3Dで栽培ネイティブ腸とのCaco-2細胞において上皮輸送タンパク質の機能および発現を研究するための方法

このプロトコルの全体的な目標は、腸内Caco-2細胞を3次元で増殖させ、セロトニントランスポーター調節の研究におけるUssingチャンバーの使用を実証することです。ここに示す方法は、腸内セロトニントランスポーターであるSERTがどのように制御されているかなど、上皮輸送分野における重要な質問に答えることができます。3D Caco-2の主な利点は、細胞間および細胞間マトリックスの相互作用を単層よりも正確に反映することです。

また、Ussingチャンバー技術により、腸管上皮内の輸送機能を正確に測定することができます。3D、Caco文化の意味は、これらのモデルが輸送機能の変化に関連する疾患に対する薬剤のスクリーニングを可能にするため、治療法の発見にまで及びます。この方法は、セロトニントランスポーターの制御に関する洞察を提供しますが、ナトリウムや塩化物などの他の電解質トランスポーターの研究にも適用できます。

これらの技術を視覚的にデモンストレーションすることは、血清筋層を剥がし、腸粘膜をUssingチャンバーにマウントすることを学ぶのが難しいため、非常に重要です。3D Caco-2細胞の手順を実演するのは、インストラクターのIshita Chatterjee氏と、当グループのポスドクフェローであるAnoop Kumar氏です。マウス回腸からの血清筋層の剥離を実証するのは、私の研究室の上級研究専門家であるSangeeta Tyagiです。

また、剥離した粘膜のマウントとUssingチャンバーへの挿入を実演するのは、私の研究室のインストラクターであるShubha PriyamvadaとArivarasu Natarajanです。まず、成長因子を減少させたゼラチン状タンパク質溶液を、摂氏4度の冷蔵庫で氷上で一晩解凍します。解凍したら、1ミリリットル、または500マイクロリットルのアリコートを準備します。

培養の日には、氷の上でチャンバー付きスライドを予冷します。次に、30マイクロリットルのゼラチン状タンパク質溶液を8ウェルチャンバーガラススライドの各ウェルに加え、均等に広げます。ゼラチン状混合物をチャンバースライドまたはプレートにめっきする際には、細胞が剥離する可能性があるため、気泡の形成を避けるように注意する必要があります。

培養皿を摂氏37度の細胞培養インキュベーター内に15〜30分間置き、溶液が固化するまで待ちます。次に、トリプシンを使用して、コンフルエントなCaco-2細胞を培養フラスコから分離します。次に、血球計算盤で細胞をカウントし、摂氏4度で500 gで5分間遠心分離します。

得られた細胞ペレットを3D Caco-2培地に再懸濁して、所望の密度の懸濁液を得る。準備した細胞懸濁液を使用して、ウェルあたり4,000個の細胞をガラスチャンバースライドに播種し、摂氏37度の5%二酸化炭素加湿インキュベーターで12〜14日間成長させます。細胞を染色するには、まず培地を吸引し、400マイクロリットルの2%PFAで細胞を固定します。

細胞を室温で20分間固定し続けます。細胞をPBSで2回洗浄した後、PBS中の0.5%Triton溶液で15分以内に細胞を透過処理します。細胞をPBSグリシン緩衝液で2回すすぎ、透過処理した細胞をIF緩衝液で室温で10分間洗浄します。

IFバッファー中の5%正常ヤギ血清を使用して細胞をブロックします。次に、1%ヤギ血清を添加したIFバッファーで希釈した200マイクロリットルの一次抗体で細胞をインキュベートし、室温で1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、IFバッファーで細胞を3回洗浄します。

洗浄した細胞を、1%ヤギ血清を添加したIFバッファーで希釈した200μLの二次抗体と室温で1時間インキュベートします。細胞をIFバッファーで10分間3回洗浄します。スライドガラスのチャンバーを取り外すには、まずスライドをスライドベースホルダーに置き、次に白いリフターをウェルの端に接触するまでホルダーにスライドさせます。

チャンバーをそっと引いてスライドから取り外します。スライドを光から保護するために、カバー付きのブラックボックスを使用します。スライドを低速のフェード防止媒体で取り付け、カバースリップで覆います。

スライドを室温で10分間乾燥させた後、イメージングする前にマニキュアで密封します。テキストプロトコルに記載されている手順に従ってマウス回腸を分離します。次に、はさみを使用して、腸を縦方向に開きます。

得られた組織切片を、1マイクロモルのインドメタシンを含む氷冷ガス化KBR緩衝液で10分間インキュベートします。約1cmの長さの腸切片を粘膜側を下にして、厚さ0.5cmの7%アガロースまたは硬化シリコーンエラストマーを含むプレートに固定します。底面照明付きの解剖実体顕微鏡を使用して、血清筋層を剥がします。

次に、羽毛メスの刃で漿筋層を切断します。細い鉗子を使用して、腸の縦軸に沿って層の端を持ち上げます。最後に、粘膜をスライダーのピンに慎重に取り付けます。

剥がれた粘膜組織の端を持って、裂けないようにします。剥離した腸骨粘膜をスライダーのピンに取り付ける際には、ピンヘッドの組織が裂けないように、また組織の端を傷つけないように注意が必要です。組織処理の前に、95%酸素、5%二酸化炭素でガス化したクレブス溶液を調製します。

次に、溶液をUssingチャンバーに注ぎます。エネルギー基質として10マイクロモルタルのグルコースを漿膜浴に加え、浸透圧バランスを維持するために10マイクロモルのマンニトールを粘膜浴に加えます。続いて、粘膜をマウントしたスライダーをチャンバーに挿入し、組織の頂端側と基底外側の両方をクレブス溶液にさらします。

浴中で回腸組織を10分間平衡化します。次に、頂端側を 10 マイクロモルのフルオキセチンで 30 分間前処理して、粘膜から漿膜へのフラックスを測定します。最終的に、組織の基底外側側を1ミリリットルあたり10ナノグラムのTGFベータ1で1時間処理し、次に頂端側を20ナノモルのトリチウム5-HTで30分間インキュベートします。

粘膜から漿膜へのフラックス率を計算するには、漿液リザーバーから0.75ミリリットルのアリコートを収集し、それらを同じ容量の浴媒体と交換して、粘膜全体の静水圧差を防ぎます。組織に蓄積したトリチウム化された5-HTを定量化するには、スライダーから粘膜を取り出します。氷冷したKRBバッファーで一度洗浄し、ガラス製培養チューブに入れます。

粘膜を0.5ミリリットルの10%KOHで摂氏37度で一晩インキュベートし、組織を溶解します。次に、液体シンチレーションカウンターを使用して、三重のライセートの150マイクロリットルアリコートの放射能を測定します。Bradford法を使用して、溶解物の3〜5マイクロリットルアリコート中のタンパク質濃度を測定します。

ここに示されているのは、アクチンについて染色された3D培養で増殖したCaco-2シストと、アクチン、核、およびSERTタンパク質について同時に染色されたCaco-2 3Dシストです。SERTは、管腔膜と頂端下コンパートメントに見えます。Caco-2 3D球体が2次元Caco-2単層よりも優れていることをさらに確認するために、SERTタンパク質発現のウェスタンブロット分析を行いました。

その結果、Caco-2 3D球体におけるSERTタンパク質の発現が、2次元Caco-2細胞と比較して増強されていることが示されました。最後に、Ussingチャンバーシステムを使用して、TGFベータが粘膜から漿膜へのフラックスを増加させることを示し、管腔膜からの5-HT取り込みの増加と回腸粘膜で観察された5-HT蓄積の増加を反映しました。このような知見は、管膜でのSERT発現に対応するフルオキセチン治療に対する5-HT取り込みの観察された感度によって裏付けられています。

一度習得すると、回腸粘膜をストリッピングしてマウントするこの技術は15分で完了することができます。この手順を採用する際には、動物から取り除くと、extravio腸の準備は生存能力が限られており、最大3時間続く可能性があることを覚えておくことが重要です。3D Caco-2嚢胞は、膜輸送イベント、遺伝子発現、上皮トランスポーターのタンパク質間相互作用など、さまざまな研究に利用できます。

その開発後、3D Caco-2技術は、腸内輸送の分野の研究者が流体の動きを探求し、大胆な疾患の病態生理学を研究するための道を開きます。放射能を扱う作業は非常に危険である可能性があり、PPEの使用や適切な除染手順などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。このビデオを見れば、Caco-2細胞を3D培養で増殖させ、これらの培養物を利用して上皮トランスポーターの発現を調べることができます。

また、Ussingチャンバーを利用して、ネイティブマウス腸内のセロトニン輸送機能を研究することもできます。