強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

このビデオの全体的な目標は、網膜損傷のリスクを最小限に抑えながら、ヒト網膜色素上皮(RPE)細胞をげっ歯類の目の網膜下腔に送達するための再現性のある経強膜網膜下注射技術を紹介することです。これは、最初に辺縁部の後方の側頭結膜に小さな切開を行い、下にある強膜を露出させることによって達成されます。次に、斜めの31ゲージインスリン針を使用して、斜めの面を上にして針を組織に500ミクロンまたは先端の約半分を挿入してパイロット穴を作成することにより、強膜コア複合体を貫通します。

次に、シリンジに取り付けられた斜角の33ゲージ注射針をパイロット穴に導き、特定の角度と深さで挿入すると、針が引っ込められた後に注射穴が自己シールされ、ステッチや組織接着剤は必要ありません。変性網膜症は、さまざまな種類の網膜細胞が関与する幅広い疾患で構成されています。世界中で最も一般的な病気である加齢性黄斑変性症(AMD)は、高齢者の間で発生し、永久的な失明につながります。

AMDで起こる病理学的変化には、網膜色素上皮細胞(RPE)の初期変性が伴います。RPEの喪失は、網膜フルオロ受容体の機能不全または死につながります。初期段階のAMDに対する現在の薬理学的治療は、進行を遅らせたり、症状を緩和したりすることに限定されています。

これは、網膜の限られた再生能力と相まって、視力を回復するための効果的な治療法がないことを意味します。神経幹細胞研究所は最近、RPE細胞集団に成体幹細胞の集団を特定しました。これらの細胞は、幹細胞補充療法の供給源として使用できます。

現在、当研究所では、RPE変性ラットモデル動物を用いたRPE幹細胞移植療法の有効性と安全性を検討するための前臨床試験を実施しています。この研究では、経強膜網膜下注射技術を利用して、RPE幹細胞をラットの眼、網膜層とRPE層の間に送達します。私たちの方法は、細胞を網膜下空間にうまく送達するための簡単で信頼性の高い手段です。

10%フェニレフリンから新たに作られた1%トロピカミドと2.5%フェニレフリンを、手術当日に滅菌0.9%生理食塩水で希釈して瞳孔を拡張するために使用されます。洗眼剤は、目をすすぎ、手術していない目を潤いを保つために使用されます。

手術中に手術していない右目を湿らせておくために、眼の潤滑剤が使用されます。局所麻酔薬として0.5%のプロパラカインが使用されます。OCTスキャン中に手術した左目には、眼の潤滑剤が使用されます。

この手法に必要な材料と機器は最小限です。この技術で使用される機器と試薬の詳細な情報は、プロトコルに概説されています。10マイクロリットルの注射器を使用して細胞を注入します。

注入前には、まずインジェクターを組み立て、エタノールで滅菌します。滅菌済みの33ゲージの斜め針をシリンジに挿入し、しっかりとねじ込んでインジェクターを組み立てます。インジェクターを100%エタノール、次に70%エタノール、次に脱イオン蒸留水でそれぞれ5〜6回順次洗浄します。

注射針の先端から600ミクロン離れた位置に滅菌済みの黒いマーカーペンでインジェクター針に印を付けます。.インジェクターをマイクロマニピュレーターに取り付けて注射用です。ヒトRPE細胞は手術当日に調製され、氷水混合物に保管されます。

細胞懸濁液を穏やかに回転させ、インジェクターに1.2マイクロリットルをロードすると、余分な0.2マイクロリットルは注入の逆流を補うために使用され、1マイクロリットルの注入量を保証します。マイクロマニピュレーターで細胞懸濁液を充填したインジェクターを交換するか、RPE細胞が溶液中に沈みやすいため、アシスタントに垂直に保持してもらいます。解剖顕微鏡のステージ上に、下に加熱パッドが付いた滅菌手術パッドを配置して、滅菌手術領域を準備します。

動物を対象とするすべての手順は、ニューヨーク州立大学アルバニー校の施設動物管理および使用委員会によって承認されています。動物に体重を量り、ここに示すようにイソフルラン蒸気送達システムを使用して麻酔をかけます。麻酔がかかったらラットを手術部位に移し、イソフルラン系に接続されたノーズコーンに入れて麻酔を維持します。

ラットの体をガーゼで覆い、ラットのつま先をつまんで完全な麻酔を確認します。ラットの右目にアイ潤滑剤を一滴垂らし、ラットを右側に配置し、左目を天井に向けて注射し、頭を外科医の右手に向けて、そして外科医の方に戻します。目を覆っているひげをすべて切り取ります。

左目の側頭側に少量の洗眼剤をドリップし、余分なものを鼻側にコットンアプリケーターで集めて目を洗い流します。1%トロピカミド、2.5%フェニレフリンで瞳孔を拡張し、注射後の光干渉断層撮影法(OCT検査)のために、それぞれ1滴ずつ適用します。目を潤すために洗眼剤を一滴垂らします。

プロパラカインを一滴目に塗り、綿のアプリケーターで余分な部分を取り除きます。目の周りの皮膚を4〜6回優しくマッサージしてまぶたを開き、目が一時的にわずかにソケットから飛び出し、インジェクター針に簡単にアクセスできるようにします。力を使って輪部の後方の結膜をつかみ、眼球を回転させて、眼の筋肉を損傷することなく手術に適した場所を見つけます。

結膜をそっと持ち上げてテントを作り、目を鼻で回転させます。次に、はさみを使用してテントの上部を切り取り、結膜に小さな開口部を作り、強膜を露出させます。次に、鉗子を使用して、輪部の横にある結膜開口部の端をつかみ、瞳孔軸が地面に対して約30度の角度になるように、目を鼻で回転させます。

滅菌された斜めの31ゲージインスリン針を使用して、先端の半分を上に向ける斜角で強膜コア複合体を貫通し、組織に挿入して約500ミクロンを挿入し、注射用のパイロット穴を作成します。インスリン針を慎重に引き抜くと、少量の血液が滲出することがあります。アイスピアを適用して穴を空け、必要に応じて出血を止めることができます。

RPE細胞負荷インジェクター針を強膜の局所表面に対して約10〜15度の角度でパイロット穴に導き、長さ500ミクロンの針を組織に完全に挿入し、組織で覆われている針の点と針の黒いマーカーの点との間に100マイクロの距離を残すことにより、網膜下空間に到達します。シリンジのプランジャーを押し下げ、適切な量の細胞を注入するようにアシスタントに伝えます。注入後25〜30秒間インジェクターを所定の位置に保持し、その後、インジェクターをゆっくりと引っ込めます。

注入穴は自動的に密閉され、約0.2マイクロリットルの少量の逆流が一般的に観察されます。注射部位を滅菌洗眼剤で3回洗い流し、余分なものを綿のアプリケーターで集めます。.手術した眼に潤滑剤を一滴垂らし、ラットをOCTステーションに移して、移植された細胞の位置と網膜下ブレブのサイズを調べます。

OCTが完了したら、ラットをヒートランプの下のリカバリーケージに戻して体温を保ちます。ラットを観察して麻酔から出てくることを確認し、苦痛の兆候がないか毎日監視します。懸念がある場合は、すぐに獣医師に通知してください。

私たちの技術を使用して、ヒトRPE細胞を網膜下腔に一貫して成功裏に送達しました。移植直後からOCT検査を行い、注入部位と移植細胞が作る網膜下ブレブを観察しました。これは、注射の質と網膜損傷または出血の程度を評価するための優れたスクリーニングツールとして機能します。

OCTスキャンでは、注射部位の周囲の明るい光の反射と、細胞懸濁液で満たされた網膜下ブレブが見られました。成功した注射では、注射部位や硝子体内腔の周囲に出血、眼液漏れ、網膜剥離は見られず、注射による外傷が最小限に抑えられていることを示しています。手術を受けたラットの眼を、移植後7日目に免疫組織学的分析のために核形成し、固定し、切片化した。

移植した細胞を検出するために、ヒト核マーカーのHunuとRPE細胞マーカーのOTX2を用いた。両方のマーカーの肯定的な記載は、移植されたヒトRPE細胞がラットの眼の網膜下空間に位置していることを示しました。この経強膜網膜下注射技術はシンプルで習得が容易です。

手術による外傷が少なく、神経網膜を壊すことなく、注射針を眼壁の外層に通すことで網膜を無傷のままにします。パイロット針と注射針が組織内に入るための定量化された滴と、注射中に使用される角度により、はるかに高い精度と成功率で細胞を網膜下腔に確実に送達することができます。この注入法により、ヒトRPE幹細胞由来のRPE細胞をRCSラットの網膜下腔に一貫して成功

この手順は、ビデオを視聴する人なら誰でも簡単に繰り返すことができます。