3Dで栽培ネイティブ腸とのCaco-2細胞において上皮輸送タンパク質の機能および発現を研究するための方法

このプロトコルの目的は、腸管Caco-2細胞を三次元的に培養し、セロトニントランスポーターの調節に関する研究におけるUssingチャンバーの使用法を実証することです。ここで示す手法により、腸管セロトニントランスポーター（SERT）がどのように調節されるかなど、上皮輸送分野における重要な疑問に答えることができます。3D Caco-2の主な利点は、単層培養よりも細胞間および細胞・細胞外マトリックス間の相互作用をより正確に反映できる点にあります。

また、Ussingチャンバー法を用いることで、腸上皮における輸送機能の精密な測定が可能になります。3D Caco-2培養の意義は、輸送機能の異常に関連する疾患に対する薬剤のスクリーニングを可能にするため、治療薬の探索へと広がります。本手法はセロトニントランスポーターの調節に関する知見を提供しますが、ナトリウムやクロライドなどの他の電解質トランスポーターの研究にも適用可能です。

漿膜筋層の剥離や腸粘膜のUssingチャンバーへの装着は習得が困難であるため、これらの技術を視覚的に提示することが不可欠です。3D Caco-2細胞の手順のデモンストレーションは、インストラクターのIshita Chatterjeeと、当グループのポストドクトラルフェローであるAnoop Kumarが行います。マウス回腸からの漿膜筋層の剥離のデモンストレーションは、私の研究室のシニアリサーチスペシャリストであるSangeeta Tyagiが行います。

また、剥離した粘膜の固定およびUssingチャンバーへの挿入については、私の研究室のインストラクターであるShubha PriyamvadaとArivarasu Natarajanが実演します。まず、成長因子除去ゼラチン質タンパク質溶液を、4 °Cの冷蔵庫内で一晩氷上に置いて融解させます。融解後、1 mLまたは500 µLずつ分注して準備します。

培養当日、チャンバースライドを氷上で予冷します。次に、8ウェルチャンバーガラススライドの各ウェルにゼラチン状タンパク質溶液を30 microliters加え、均一に広げます。チャンバースライドやプレートにゼラチン混合液を播種する際は、細胞が剥離する可能性があるため、気泡が形成されないよう注意してください。

培養皿を37°Cの細胞培養インキュベーターに15〜30分間置き、溶液を凝固させます。次に、トリプシンを用いて、コンフルエントなCaco-2細胞を培養フラスコから剥離させます。その後、ヘモサイトメーターで細胞数を計測し、4°C、500 ×gで5分間遠心分離します。

得られた細胞ペレットを3D Caco-2培地で再懸濁し、目的の密度の細胞懸濁液を作成します。調製した細胞懸濁液を用いて、ガラスチャンバースライドの1ウェルあたり4,000個の細胞を播種し、37°C、5%二酸化炭素加湿インキュベーター内で12〜14日間培養します。細胞を染色するため、まず培地を吸引し、400 µLの2% PFAで細胞を固定します。

室温でさらに20分間、細胞を固定します。PBSで細胞を2回洗浄した後、0.5% Triton含有PBS溶液を用いて15分以内に透過処理を行います。PBSグリシン緩衝液で細胞を2回すすぎ、その後、透過処理した細胞をIF緩衝液中で室温で10分間洗浄します。

IFバッファーに5% normal goat serumを添加した溶液を用いて細胞をブロッキングします。次に、1% goat serumを添加したIFバッファーで希釈した一次抗体200 microlitersを細胞に加え、室温で1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、IFバッファーで細胞を3回洗浄します。

洗浄した細胞を、1%の山羊血清を添加したIF緩衝液で希釈した二次抗体200 µLとともに、室温で1時間インキュベートします。IF緩衝液を用いて、10分間の洗浄を3回行います。ガラススライドからチャンバーを取り外すには、まずスライドをスライドベースホルダーにセットし、次にホワイトリフターをホルダーに沿ってウェルの端に接触するまでスライドさせます。

チャンバーをゆっくりと引き抜いてスライドから取り除きます。遮光用の黒いボックスを使用して、スライドを光から保護してください。スライドを緩慢消光剤で封入し、カバーガラスで閉じます。

スライドを室温で10分間乾燥させた後、イメージングの前にマニキュアで封することで密封します。テキストプロトコルに記載されている手順に従い、マウスの回腸を単離します。その後、はさみを用いて腸管を縦方向に切開します。

得られた組織切片を、1 µMのインドメタシンを含む氷冷のgassing KBRバッファー中で10分間インキュベートします。約1 cm長の腸管切片を、粘膜側を下にして、厚さ0.5 cmの7%アガロースまたは硬化シリコンエラストマーを含むプレートにピンで固定します。透過照明を備えた解剖用実体顕微鏡を用いて、漿膜筋層を除去します。

次に、フェザーメスで漿膜筋層を切断します。微細ピンセットを使用して、腸の長軸に沿ってこの層の端を持ち上げます。最後に、粘膜をスライダーのピン上に慎重に固定します。

剥離した粘膜組織を破れないように端を持って保持します。剥離した回腸粘膜をスライダーのピンに固定する際は、ピンの頭で組織を破らないよう注意し、組織の端への損傷を最小限に抑えてください。組織の処理に先立ち、95% oxygen、5% carbon dioxideをバブリングさせたKrebs溶液を準備します。

次に、溶液をUssingチャンバーに注ぎます。漿膜側バスにはエネルギー基質として10 µMのグルコースを、粘膜側バスには浸透圧バランスを維持するために10 µMのマンニトールを加えます。続いて、粘膜を装着したスライダーをチャンバーに挿入し、組織の頂端側と基底側をともにKrebs溶液にさらします。

回腸組織をバス内で10分間平衡化します。次に、粘膜側から漿膜側へのフラックスを測定するため、頂端側を10 µMのフルオキセチンで30分間前処理します。最後に、組織の基底側を10 ng/mLのTGF beta 1で1時間処理し、その後、頂端側を20 nMのトリチウム標識5-HTで30分間インキュベートします。

粘膜側から漿膜側へのフラックス率を算出するために、漿膜側リザーバーから0.75 mLのアリコートを回収し、粘膜を挟んだ静水圧差を防ぐため、同量のバス液で置換します。組織に蓄積したトリチウム標識5-HTを定量するため、スライダーから粘膜を取り出します。氷冷KRB緩衝液で1回洗浄し、ガラス製培養チューブに入れます。

組織を溶解させるため、粘膜を0.5 millilitersの10%KOH中で37 degrees Celsiusにて一晩インキュベートします。その後、溶解液を150 microliterずつ分注し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を3回繰り返し測定します。また、Bradford法を用いて、溶解液の3〜5 microliter分注サンプル中のタンパク質濃度を測定します。

ここでは、アクチンで染色された3D培養のCaco-2シストと、アクチン、核、およびSERTタンパク質を同時に染色したCaco-2 3Dシストを示しています。SERTは腔側膜およびアピカル下コンパートメントに認められます。Caco-2 2D単層培養に対するCaco-2 3Dスフィアの優位性をさらに確認するため、SERTタンパク質発現のウェスタンブロット解析を実施しました。

その結果、Caco-2 3Dスフィアでは、2D Caco-2細胞と比較してSERTタンパク質の発現が亢進していることが示されました。最終的に、Ussingチャンバーシステムを用いて、TGF betaが粘膜側から漿膜側へのフラックスを増加させることが示され、これは管腔膜からの5-HT取り込みの増加と、回腸粘膜で観察された5-HT蓄積の亢進を反映しています。このような知見は、管腔膜上のSERT発現に対応する、フルオキセチン処理に対する5-HT取り込みの感受性が観察されたことによって支持されています。

この回腸粘膜の剥離およびマウントの手法を習得すれば、15分で完了させることができます。本手順を採用する際は、動物から摘出した後、腸管外の標本は生存能力が限定的であり、最大で3時間しか持続しないことに留意することが重要です。3D Caco-2 シストは、膜輸送イベント、遺伝子発現、あるいは上皮輸送体のタンパク質-タンパク質相互作用など、さまざまな研究に利用可能です。

3D Caco-2技術の開発により、腸管輸送分野の研究者は、液体移動の探索や腸管疾患の病理学的研究を行うことが可能になります。放射性物質の取り扱いは極めて危険であるため、個人用保護具（PPE）の使用や適切な除染手順などの予防策を必ず講じてください。このビデオを視聴することで、Caco-2細胞を3D培養し、これらの培養系を用いて上皮輸送体の発現を調査する方法を習得できます。

また、Ussingチャンバーを用いて、マウスの生体内腸管におけるセロトニントランスポート機能を研究することも可能です。