シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量

次の実験の全体的な目標は、マイトジェン活性化タンパク質の発現を単一細胞レベルで定量化することです。これを達成するために、蛍光発現レポーター4倍VenusをSTL one promoterによって制御され、かつhog one map kinaseの活性化に特異的な酵母株を作製した。蛍光タンパク質の発現は、細胞を顕微鏡上で直接ストレスして蛍光のリアルタイム出現を容易にする生細胞顕微鏡アッセイ、または細胞をマイクロチューブ内でストレスを与え、タンパク質合成を所定の時間にブロックするフローサイトメトリーのいずれかによって定量化できます。

サイクロハイデを追加することで、生細胞顕微鏡で一度に数個の細胞しか分析できませんが、個々の細胞の運命を直接観察し、他の細胞特性フローサイトメトリーと相関させることができる一方で、一度に多数の細胞でマイトジェン活性化タンパク質の発現を評価することもできます。この方法は、どのタンパク質が遺伝子発現の調節に関与しているかなど、シグナル伝達分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は酵母経路に関する洞察を得ることができますが、適切な発現の利用可能性に応じて、他のシグナル伝達カスケードにも適用できます。記者。

生細胞顕微鏡検査用の細胞を調製するには、まず5ミリリットルの合成培地に酵母を接種し、次に細胞を摂氏30度で一晩増殖させます。翌朝、一晩培養したOD 600を測定し、次に5ミリリットルの合成培地で一晩培養したものを0.05のOD600に希釈します。希釈した培養物を摂氏30度で少なくともさらに4時間増殖させます。

次に、約200マイクロリットルの新たに調製した原子価溶液をウェルスライドにろ過します。30分後、溶液を取り除き、150マイクロリットルの水を井戸に加えます。次に、水を取り除き、セルが準備されている間、井戸を乾かします。

細胞培養のOD600を再度測定し、次に細胞を希釈して、OD600が0.02で300マイクロリットルの細胞培養と1.5ミリリットルのマイクロチューブが得られます。細胞を水浴中で45秒間超音波処理します。マイクロチューブを短時間ボルテックスし、次に細胞を再び超音波処理してボルテックスします。

次に、200マイクロリットルの細胞をウェルスライドに加え、細胞をウェルの底に約30分間沈殿させた後、スライドを顕微鏡に置きます。次に、記録する蛍光チャネルと2つの明視野画像の照明設定を選択し、焦点面から約3ミクロン下の明視野設定の1つを調整して、適切な細胞セグメンテーションを可能にします。次に、タイムラプス測定の時間間隔を設定し、イメージングの視野を選択します。

次に、数フレームのアクイジションを開始し、その後、アクイジションを一時停止して、新たに調製した0.6モル塩化ナトリウム培地を100マイクロリットル追加し、イメージングを再開して、フローサイトメトリーによる測定のために細胞を調製します。まず、5ミリリットルの合成培地に酵母を接種し、細胞を摂氏30度で一晩成長させます。翌朝、一晩培養したOD 600を測定し、次いで細胞懸濁液を5ミリリットルの合成培地で0.1のOD600に希釈する。

摂氏30度で少なくとも4時間培養して、0.2〜0.4のOD600に到達します。次に、100マイクロリットルの新しく調製した0.6モル塩化ナトリウムを1.5ミリリットルのマイクロチューブに追加して、タイムゼロで測定する各タイムポイントに設定します。各マイクロチューブに200マイクロリットルの細胞を加え、30°Cで振とうしながら培養物をインキュベートします。

次に、各実験時点で、新たに調製した30マイクロリットルのシクロハイデをマイクロチューブの1つに追加します。マイクロチューブのインキュベーション中に、各マイクロチューブに対応する1つのファックスチューブに400マイクロリットルのPBSを追加します。インキュベーション後、マイクロチューブを短時間ボルテックスし、次に細胞を超音波処理し、示したように1分間水浴を加えます。

次に、サイトメーターの流れで、各マイクロチューブから100マイクロリットルの細胞培養物を対応するファックスチューブに加えます。適切な励起および検出設定をロードし、非発現サンプルと完全発現サンプルをテストして、検出器の感度範囲内に収まることを確認します。最後に、これらの画像の各サンプルについて10, 000個の細胞を測定し、TL 1つのプロモーターの制御下で発現レポーター四重静脈タンパク質を担い、ウェルスライドの底に付着した酵母細胞をストレス培地の直接版によって刺激した。

先ほど示したように、細胞を10分間隔で約2時間モニターし、刺激の前後の両方で画像を取得しました。なお、活性化細胞中のレポートの蛍光発現。これらの画像に含まれる定量的な情報を抽出するには、ここで複雑な画像解析プロセスを実行する必要があります。

酵母定量分析プラットフォームで得られた結果を示します。各赤色のトレースは、単一細胞の平均蛍光強度の時間的変化を表しています。青い線は、同じ井戸から5つの異なる視野から取得した5つのタイムラプス動画の20フレーム全体でセグメント化および追跡された500を超える細胞の中央値を示しており、水色の領域は、フローサイトメトリーによって同じレポーターの発現のダイナミクスを研究するために所与の時点で測定されたすべての強度の25番目および75番目のパーセンタイルを表し、シクロヘキシミドを酵母に添加した5〜10分間隔で異なる時点で細胞培養を行います。

この薬剤は新しいタンパク質の合成を阻害しますが、すでに発現している蛍光タンパク質の成熟は乱されません。したがって、ヒストグラムの右への変位によって視覚化されたタンパク質発現は、蛍光タンパク質の成熟に関連する問題を回避するCycl H版の時点で定量化できます。このグラフでは、顕微鏡法またはフローサイトメトリーで測定した発現レポーターのダイナミクスを比較し、顕微鏡で測定したストレス培地の分化後30〜40分で蛍光シグナルが上昇し、フローサイトメトリーの測定では、刺激後10〜15分ですでにタンパク質が産生されていることが明確に示されており、蛍光タンパク質の成熟が遅いことを示しています。

どちらの手法も、これらの単純な実験でシングルセル情報へのアクセスを可能にし、3つの生物学的複製間の変動性は、顕微鏡法またはフローサイトメトリーによるシングルセル応答で観察される大きな変動と比較して小さいです。これらの手順に続いて、遺伝子発現の閾値は何かなどの追加の質問に答えるために、これらの応答測定のような他の方法を実行することができます。このビデオを見れば、フローサイトメトリーの顕微鏡で単一細胞レベルでタンパク質発現を測定する方法について十分に理解できるはずです。