加速動脈硬化家兎モデル: 内腸骨動脈バルーン傷害の方法論的視点
2017年10月3日
動脈硬化症の動物モデルは、メカニズムを理解してプラークの開発や破断、先進国の死亡原因を防止するための新しいアプローチを調査するために不可欠です。このプロトコルは、ウサギ腸骨動脈の動脈硬化性プラークを誘発するのにバルーン傷害と高コレステロール食の組み合わせを使用します。
この手順の全体的な目標は、ウサギの左腸骨動脈の内皮を外科的に破壊し、アテローム発生食を与えることにより、ウサギのアテローム性動脈硬化性プラークの形成を誘発することです。ウサギの孤独な損傷により、プラーク組成を研究するために大動脈で行われることがよくあります。しかし、腸骨動脈はヒトの冠状動脈と非常によく似ているため、アテローム性動脈硬化性プラークをモデル化するための魅力的な場所となっています。
ウサギ腸骨動脈の筋肉含有量の均一な病変、眼組織因子活性、および一貫した血管寸法はすべて、ヒトの冠状動脈に匹敵します。最終的に、これにより、商業的に製造されたデバイスの形態測定および血管造影エンドポイントの評価が可能になります。この手順を実演するのは、私の研究室の共同研究者であるAurelien Frobertです。
すべての手術器具は、ガラスビーズ滅菌器などを使用して滅菌するようにしてください。次に、2つのバルーンカテーテルアセンブリを準備して確認します。それぞれに、生理食塩水で満たされた1ミリリットルのルアーロックシリンジを取り付け、バルーンの膨張メカニズムを使用してエンビケが引っ掛かっていないか確認します。
次に、手術台のサーマルパッドを摂氏37度に設定します。次に、ウサギの体重を量ります。次に、ブプレノルフィンを注射し、5%イソフルオランを使用してウサギに麻酔をかけます。これは、毎分5リットルで10〜15分間です。
次に、麻酔をかけたウサギを手術台の加熱パッドに置きます。センサーを取り付けて、ウサギの体温と呼吸を監視し、心電図を収集します。次に、フェイスマスクを取り付けて、毎分2.5リットルで4%イソフルオランを送達します。
次に、ギャグとささいな反射神経の喪失をテストして、適切なレベルの麻酔を確認します。普遍的にリラックスした筋肉の緊張も深い麻酔の指標です。次に、アブトニック軟膏を両目に塗ります。
次に、動物のバリカンを使用して、膝関節のすぐ下の腹側領域から毛を取り除きます。次に、抜け毛を取り除き、露出した皮膚を70%エタノールとベタジンの3つの交互のスクラブできれいにし、動物を下肢だけ露出させてドレープします。手術を開始するには、伏在動脈の位置を特定し、1.5センチメートルの切開を行います。
次に、小さな湾曲した鉗子を使用して、伏在動脈のごく一部を慎重に露出させます。大腿静脈や大腿神経を傷つけないように注意してください。この曝露中は、動脈を徹底的に洗浄することが非常に重要です。
次に、伏在動脈の下に2つの緩い結紮ループを配置し、動脈の遠位端近くに1つの結紮ループを結びます。次に、結紮糸の上の動脈に沿って微小血管クランプを配置し、クランプを閉じて血流を止めます。すぐにパパベリンを一滴垂らして動脈を拡張し、相痙攣を予防します。
次に、結紮糸を使用して伏在動脈を持ち上げ、24ゲージの針を使用して小さな動脈切開術を行います。次に、切開フラップを持ち上げ、静脈ピックまたはガイド針を動脈の内腔にゆっくりと挿入します。次に、動脈塞栓切除カテーテルを伏在動脈に慎重に挿入します。
破裂しないように優しくしてください。次に、静脈ピックを取り外し、動脈の微小血管クランプを解放します。怪我をするには、まずバルーンカテーテルを3番目のマークまで進めます。
これにより、腸骨分岐部から約2〜5センチメートル上に配置されます。次に、0.1ミリリットルの生理食塩水でバルーンを膨らませます。次に、カテーテルをクリップで留め、回転させながら6センチ引き戻して組織を損傷します。
後退したら、バルーンを収縮させます。そして、完全な内皮拡張を確実にするために、このプロセスをさらに2回繰り返します。次に、カテーテルを取り外し、すぐに動脈切開部位のすぐ上の結紮ループを結び、出血を止めます。
次に、傷口の穿孔の周りに適切な消毒剤を塗布し、血栓を綿棒で拭き取ります。最後に、皮膚の切開部を閉じ、手術部位をポビドンヨード溶液で消毒します。次に、2番目のカテーテルを使用して、反対側の腸骨動脈で外科的手順全体を繰り返します。
手術後、まずウサギの側面からアブトニック軟膏をきれいにします。次に、スルファドキシンとトリメトプリムを投与します。次に、ヘディングパッドを装着したウサギを清潔なリカバリーケージとモニタリングパッチおよびクリップに移します。
動物が体外臥位を取り戻し、歩行できるようになったら、自宅のケージに戻します。疼痛管理のために、ブプレノルフィンを提供します。次に、必要な限り動物にアテローム発生食を与え始めます。
手術後2〜4週間で早期に細い亜麻を収穫するには、まずウサギに麻酔をかけ、次に枢機卿間切開でウサギを安楽死させます。次に、腹部を開き、後腹膜を露出させます。次に、大動脈を腸骨分岐部に向かってトレースし、分岐部の上に結びます。
続いて、周囲の組織を慎重に除去し、両方の腸骨動脈を分離します。次に、両方の動脈を解剖し、氷のように冷たいPBSに浸します。そこで、鉗子を使用して血栓を取り除き、各動脈を46のセグメントに分割します。
次に、OCT化合物を含む型にセグメントをすぐに埋め込み、組織を液体窒素で凍結します。組織をマイナス80°Cで保存し、その後、標準的な方法を使用して厚さ5ミクロンの切片を染色します。腸骨動脈のバルーン損傷は、1時間以内に合併症なく成功裏に行われました。
ウサギは1時間以内に回復し、および/または大幅な体重減少なしに健康に見えました。術後の合併症は発生しませんでした。そして、4週間のアテローム発生食の後、ウサギはすべて高コレステロール血症になりました。
バルーン損傷とコレステロール食の組み合わせにより、血管壁の構造変化が起こり、2週間でアテローム性薬物性プラックスが発症しました。無傷の腸骨動脈とバルーンで損傷した腸骨動脈を同じ動物から分離し、比較しました。亜麻は、脂質の浸潤だけでなく、平滑筋の音の移動と増殖によって特徴付けられました。
亜麻は損傷した血管で成長し続けますが、内腔のサイズは縮小し続けます。その結果、4週間で非常に顕著な変化が現れた。2週間後と4週間後、形態測定による定量では、内膜中膜の厚さの増加、プラーク面積の増加、内腔面積の減少、そして最後に脂質蓄積の増加が明らかになりました。
α平滑筋アクチン抗体による染色は、筋アクチンと反応し、血管平滑筋細胞を同定します。さらに11種類のモノクロナル抗体で染色すると、マクロファージの細胞質が明らかになります。これらの染色を合わせると、平滑筋細胞とマクロファージの両方が損傷した血管のアテローム性動脈硬化性プラークに増殖する程度が明らかになります。
このビデオを見た後、あなたは自動車の安全性をよく理解し、ウサギの腸骨動脈に暴力的な怪我を簡単に行うことができるはずです。アテローム発生食によるこの損傷は、プラークの腸骨動脈の発達を時間通りに均質に進行させます。
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概要
このプロトコルでは、ウサギの左腸骨動脈の内皮を外科的に損傷させ、アテローム形成食事を投与することで、アテローム性動脈硬化プラークを誘発する方法について解説します。腸骨動脈はヒトの冠動脈と類似しているため、プラーク形成の研究において適切なモデルとなります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 動脈硬化
- 動物モデル
- 心血管研究
背景
- 動脈硬化は、工業化社会における主要な死因となっています。
- プラーク形成を理解することは、予防戦略を開発する上で極めて重要です。
- ウサギの腸骨動脈は、ヒトの冠状動脈と解剖学的な類似性があるため、適切なモデルとなります。
- 本研究は、誘発された動脈硬化がさまざまなエンドポイントに及ぼす影響を評価することを目的としています。
研究目的
- 研究目的でウサギにアテローム性動脈硬化プラークを誘発すること。
- プラークの形成および破裂のメカニズムを調査すること。
- 新しい治療デバイスや介入法の有効性を評価すること。
使用した手法
- 左腸骨動脈における内皮の外科的破壊。
- プラーク形成を促進するための、ウサギへのアテローム形成食の投与。
- 腸骨動脈と大動脈におけるプラーク組成の比較。
- 市販デバイスを用いた形態計測的および血管造影的なエンドポイントの評価。
主な結果
- ウサギモデルにおける動脈硬化プラークの誘導に成功。
- Aurelien Frobertによる手順の実演。
- 腸骨動脈と大動脈におけるプラーク特性の比較。
- 動脈硬化における治療的介入の可能性に関する知見。
結論
- ウサギ腸骨動脈は、アテローム性動脈硬化の研究において有用なモデルである。
- 本手法は、プラーク管理のための新しい治療法の評価に寄与し得る。
- これらの知見が持つ意味を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
業界における実用的な関連性
ウサギ腸骨動脈バルーン傷害モデルは、アテローム性動脈硬化プラークの形成を促進し、2週間という短期間で治療介入の迅速な評価を可能にします。このアプローチは、ヒトの冠動脈病変を模倣した再現性があり疾患に関連したシステムを提供することで、心血管系薬剤開発におけるターゲットの検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。本モデルは、薬剤の有効性と安全性を評価するための定量的な形態計測学的および血管造影的なエンドポイントを提供し、前臨床研究における予測信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：臨床的に関連のある動脈床において、制御された内皮損傷と脂質蓄積を誘導することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：ターゲットエンゲージメント研究を支援するため、一貫したアテローム性動脈硬化病変を生成するための標準化され再現性のある手法を提供する。
- 戦略的価値：プラークの形態およびバイオマーカーの発現に基づいた迅速なゴー/ノーゴー判断を可能にし、ターゲット検証のタイムラインを短縮する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：内膜・中膜厚、脂質領域、マクロファージ浸潤などの定量可能なプラーク指標を生成し、アッセイ読み取りの標準化を可能にする。
- 運用上の価値：死亡率を低く抑えつつ、病変形成の高い成功率を実現し、拡張可能なスクリーニングキャンペーンを支援する。
- 戦略的価値：プラークの安定化、炎症、および脂質蓄積に対する薬物効果を評価するためのアッセイ準備を容易にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 平滑筋細胞の増殖やマクロファージ由来の泡沫細胞を含む、ヒトに近いプラーク組成を備えた疾患関連モデルを提供します。
- 運用上の価値： 定められた間隔（例：2週間および4週間）での形態計測による定量化を通じて、プラーク進行の縦断的モニタリングを可能にします。
- 戦略的価値： 病変の特徴と治療反応を相関させることで、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合性を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、迅速かつ定量的な動脈硬化モデルを提供することで、初期のターゲットバリデーションから前臨床段階の有効性評価に至るまで、心血管疾患の創薬コンティニュアムをサポートします。
- 探索生物学：腸骨動脈における誘導性かつ時間依存的なプラーク形成を通じて、アテローム形成経路の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のある病変形成と、管腔面積の減少や内膜肥厚などの測定可能なエンドポイントにより、標準化された化合物評価を可能にします。
- 分析：形態計測および血管造影による出力（例：プラーク面積、脂質蓄積）を提供し、治療群間での客観的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒトの冠動脈に類似した病理をモデル化し、プラーク組成に対するデバイスや薬剤の効果の評価を可能にすることで、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：複数のプロジェクトにわたる心血管治療薬の反復的な試験のための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：プラーク形成経路に関するメカニズム的な知見を提供し、ターゲット検証における不確実性を低減します。
- 運用の価値：定義された手術および食事プロトコルにより、高い成功率とともに再現性と標準化を保証します。
- 戦略的価値：前臨床試験のタイムラインを加速させ、早期の生物学的リスク低減を通じて後期段階での失敗リスクを軽減し、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：プラーク修飾効果と安全性プロファイルに基づいた、リスク調整後の候補薬の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- げっ歯類の血管外科手術、麻酔、および術後ケアに関する専門知識が必要です。
- バルーンカテーテル、手術プラットフォーム、およびエンドポイント解析のための画像診断または組織学的解析インフラへのアクセスに依存します。
- 損傷の長さ、食事期間、および組織処理の一貫性を確保するため、チーム間での標準化が必要です。
- 適応にあたっては、種特有の脂質代謝や、ヒトの疾患と比較した際のプラーク組成の違いを考慮する必要があります。
- 実用上の制限として、誘導期間が2週間であるため、進行したヒトの動脈硬化で見られる慢性的なプラークの複雑性や石灰化を捉えきれない可能性があります。
