Name: 強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 学ぶ 強膜経由網膜下注射法でラット眼にヒト網膜色素上皮細胞を移植する技術。網膜損傷リスクを最小限に抑え、自己閉鎖性の安全で再現性のある細胞投与プロトコルを確立する方法です。

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我々 は RPE 細胞の準備のため手術とスーザン ボーデンに彼女の援助のためのパテ レダーマンを感謝したいです。我々 はまた、このプロジェクトのための資金の NYSTEM C028504 を認めます。ジャスティン D. ミラーは NIH によってサポートされて F32EY025931 を付与します。

動物を含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、アルバニーのニューヨークの州立大学、によって承認されています。
1. 事前注入準備
<ol><li>
HRPESC RPE の細胞懸濁液の調製 注: 滅菌のティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行し、基本的な生殖不能の技術と知識が必要です。<ol>
<li>主な hRPE 細胞を分離および 24 ウェル プレート12に培養細胞を 50 から 90 年間人間のドナーから目が高齢者します。通路 1 細胞を凍結、融解必要に応じて文化通路 2 (P2) 細胞の注入の 4-5 週間 (図 1 a) の。</li>
		<li>培地12を外し、軽く 500 μ L で 2 回リンス井戸で加温ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水カルシウム & マグネシウムなし X 1 (1 DPBS CMF x) 1 を追加することによって X DPBS-CMF 井戸 1,000 μ L ピペットを使用し、真空を使用してそれを削除することに。</li>
		<li>各ウェルに 300 μ L トリプシン/DNAse を追加します。トリプシン/dn (0.25% トリプシン-EDTA の 1 mL あたり 4 区 DNase) セルを分離する 37 ° C で 4 分で hRPESC 網膜色素上皮細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>彼らを切り上げているかどうかを顕微鏡下で細胞を確認します。まだ切り上げ彼らない場合さらに 2 分間トリプシン/DNase のセルをインキュベートし続けます。</li>
		<li>セルが切り上げられます、一度カップ刻んだ井戸から剥離細胞とトリプシン/DNase を不活化する、予め温めておいた培の等量と 15 mL の円錐管に剥離細胞を含むトリプシン/DNase を転送する 1,000 μ L ピペットを使用します。</li>
		<li>予め温めておいた 1 と井戸をリンス優しく特に; 井戸の縁の周りを上下、ピペッティングにより X DPBS CMF以前の円錐管にこれらの細胞を追加します。</li>
		<li>細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 286 x g で円錐形の管を遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去し、培地 1 mL の細胞を再懸濁します。</li>
		<li>診断を使用してセルをカウントします。</li>
		<li>細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 286 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>上澄みを除去し、細胞に滅菌バランスの取れた塩ソリューション (BSS) 50,000 細胞/μ L で (網膜注入中に 1 μ L のボリュームの 50,000 セルを配信) に再懸濁します。</li>
		<li>1.7 mL 遠心チューブに氷-水混合物の注入に使用されるまで最終的な細胞懸濁液 (CS) を転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セル インジェクターの準備
	<ol>
<li>注射器とインジェクターを組み立てるにはしっかりとネジに滅菌 33 ゲージ ベベル針を挿入します。</li>
		<li>5-6 回 100% エタノールでインジェクターをフラッシュします。</li>
		<li>5-6 回の 70% エタノール噴射装置をフラッシュします。</li>
		<li>5-6 回 BSS とインジェクターをフラッシュします。</li>
		<li>(図 1 b) 解剖顕微鏡下で針の先端から 600 μ m の位置にある黒のマーカーペン滅菌とインジェクター針をマークします。</li>
		<li>注射用マイクロマニピュレーターにインジェクターを配置します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 網膜注入
<ol><li>
外科領域と動物の準備
	<ol>
<li>4-5 週齢 RCS ラット (60-100 g) の重量を量るし、イソフルラン蒸気の配信システムを使用してそれを麻酔します。 注:誘発するには、麻酔は 5% にイソフルランの流量を維持します。足を押すことによって麻酔の深さを確認し、手術中に麻酔維持のための 2-3%、流量を減らします。</li>
		<li>滅菌手術ドレープ、滅菌手術領域を設定する解剖顕微鏡のステージの下に、加熱パッドを配置します。</li>
		<li>外科領域にラットを転送し、ラットを麻酔を維持するためにイソフルラン システムに接続されている鼻の円錐形に配置します。</li>
		<li>ガーゼでラットの体をカバーしてください。完全麻酔を確認するラットのつま先をピンチします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
顕微鏡下強膜網膜注入
	<ol>
<li>ラットの unoperated 目に目の潤滑剤の滴を適用します。</li>
		<li>注射、外科医の右手に向かって頭とその外科医の方のための天井に直面して左眼の右側にラットを配置します。</li>
		<li>小さなハサミで目をカバーするひげをトリムします。</li>
		<li>左眼の時間的側面から目の洗浄量を点滴し、目を洗うに綿棒で鼻側に過剰を収集します。</li>
		<li>それぞれの滴を適用することによって投与後 10 月受験 (たて 10% フェニレフリンから手術の日にそれ 0.9% 生理食塩水で希釈することによって作られる) 1% 2.5% とトロピカミド フェニレフリンで瞳孔を散大させます。</li>
		<li>4-6 回目の周囲の皮膚を軽く引いてするまぶたを開き、目は若干れ角膜輪部の後方の領域にアクセスするため、突出しています。</li>
		<li>目の洗浄の適用ドロップ、目の潤いを保ちます。</li>
		<li>優しく (1.1. 12 のステップで準備) CS をカップ刻んだし、1.2 μ L CS とインジェクターをロードします。余分な 0.2 μ L が注入逆流を補うために使用されます。 注:について私たちの測定に基づく 5,000-8,000 セルはセル損失の約 10-16% に相当する 50,000 の細胞/μ の注射で逆流で失われ、0.2 μ L CS の余分をこのセル損失を補償するために注入されました。</li>
		<li>満ちている CS マイクロマニピュレーターにインジェクターを配置 (またはそれを保持するアシスタント) 垂直として RPE 細胞傾向にある懸濁液で簡単に沈みます。</li>
		<li>目にプロパラカイン 0.5% (ローカル局所麻酔薬) のドロップを適用し、綿アプリケーター付き過剰を削除します。 注:この手順は、角膜反射を抑制するし、目が後続の手順の実行中に点滅するを防ぐ必要があります。</li>
		<li>結膜、角膜の後方をグリップし、鼻、目を回転させる「テント」結膜を持ち上げて鉗子を使用します。</li>
		<li>結膜に小さな開口部を確認し、基になる強膜を公開「テント」上部をカットするはさみを使用します。</li>
		<li>鉗子を使用して、残り結膜角膜マージンの端をつかんで、瞳孔軸テーブル トップ (図 1) を基準にして約 30 度の角度で、鼻、目を回転します。針挿入時反力を提供するために、最適な角度で目を維持するために、結膜縁の継続的な把握が必要です。</li>
		<li>細胞の注入のための下穴をするためには、滅菌ベベル 31 ゲージ インスリンの針の先端位置は 1,200-1,500 μ m 直面している先端の開口縁の後方で。</li>
		<li>10-15 度 (目的の注射部位の虚数平面に接線) 強膜上にあるインスリンの針の角度を調整します。約 500 μ m の針の深さに強膜・脈絡膜複合体にゆっくりと浸透します。色素性のラットで針の端が「消滅」色素性の脈絡膜の下にあります。ここで使用されるインスリンの針のブランド、針の先端から面取りまでの距離は 500 μ m です。</li>
		<li>慎重に撤回するインスリンの針 (血の非常に小さい胸水が見られるかもしれない)。</li>
		<li>過度の出血が認められる場合、目槍は、必要に応じて、穴をオフに適用できます。継続的な出血後槍アプリケーション容器が破損しています。</li>
		<li>上下強膜の局所的な面を基準にして約 10-15 度の角度に直面して開口をパイロット穴に挿入、RPE 細胞ロード インジェクター針をガイドします。</li>
		<li>インジェクター針を網膜の領域にアクセスする約 500 μ m の深さにパイロット穴にそっと挿入します。黒のペンのマークの端と針が (図 1と1 D) 色素性の脈絡膜で覆われているポイントの間 100 μ m のマージンについて必要があります。</li>
		<li>優しく細胞 (約 1.2 μ L) の適切な量を注入する注入器注射器のプランジャーを押し下げるにアシスタントを頼みます。プランジャーを押すとアシスタントとしていくつかの反力を提供する準備ができてください。 注:アシスタントの前に模擬練習は外科医とこのステップに必要な経験を持つアシスタントの両方を提供できます。</li>
		<li>ペンで視覚的に焦点を当てながらエッジをマーク、25-30 秒の場所にインジェクターを保持、インジェクターをゆっくりと上げます。少量の逆流がよく観察されます。 注:逆流を認められなかった場合で、ケナコルト硝子体内注入をされてありますいる可能性があります。逆流シールや、強膜の下に充填セルを介して場合は、注入が浅すぎていた。</li>
		<li>3 回滅菌目洗うと注射部位から細胞排出を洗うし、綿アプリケーター付き過剰を収集します。</li>
		<li>運営の目に目の潤滑剤の滴を適用し、ラットを移植細胞の場所と網膜の胞のサイズを検討する 10 月駅に転送します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 後注入治療
<ol><li>
抗炎症、痛みの緩和治療
	<ol>
<li>痛みを軽減する皮下生理食塩水で 0.1 mg/kg 体重でブプレノルフィンを注入します。</li>
		<li>腹腔内注入 (i. p.) 炎症制御による生理食塩水で 1.6 mg/kg 体重でデキサメタゾンを注入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
動物の回復
	<ol>
<li>ラットを体温を維持する熱ランプの下で回復ケージに戻ります。</li>
		<li>運営の目には出血の兆候を確認します。</li>
		<li>麻酔が出てくるようにラットを観察します。</li>
		<li>回復した動物を新鮮なケージに戻る手術カードでケージをフラグし、毎日の苦痛、眼出血、角膜混濁の兆候を監視します。懸念がある場合は、すぐに獣医師を通知します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

この資料に示されている網膜注入法はインジェクター針が神経網膜を傷つけるまたは硝子体腔を乱すことがなく目の壁の外側の層 (強膜・脈絡膜・網膜色素複合体) を貫通強膜の経路です。代替トランス vitreal アプローチには、レンズの損傷を齧歯動物のレンズが硝子体腔の大半を占めているので、白内障につながるの潜在的なリスクがあります。このメソッドと比較して、本手法はリスクが少ないで、インジェクター針は網膜の領域に到達する全体の硝子体腔をまたぐ必要がないので、最小限の外傷を引き起こします。確かに、私たちの研究で OCT 所見網膜浸透の非常にまれなイベントと、動物のフォロー アップ試験では永続的な網膜剥離がないです。また、注射部位が非常に小さい (< 200 μ m 径) 針 33 ゲージ注射器を用いたときの強膜・脈絡膜・網膜色素複合体の構造は非常に限られたので。針撤回後注入穴自己シールないのでステッチ自動的にまたは組織接着剤が必要です。
インジェクション周辺または内から過度の出血、手術の合併症が含まれます下の穴。角膜輪部結膜余白をグリップに鉗子を使用している場合、血管をつまんでを避けるために...

人間の網膜は光感覚組織として目関数の後ろに位置し、視覚認知に重要な役割を果たしています。網膜細胞の機能不全や細胞死したがってビジョンの問題や永久的な盲目を引き起こします。変性や網膜の異なる層の細胞の機能不全を伴う疾患はその中で AMD は最も一般的なタイプとの先進国で高齢者に回復不能な失明の主要な原因、網膜変性疾患として知られています。1,2。AMD の病理学的プロセスが網膜色素上皮層と順番視細胞の生理学、神経網膜の萎縮およびビジョンの損失3につながるの RPE サポートを損なう基になるブルッフ膜の間「ドルーゼン」蓄積関連付け 4,5。これまでの治療がない高度な (非血管新生) AMD を乾燥します。幹細胞療法として再生医療の新しいパラダイムの出現は、健康な細胞の幹細胞の機能不全や死者の網膜色素上皮細胞を交換の希望をもたらします。確かに、広範な臨床研究移植の幹細胞 (例えば、ヒト胚性幹細胞)-RPE 変性動物モデルに派生の網膜色素上皮細胞が実行6、7にいくつかの進歩をされています。臨床試験8,9 (NCT01344993、ClinicalTrials.gov)。最近では、幹細胞が人間の網膜色素上皮層、人間の網膜色素上皮幹細胞 (hRPESCs) の居住者の代替ソース研究室によって識別され、現在 amd hRPESC 派生した網膜色素上皮細胞 (RPE-hRPESC) 移植療法の臨床研究で使用されて10,11,12,13。
網膜下注入の技術は、上記当社グループを含む複数のグループによる前臨床試験に適用されます。動物の網膜注入の 2 つの一般的なアプローチ: トランス vitreal と強膜。トランス vitreal 方法の利点はレンズに全体 vitreal 腔を越える前眼に浸透、浸透、subretinal に到達する目に後ろに網膜と針の端を直接観察することが外科医のスペース14,,1516。ただし、それは (前部と後部)、2 つの場所で網膜を中断すること、レンズを傷つけるリスクを運ぶし、針が取り消されるとき硝子体に細胞の逆流の可能性があります必要があります。対照的に、トランス強膜方法は、原則として、網膜と硝子体の関与を回避し、逆流が目を終了します。色素性の齧歯動物の外科医は当初、強膜の浸透を観察できるが、色素性の脈絡膜に通過後針の端が表示されなくなります。直接観察することがなく網膜に違反は一般的と網膜剥離、硝子体に細胞や血液の配信になります。また、眼の表面が湾曲しているために、強膜注射のため最も効果的などの針の角度と深さを知ることは非常に困難です。
この可視化の記事で光コヒーレンストモグラフィ (OCT)、注射部位の詳細な検査ができると手術後の評価を使用して通知強膜網膜注入法を紹介します。私たちの強膜注入法は、定義済みの場所、角度、および非常に低い外科的外傷と高信頼性を生成する注射針の深さを利用しています。ここでは、人間の AMD の前臨床モデル RCS ラットの網膜注入 hRPESC 網膜色素上皮細胞を具体的に示す.この注入法で正常にかつ一貫して救わ hRPESC 網膜色素上皮細胞に非常に高い成功率で RCS ラットの目の網膜。細胞の注射以前が認め RCS 視細胞の保全に注入13後少なくとも 2 ヶ月。この手順は、解剖顕微鏡の下で行われ、学ぶことは簡単です。(外科医と助手) 注射を実行する二人必要で、それぞれの動物の注入の平均時間は 5 分未満。定義された角度と注射針の深さは 10 月が正常網膜注入を達成するために利用可能な研究所を可能にします。それは再現性の高い網膜にアクセスできます、細胞移植のみならず、医薬品配送と遺伝子治療のために使用できます。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Σ</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1xDulbecco'カルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 &マグネシウム(1xDPBS-CMF)</td><td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>滅菌バランス塩溶液(BSS)</td><td>アルコン</td><td>00065079550</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>洗眼液</td><td>Moore Medical</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>滅菌0.9%生理食塩水</td><td>Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>プロパラカイン塩酸塩点眼液(0.5%)</td><td>Akorn</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>トロピカミド点眼液、USP(1%)</td><td>Bausch &ロム</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>フェニレフェリン点眼液、USP(10%)ストックバ</td><td>ウシュ&Lomb</td><td>42702010305</td><td>これは2.5%のフェニレフェリン</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>のパターソン</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>APPの薬剤</td><td>を作63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100%のエタノール</td><td>サーモの科学</td><td>的な615090040</td><td></td></tr><tr><td>70%のエタノール</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterile GenTealの潤滑油の目のゲル</td><td>を作るのに使用されていますノバルティス</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み シスタン ウルトラ 潤滑剤点眼薬</td><td>アルコン</td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>hRPESC-RPE 細胞</td><td>市販</td><td></td>されていません <td>細胞の単離とメンテナンスについては、「リファレンス #12」を参照してください。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>Oリング付き微量遠心キャップ</td><td>LPS inc</td><td>L233126</td><td></td></tr><tr><td>キャップレス微量遠心チューブ (1.7 ml)</td><td>LPS inc</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>滅菌アルコールワイプ</td><td>McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿チップアプリケー</td><td>ターマッケソン</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>滅菌Weck-Cel槍ビー</td><td>バービジテックインターナショナル&nbsp;</td><td></td><td></td>0008680</tr><tr><td>滅菌外科用ドレープ&nbsp;</td><td>マッケソン</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>マッケソン</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>ナノフィル シリンジ (10 ul)</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>ナノフィル</td><td></td></tr><tr><td>ナノフィル 面取り 33 ゲージ針</td><td>ワールド プレシジョン</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>インスリン シリンジ ニードル 31ゲージ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>ラット 歯付き鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>バンナスマイクロ解剖スプリングはさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>循環水Tポンプ&nbsp;</td><td>ストライカー</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングパッド</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>動物麻酔システム</td><td>ワールドプレシジョンズ</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>バランス</td><td>オーハウス</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ 2000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡光源</td><td>ショット</td><td>ACEシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>Bioptigen Envisu スペクトル領域眼科イメージングシステム</td><td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ブラックマーカーペン</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>ミニチュア測定スケール</td><td>Ted Pella Inc</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>赤外線日光浴スポットランプ&nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>これは、術後の回復期に動物の暖房ランプとして使用されます。</td></tr></tbody></table>

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの網膜変性疾患は、世界的な不可逆的な視力喪失の主要な原因です。AMD は、機能的にサポートおよび解剖学的神経網膜の周りを囲むセルの単分子膜は、網膜色素上皮 (RPE) 細胞の退化によって特徴付けられます。非血管新生 AMD (AMD) の現在の薬理学的治療法は、病気の進行を遅くしか新規治療戦略の特定を目的とした研究を施行したビジョンを復元できません。変性の網膜色素上皮細胞を乾燥 AMD を将来的に治療するために健康な細胞の将来性に置き換えます。AMD のための幹細胞補充療法の広範な前臨床研究は、幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜注入の技術を適用する動物モデルの網膜への移植を含みます。これらの前臨床動物研究で最も頻繁に使用されるアプローチは、針の端の直接可視化の欠乏によって困難になされる、網膜の損傷で起因できるしばしば強膜ルートを通じてです。針終了位置の直接観察が可能硝子体を通して別のアプローチがより目の組織が邪魔と手術のトラウマ高いリスクを運ぶ。我々 は正常にし一貫してラット網膜下腔網膜色素上皮細胞を提供し、過剰な網膜の損傷を避けるために定義された針の角度と深さを使用するリスクが少ないと再現性のある変更された強膜注入手法を開発しました。この方法で配信される細胞は、最低 2 ヶ月は王立外科医師 (RCS) ラットで結構効果があります以前実証されています。細胞移植のみならず小分子や遺伝子治療の配信、この手法を使用することができます。

この資料で説明する手法を使用すると、一貫して納品 hRPESC 網膜色素上皮細胞 RCS ラットの網膜下腔の場所、角度、および組織 (図 1 b-D にインジェクター針挿入の深さを正確に制御することにより).すぐに次の移植は、OCT 検査を行った注射部位及び移植の細胞によって作成された網膜下の水疱を観察します。手術後 10 月評価は注射や網膜の損傷や出血を監視の質を評価するためのスクリーニング ツールとして提供しています。両方網膜下水疱 (図 2 a、 CおよびD) 注射部位 (図 2 aおよびB) はスキャン OCT ではっきり確認できたし、。網膜下の水疱は、通常注射後 24 時間以内に解決します。鉱物のサイズの測定は困難な OCT を用いたが、我々 は細胞移植による視細胞保護区域に等しいと仮定すると水...

網膜の注射は、加齢黄斑変性症に対する幹細胞補充療法の臨床研究で広く適用されています。この可視化の記事でラットの目に細胞を提供する強膜によるリスクの少ない、再現性と正確に変更された網膜注入手法について述べる。

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

このビデオの全体的な目的は、網膜への損傷リスクを最小限に抑えつつ、ヒト網膜色素上皮（RPE）細胞をげっ歯目の眼の網膜下空間に導入するための、再現可能な経強膜的網膜下注入技術を紹介することです。まず、角膜輪後方の側方結膜に小さな切開を加え、下層の強膜を露出させます。次に、31ゲージの面取りされたインスリン針を用い、針先を500 µm（概ね針先の半分）だけ組織に刺入し、面取り側を上に向けた状態で強膜コア複合体を貫通させ、ガイド孔を作成します。次に、シリンジに取り付けた33ゲージの斜辺針をガイド穴に沿って、特定の角度と深さで挿入します。針を抜いた後、注入孔は自然に密封されるため、縫合や組織用接着剤は不要です。変性網膜症は、異なる種類の網膜細胞が関与する幅広い疾患群で構成されています。世界的に最も一般的な疾患である加齢黄斑変性（AMD）は、高齢者に発生し、永続的な失明に至ります。AMDで起こる病理学的変化には、まず網膜色素上皮細胞（RPE）の変性が関与しています。RPEの喪失は、網膜光受容体細胞の機能不全または死滅につながります。初期段階のAMDに対する現在の薬物治療は、進行を遅らせるか、あるいは症状を緩和することに限定されています。これに加え、網膜の再生能力が限定的であるため、視力を回復させるための有効な治療法が存在しません。Neural Stem Cell Instituteは最近、RPE細胞集団の中に成人幹細胞の集団を同定しました。これらの細胞は、幹細胞置換療法のソースとして利用可能です。現在、当研究機関では、RPE変性ラット動物モデルを用いて、RPE幹細胞移植療法の有効性と安全性を検証するための前臨床研究を行っています。本研究では、経強膜下網膜下注入法を用いて、網膜層とRPE層の間にRPE幹細胞をラットの眼内に導入します。本手法は、網膜下腔への細胞導入を成功させるための、簡便で信頼性の高い手段です。以下の試薬および器具が必要です。瞳孔を散瞳させるため、手術当日に10% phenylephrineを滅菌0.9% salineで希釈して調製した、1% tropicamideおよび2.5% phenylephrineを使用します。眼洗浄液は、眼の洗浄および非手術側の眼の保湿に使用します。手術中、非手術側の右眼を湿潤に保つために眼用潤滑剤を使用します。局所麻酔薬として0.5% proparacaineを使用します。OCTスキャン中、手術側の左眼に眼用潤滑剤を使用します。この手法に必要な材料および装置は最小限です。本手法で使用した装置および試薬の詳細な情報はプロトコルに記載されています。細胞の注入には10 µLシリンジを使用します。注入前に、まず注入器を組み立て、エタノールで滅菌します。滅菌済みの33ゲージのベベル針をシリンジに挿入し、しっかりとねじ込んで注入器を組み立てます。100%エタノール、70%エタノール、そして脱イオン蒸留水の順に、それぞれ5〜6回ずつ注入器を洗浄します。滅菌済みの黒色マーカーペンを用いて、注入針の先端から600 µmの位置に印を付けます。注入に使用するため、注入器をマイクロマニピュレーターに装着します。ヒトRPE細胞は手術当日に調製し、氷水混合液の中で保持しておきます。細胞懸濁液を静かにピペッティングし、インジェクターに1.2 µLを充填します。注入時の逆流を補正し、確実に1 µLの量を注入するために、0.2 µLの余分な量を加えています。RPE細胞は溶液中で沈降しやすいため、細胞懸濁液を満たしたインジェクターをマイクロマニピュレーターに装着するか、助手に垂直に保持してもらってください。解剖顕微鏡のステージ上に、加熱パッドを敷いた滅菌手術用パッドを配置し、滅菌手術領域を準備します。動物を用いたすべての手順は、ニューヨーク州立大学オールバニ校の施設動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認されています。ここに示すように、動物の体重を測定し、イソフルラン蒸気投与システムを用いて麻酔をかけます。麻酔後、ラットを手術領域に移動させ、麻酔を維持するためにイソフルランシステムに接続されたノーズコーンに固定します。ラットの体をガーゼで覆い、足指をつまんで完全な麻酔状態であることを確認します。ラットの右目に眼用潤滑剤を1滴点眼し、注入のために左目が天井を向くよう右側臥位に固定します。このとき、頭が術者の右手に、背中が術者側にくるように配置します。目の上に被っているひげをトリミングして取り除きます。洗眼液を少 amount 左目の耳側に点眼し、綿棒を用いて鼻側で余剰分を回収しながら眼を洗浄します。注射後の光干渉断層計（OCT）検査のため、1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンをそれぞれ1滴ずつ点眼し、瞳孔を散瞳させます。その後、眼を湿潤に保つために洗眼液を1滴点眼します。プロパラカインを眼球に1滴滴下し、綿棒で余分な液を除去します。眼球周囲の皮膚を4〜6回軽くマッサージして眼瞼を開き、注射針を挿入しやすくするために眼球を眼窩から一時的かつわずかに突出させます。フォースを用いて角膜縁後方の結膜を把持し、眼筋を損傷させないように眼球を回転させ、手術に適した部位を探します。結膜をそっと持ち上げてテント状にし、眼球を鼻側に回転させます。次に、ハサミでテントの上部を切り取り、結膜に小さな開口部を作って強膜を露出させます。続いて、ピンセットで角膜輪に隣接する結膜開口部の端を掴み、瞳孔軸が地面に対して約30度の角度になるように眼球を鼻側に回転させます。滅菌済みの31ゲージの面取り済みインスリン針を用い、面取り部分を上に向け、針先の半分（約500 µm）を組織に刺入して、強膜コア複合体を貫通させ、注入用のガイド孔を作成します。インスリン針を慎重に引き抜くと、少量の出血が見られる場合があります。必要に応じて、アイスピアを用いて孔を浄化し、止血を行います。RPE細胞を充填した注入針を、強膜の局所表面に対して約10〜15度の角度でパイロットホールに導き、500 µmの長さの針を組織に完全に挿入し、組織に覆われた針の先端部分と針上の黒いマーカーの点との間に100 µmの距離を残すことで、網膜下腔に到達させます。アシスタントに指示してシリンジのプランジャーを押し、適切な量の細胞を注入します。注入後、注入器を25〜30秒間そのまま保持し、その後ゆっくりと注入器を後退させます。注入孔は自動的に封鎖されますが、通常、約0.2 µLの少量の逆流が観察されます。注入部位を滅菌洗眼液で3回洗浄し、余剰分を綿棒で拭き取ります。処置した眼に潤滑剤を1滴点眼し、ラットをOCTステーションへ移動させて、移植細胞の位置および網膜下水疱の大きさを確認します。OCT完了後、体温を維持するため、ラットをヒートランプのある回復用ケージに戻します。ラットが麻酔から覚醒したことを確認し、苦痛の兆候がないか毎日観察してください。懸念がある場合は、直ちに獣医師に通知してください。本手法を用いることで、ヒトRPE細胞を網膜下腔へ一貫して正常に移植することができました。移植直後にOCT検査を行い、注入部位および移植細胞によって形成された網膜下水疱を観察しました。これは、注入の質や網膜損傷、または出血の程度を評価するための有効なスクリーニングツールとなります。OCTスキャニングにより、注入部位周囲の強い光反射と、細胞懸濁液で満たされた網膜下水疱が確認されました。注入が成功した場合、注入部位または硝子体腔周囲に、出血、眼内液の漏出、あるいは網膜剥離は見られず、注入による外傷が極めて少ないことが示されました。処置後のラットの眼球は、移植の7日後に摘出し、固定した上で、免疫組織学的解析のために切片を作成しました。移植細胞を検出するため、ヒト核マーカーのHunuおよびRPE細胞マーカーのOTX2を使用しました。両方のマーカーが陽性であることは、移植したヒトRPE細胞がラット眼の網膜下腔に位置していたことを示しています。この経強膜的網膜下注入技術はシンプルであり、習得が容易です。この手法では、注射針を眼壁の外層に通し、神経網膜を破ることなく挿入するため、手術による外傷が少なく、網膜を無傷に保つことができます。パイロット針および注射針を組織に刺入するための定量化された滴数と、注射時に用いる角度により、非常に高い精度と成功率で、細胞を確実に網膜下空間へ届けることが可能となります。この注射法を用いることで、ヒトRPE幹細胞由来のRPE細胞を、RCSラットの網膜下空間へ一貫して成功裏に導入することができました。この手順は、ビデオを視聴すれば誰でも簡単に再現することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

細胞移植は、感光体喪失を特徴とするレチン系変性の治療のための戦略を表す。ここでは、移植可能な感光体の濃縮方法と、その副レチング移植を成体マウスに説明する。...

MACSの精製された感光体前駆体細胞の成人マウス・レチナへの副腎移植

ここでは、ラットとマウスにRPE細胞のボーラスを網膜下注射するためのマルチメディア形式でコミュニティが受け入れたプロトコルを紹介します。このアプローチは、網膜変性の動物モデルに移植された移植されたRPE細胞のレスキューの可能性、安全性プロファイル、および生存能力を決定するために使用できます。...

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

網膜色素上皮（RPE）の交換戦略と遺伝子ベースの治療は、いくつかの網膜変性条件のために考慮されています。臨床翻訳のために、大きな目の動物モデルは、患者において適用外科技術を研究するために必要とされます。ここでは、汎用性とコスト効率であるRPE移植、に向けた網膜下手術のためのウサギモデルを提示します。...

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。...

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する手術手技について紹介する。...

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

非ヒト霊長類(NHP)は、解剖学的および遺伝的類似性によるヒトの細胞疾患治療を研究するための理想的なモデルである。本稿では、NHP眼における網膜色素上皮細胞の脳下移植法と、黄斑操作に伴う術中合併症を予防するための戦略を記載する。...

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

網膜色素上皮(RPE)の網膜下移植は、変性網膜疾患の治療のための最も有望なアプローチの1つです。しかし、大眼動物モデルでの前臨床試験の実施は依然として困難です。このレポートは、ミニブタへの細胞キャリア上のRPEの網膜下移植のガイドラインを提示します。...

ミニブタのキャリアへのRPEの網膜下移植:術前準備、手術手技、および術後ケアのガイドライン

このプロトコルは、網膜変性の有無にかかわらず、マウスレシピエントにおいて、外科的合併症の発生率が低い網膜下細胞移植片を安全かつ正確に送達するための経瞳孔ビジョン誘導経強膜アプローチを提示します。...

網膜変性マウスモデルにおける網膜下移植片の経瞳孔ガイド下経強膜移植

我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10...

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。...

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

学ぶ 強膜経由網膜下注射法でラット眼にヒト網膜色素上皮細胞を移植する技術。網膜損傷リスクを最小限に抑え、自己閉鎖性の安全で再現性のある細胞投与プロトコルを確立する方法です。

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

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