マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目標は、光学顕微鏡法と電子顕微鏡法を組み合わせて実行することにより、石灰化イベントの位置と構造を決定することです。これは、細胞内のpHおよびカルシウムシグナルに敏感な蛍光インジケーターを使用して検出できる石灰化の原因となるライフステージである変態中の生きた幼虫のチューブワームを監視することによって達成されます。細胞内pHイメージングにより、石灰化の過程で細胞質に出入りするプロトンの濃度を調べることができます。

まず、マリンチューブワームの幼虫の細胞内pHイメージングを行い、有能な遊泳幼生を細胞内pH指示色素SNARF-1 AMで染色します。次に、幼虫を薄いガラス観察窓を備えた海水を含むIBMXの皿に移し、蛍光顕微鏡に置き、波長488ナノメートルの光を当てて色素に吸収します。染料からの580ナノメートルと640ナノメートルの放出が収集されます。細胞内pHの値は、これらの値の比率から計算できます。

光学顕微鏡法により、より高いpHレベルに関連する時間と組織領域を特定することができます。これは、詳細な分析のために関心のある時点を決定するための最初のステップです。2番目のステップでは、電子顕微鏡検査の適切な時点でチューブワームを固定剤で保存します。

新たに鉱化のライフステージは、カルシウムシグナルのSEM-EDSマッピングを使用して特定されます。次に、カルシウムシグナルが高い領域をSEM/EBSDを使用してスクリーニングし、結晶性鉱物の存在を特定します。最後に、集束イオンビームを用いて鉱物を切り出し、TEM観察用の薄切片を作製します。

このセクションは、選択的な領域回折パターンを取得するために使用されます。この技術またはバルクX線回折分光法のような従来の試験方法の主な利点は、光学顕微鏡法および電子顕微鏡法によって観察された特定の構造を直接観察できることであり、したがって、離散的な石灰化イベントを時間レベルと空間レベルの両方で直接研究することができます。カルシウムおよび細胞内pHインジケーターを用いて石灰化を研究すると、これらの関連する生理学的事象の時間スケールを特定できます。

適切なタイミングで試料を保存することは、実りあるSEM分析にとって重要です。生物学的石灰化の最初のイベントを探す場合、SEM/EDXを使用してカルシウムの元素分布をスクリーニングできます。カルシウムが多い場所は炭酸カルシウムの存在を示している可能性がありますが、X線回折パターンの存在のみが結晶構造があることを確認できます。

このような情報は、EBSDおよびTEMを使用して取得できます。電子後方散乱回折は、微細構造と電子REM角度がブラッグ回折条件を満たす限り、結晶性または多結晶性材料を特定するための結晶学的特性評価手法です。通常、反射電子は、結晶粒または結晶方位マップを使用して、研磨された試料上に70度の角度で収集されます。

研磨されていないサンプルの場合、これらの凹凸のある表面からこのようなマップを生成することは困難です。これは、すべてのサービスシリーズがEBSD角度の要件を満たすわけではないためです。しかし、点IGの形では、EBSDの角度要件が満たされている限り、これらの凹凸のある表面からCacucci回折パターンを収集することができます。カクッチ回折パターンは、結晶性鉱物が存在することを明確に確認します。

私たちの方法は直接的かつ迅速であり、他の石灰化組織に示唆することができます。ここでは、集束イオンビームを使用してマイクロサンプルを作製しますが、これもTEM切片を調製する非常に直接的な方法でもあります。変態過程を調べるために、チューブワームを実験室で約5日間培養しました。

有能な幼虫は、円を描くように泳ぐのではなく、前方に泳ぎます。これは、彼らが変態の準備ができていることを意味します。海水中の蛍光溶液で有能な幼虫をインキュベートし、光退色を防ぐために容器をホイルで覆い、動物を一晩インキュベートします。

チューブワームの幼虫は、幼虫を保持しますが、溶液が通過することを可能にするナイロンメッシュに対して洗浄されます。幼虫をろ過した海水で2回洗い、余分な染料溶液を取り除きます。ストレーナーをペトリ皿に押し付けてしっかりとシールしてから、シールを離して洗浄液を廃棄します。

幼虫を乾燥させないように注意してください。次に、10〜20匹の幼虫をそれぞれIBMXを使用した薄いガラス底の皿に入れ、イメージングするまで皿を覆います。次に、蛍光シグナルを検出するために、適切なダイクロイックミラーを備えた適切なフィルターキューブを挿入します。

シャッター時間を最適化して、生物の画像をキャプチャするのに十分な速さにします。次に、Z-Stackオプションで光学セクショニングパラメータを選択し、顕微鏡ステージを上下に動かして、画像取得の開始位置と停止位置を定義します。レイヤー間の距離を 1 マイクロメートルに設定します。

イメージング後、すべてのデータをグレースケールTIFファイルとしてエクスポートします。これは、[ファイル]、[エクスポート] の順に選択して実行できます。ファイルの種類がTIF画像として表示されていることを確認し、[開始]をクリックします。

Z-Stackの各レイヤーの各チャネルのグレースケール画像は、画像分析の準備ができている同じ画像フォルダにあります。最後に、ImageJを使用して、各蛍光チャネルの合成画像を生成します。次のJoVEビデオでは、細胞内pHのキャリブレーションと測定を行う方法を示しています。

海水中の4%パラホルムアルデヒド溶液を使用して、架橋固定剤を使用して変態中のチューブワームを保存します。16%パラホルムアルデヒドの一部を海水の3つの部分に混ぜて、一晩固定するだけです。一次固定液を廃棄し、標本を1%四酸化オスミウムの水溶液に30分間再固定して、組織構造をさらに安定させます。

必ずドラフトで作業し、明確にラベルが貼られた別々の廃液ボトルを用意し、ホルムアルデヒドと四酸化オスミウムを準備してください。次に、等級付けされたエタノールシリーズを使用してサンプルを脱水し、交換の間隔を5分空けます。次のステップは、エタノールとHMDSの1:1溶液でサンプルを脱水することです。

標本がヒュームフード内で蒸発して乾くのを待ってから、純粋なHMDSで手順を繰り返します。サンプルの制御された骨折を作成するには、ダイヤモンドブレードを皿に当てて実行し、三角形のカットを行うために数人の個人を囲みます。ペトリ皿を覆った状態で、培養皿をアルミニウムのスタブに当て、静かに押して制御された骨折を作ります。

解剖顕微鏡を使用して観察し、無傷のチューブワームがいくつか含まれている骨折片を慎重に拾い上げます。銀色の塗料を使用して、サンプルをSEMサンプルホルダーに貼り付け、銀色の塗料で端を塗装して充電を減らします。これで、サンプルをSEM-EDS分析用にイメージングする準備が整いました。

ホルダー内のサンプルを顕微鏡に挿入します。サンプルの向きを変え、サンプルを電子柱の下に置きます。VP SEMモードでサンプルを分析します。

必要に応じて、ピントと乱視を最適化します。1 つの生物が視野全体に収まるように倍率を選択します。全視野のマップを取得してサンプル上のカルシウムの元素分布を分析し、マップを15分以上、またはデータが生物内のカルシウムの明確な局在を示すまで実行します。

関心領域のポイント定量化を取得するには、Single Point ツールを使用して Point ID オプションを選択します。スキャンを実行するために、関心のある領域をクリックします。倍率を下げて一連の画像をキャプチャすることにより、場所を注意深く記録します。

EBSD用のサンプルを準備するには、フラットSEMホルダーからサンプルを取り出し、銀色の塗料を使用して45度に傾けたスタブに貼り付けます。参照SEM画像を使用して、調査対象の動物と動物の正確な領域を特定します。ステージを25度傾けて、サンプル表面が電子ビームに対して約70度になるようにします。

ステージを上げます。AZtecソフトウェアでEBSDモードを選択します。関心のあるフェーズとしてアラゴナイトを選択します。

EBSDカメラを挿入し、約90%の信号が得られるようにカメラ条件を設定します高速ビームラスターを使用して背景を取得し、Aztecで画像をキャプチャします。スポット解析ツールを使用して、より高いカルシウムシグナルを示したサンプルの位置をクリックします。スキャンして、Cacucciパターンが検出されるかどうかを確認します。

パターンが存在し、データベース内の選択したフェーズのいずれかと一致する場合、それらのパターンは自動的にインデックス化されます。集束イオンビームを使用した微量試料の調製に進む前に、調製したSEM試料をスパッタコーティングで白金の層で保護します。サンプルをFIB SEMチャンバーに挿入し、サンプルを配置して、イオン誘起の二次電子像をライブで取得します。

EBSD の EDS マッピングによって以前に決定された参照画像から関心領域を特定します。必要に応じてステージを回転させて、関心のある特徴をウィンドウのフレームに合わせ、倍率を調整して関心のある特徴に対応する領域を表示し、カーボンとタングステンを堆積させるボックスを定義します。FIBスナップショットをキャプチャし、タングステンキャップの周りに4つのボックスのパターンを描画して、マイクロサンプリングの位置を定義します。

次に、ステージを58度傾け、マイクロサンプルの底を切り取ります。ステージをゼロに戻し、タングステンマイクロサンプリングプローブを挿入し、サンプルに接触するまで下げます。プローブの先端とタングステンコーティングの間にタングステンを堆積させてタングステンプローブとサンプルを接続し、最終カットを行い、島の残りの部分からマイクロサンプルを取り外し、マイクロサンプルを取り付けたプローブを持ち上げます。

TEM銅ハーフグリッドをサイドエントリーホルダーに置き、マイクロサンプルがTEMグリッドに接触するまでタングステンプローブを下げます。マイクロサンプルは、電子透明になるまでさらに粉砕されます。TEM 分析の前に、両方のデュワーに液体窒素を充填し、加速電圧を 300 キロボルトに設定します。

ラメラが取り付けられたハーフグリッドを標準のTEMホルダーに配置します。蛍光体スクリーンの中央にビームを配置し、ビームを収縮および拡大し、すべてのビームの動きが同心円になるようにします。ステージ移動ノブを使用して、サンプルをナビゲートして位置を特定し、サンプルの倍率を上げ、サンプルに焦点が合うまでZハイトを調整します。

必要に応じて光学接眼レンズを使用してください。カメラを挿入し、蛍光体スクリーンを取り外します。カメラが飽和しすぎないように、必要に応じてビームを拡大します。

フォーカスとカメラパラメータを調整して、画像をキャプチャします。回折パターンを取得するには、対象の特徴を中央に配置し、対物アパーチャを取り外して回折アパーチャを挿入します。回折レンズモードに変更します。

回折パターンの中心がカメラや蛍光体スクリーンを焼くのを防ぐために、ブランカーを挿入します。結晶学的分析のためにパターンの画像をキャプチャします。以下は、チューブワームの変態中の石灰化プロセスのいくつかの観察です。

チューブワームのpH値は、IBMXによる変態刺激後に上昇し、細胞内pHは31時間で8を超えて上昇し始めました。石灰化に関連する組織は襟の領域です。SEM-EDS信号のマップは、1日目のチューブワームのカルシウムの分布が均一であり、石灰化プロセスがまだ始まっていないことを示しています。

変態刺激の2日後、一部のチューブワームはすでに石灰化しすぎており、新たに石灰化した物質を観察するのには適しなくなりました。この例で使用されているようなチューブワームの標本では、石灰化はまだ初期段階にあるため、カルシウムの定量化は、鉱物の存在を特徴付けるための対象位置を決定するのに役立ちました。SEM-EBSDを用いて調べたところ、カルシウムシグナルが強い局在領域もアラゴナイトの結晶構造を有していました。

集束イオンビームを使用して、試料をTEM用に調製し、アラゴナイト鉱物からの回折パターンをより詳細に結晶学的に分析しました。このビデオを見た後、多細胞生物の石灰化イベントを見つける方法をよく理解しているはずです。光学顕微鏡と電子顕微鏡を併用すると、石灰化のプロセスについて生理学的および物質的な理解を非常に得ることができます。