱いは極めて危険であることに留意してください。適切な個人用保護具を着用し、必要に応じてドラフトチャンバー内で作業してください。