びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

この迅速な死後細胞培養プロトコルの全体的な目標は、びまん性内因性橋グリオーマの耐久性のある患者由来の細胞培養を生成して、DIPGの効果的な治療法を理解し、最終的に開発するために必要な実験を容易にすることです。この方法は、特定の薬剤が異なる患者由来の培養物に作用するかどうかなど、びまん性内因性橋グリオーマの基本的な生物学と治療戦略に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、患者由来の細胞の生物学を直接研究できることです。

この技術の意味は、疾患のさまざまな遺伝的サブタイプにわたるさまざまな治療戦略のテストを可能にするため、DIPGの治療にまで及びます。この方法はDIPGに関する洞察を提供しますが、他の小児高悪性度神経膠腫、成人神経膠芽腫、または他の中枢神経系腫瘍などの他の疾患にも適用できます。一般に、この手法に不慣れな人は、効率的な方法で剖検サンプルを調達して迅速に処理することが難しいため、苦労するでしょう。

サンプル調製に先立ち、組織培養フード、カミソリの刃、湾曲した止血器、その他の非滅菌ツールをUV光の下で1時間滅菌し、以下のすべてのステップを滅菌条件下で実行します。次に、組織を100mm×20mmの高壁の細胞培養皿に移します。輸送時に残った培地を取り出し、10〜15ミリリットルの冷培養培地と交換します。

次に、湾曲した止血器を使用してカミソリの刃をつかみ、血管や髄膜を取り除きながら組織を細かく刻みます。最終的な組織片は1ミリメートル未満である必要があります。その後、組織をきれいな50ミリリットルの円錐管に移します。

細胞培養皿を追加の5ミリリットルの冷培養培地で洗浄し、サンプルを円錐管に移します。必要に応じてこの洗浄手順を繰り返して、残りの組織を移します。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、サンプルを4〜5回穏やかに粉砕します。

大きな組織片がチューブの底に沈殿するのを待ちます。必要に応じて、サンプルを1分間短時間遠心分離します。解離した画分を回収するには、上清と濾液を100ミクロンのフィルターで取り出し、機械的解離とラベル付けされた新しい50ミリリットルの円錐管に入れます。

元の円錐形チューブの上にフィルターを反転させ、培地で洗浄して組織片を回収します。続いて、機械的解離画分を5分間遠心分離します。その後、ペレット化した機械的解離画分から上清を除去し、組織を冷温培地に再懸濁します。

機械的解離円錐管に5ミリリットルを超える組織がある場合は、組織を他の50ミリリットルの円錐管に分割して、どのチューブにも5ミリリットルを超える組織が含まれないようにします。次に、機械的に解離した画分をショ糖勾配遠心分離ステップまで氷上に保存します。この手順では、残りの組織片を含む円錐形のチューブを5分間遠心分離します。

その後、上清を取り除き、予め温めた酵素消化液を追加します。これは、組織1ミリリットルごとに5ミリリットルの消化液があるようにします。次に、円錐形のチューブ蓋を実験用フィルムで密封し、反応を37°Cのローテーターで30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを穏やかに粉砕します。

10ミリリットルの血清ピペットを使用して、サンプルを6〜8回上下にピペットで移動し、過剰な気泡が発生しないようにします。次に、ピペットの端に1,000マイクロリットルのピペットチップを追加し、サンプルをさらに6〜8回回転させます。残りのチャンクがチューブの底に沈殿するのを待ちます。

次に、細胞を懸濁したままの上清を100ミクロンのフィルターで濾過し、Enzymatic Dissociationとラベル付けされた新しい50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、氷上に保存します。その後、酵素解離チューブを5分間遠心分離し、ショ糖勾配遠心分離を続けます。サンプルがまだ溶液に懸濁している場合は、5分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、カルシウムとマグネシウムを含まない20ミリリットルの冷たいHBSSに組織を再懸濁します。次に、冷たいHBSSで容量を最大25ミリリットルにします。25ミリリットルの1.8モルスクロース溶液をゆっくりと加え、チューブを反転させて混合します。

これにより、0.9モルのショ糖勾配が得られます。その後、サンプルを10分間中断せずに遠心分離します。できるだけ多くのショ糖スクロース溶液でミエリンの破片を慎重に吸引します。

次に、カルシウムとマグネシウムを含まない30ミリリットルの冷たいHBSSを加え、穏やかに混合してサンプルを洗浄します。その後、5分間遠心分離します。この手順では、洗浄上清を取り除きます。

5ミリリットルのACK溶解バッファーを加え、細胞ペレットを静かに再懸濁し、チューブを室温で1分間渦巻かせます。次に、カルシウムとマグネシウムを含まない30ミリリットルの冷たいHBSSを追加して溶解を急冷します。その後、5分間遠心分離します。

成長因子を含む10〜15ミリリットルの温かい完全TSMに最終細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー排除を使用して血球計算盤で生存細胞密度を定量化します。その後、最終的な細胞懸濁液を新しいT75培養フラスコに移します。成長因子を隔日で追加して、全体的な成長因子レベルを維持し、腫瘍細胞のニューロスフェアの発達を監視します。

ここでは、サンプルが培養の初期段階から耐久性のある培養までどのように現れるかについて、さまざまな例を紹介します。当初、プレーティング培養および初期培養物は、多くの場合、多くの生存細胞を含んでいないように見えます。さらに、初期の細胞クラスターは、ニューロスフェアに通常関連するコントラストの程度を示さないことがよくあります。

しかし、これらの細胞クラスターの最初の通過は、細胞クラスターの逆フィルタリングと組み合わされて、球体を形成することができる健康な腫瘍細胞を単離することができます。濾液には通常、残った破片が含まれています。これらの患者由来のサンプルは、その後、複数の継代のために培養に保持することができます。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、酵素解離を除くすべてのステップでサンプルが低温に維持されていることを確認し、サンプルの外傷性の取り扱いを最小限に抑えることが重要です。この手順に続いて、in vitro薬物スクリーニングや同所異種移植などの追加の研究を実施して、DIPGの病理生物学に関するその後の質問に答えることができます。

その開発後、この培養技術は、小児神経腫瘍学の研究者がDIPGの子供たちのための新しい治療法を探求する道を開きました。このビデオを見れば、脳腫瘍サンプルの迅速な死後細胞培養プロトコルの実施方法について理解できるはずです。人間の組織を扱う作業は危険な場合があり、個人用保護具の着用や滅菌技術などの予防措置を常に活用する必要があることを忘れないでください。