Name: びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ、びまん性内因橋膠腫（DIPG）の迅速な死後細胞培養法。機械的・酵素的解離と蔗糖密度勾配遠心分離を用いて患者由来細胞培養を確立し、腫瘍生物学と治療戦略の研究を支援します。

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作者は感謝してマッケナクレア基金、神経疾患および脳卒中（NINDS K08NS070926とR01NS092597）の国立研究所、国防総省（NF140075）、カリフォルニア再生医療研究所（CIRM RB4-06093とRN3-06510）、アレックスのレモネードからの支援を認めます財団スタンド、硬化はフィオナペネロペ、ウェイランドヴィラールDIPG財団、ディランジューエットのメモリで今すぐ財団とDIPG共同、ライラNsouli財団、解明小児がん、小児脳腫瘍財団、マシュー・ラーソン財団、V財団、ゴドフリーファミリーファンド開始します、コナー・ジョンソン、ゾーイガネーシュ、ディランフリック、アビゲイル・ジェンセン、そしてジェニファー・クランツメモリアル基金、N8財団、バージニア州および癌研究のためのDKルートヴィヒ基金、小児におけるスタンフォードアンT.ロバート・M・ベース寄附学部奨学金では子供の健康研究所がんや血液疾患。

このプロトコルは、すべての患者データの適切な脱識別とし、人間の福祉のためのすべて、機関、国、国際的なガイドラインに基づいて、当社の倫理審査委員会の承認を得て行われています。患者の家族から事前にこのプロトコルでの作業に適切なすべての施設内倫理委員会の承認とインフォームドコンセントを取得します。 1.取得組織サンプル注：このプロトコルの重要なコンポーネントは、剖検時に直ちに開始する組織の寄付の適切な取り扱いを必要とします。サンプル全体の生存率は、すぐに抗生物質/抗真菌剤を補充した適切な寒培地に組織を移す、死後間隔（PMI）を最小輸送中濡れた氷の上にサンプルを維持し、プロトコルを通して滅菌技術を維持することに大きく依存しています。 <ol><li>通知されると差し迫った寄付の、サンプル採取キットを準備します。直接組織サンプルの戻り輸送のために使用することができる断熱容器と梱包箱を使用して、以下の物質が含まれます。 <ol><li>滅菌手袋、ドレープ、およびメスを含む無菌調製のための材料を含みます。 </li><li>氷や冷たいパックと断熱容器に30mLの出荷メディアを含む10の滅菌50 mLコニカルチューブ - 8が含まれます。 注：任意の標準的な細胞培養培地が動作することができますが、最高のサンプルの生存率は、抗生物質/抗真菌を補ったのHibernate-Aを用いて得られます。 </li><li>他の分析（ 例えば、固定剤）のための任意の更なるサンプルチューブが含まれます。 </li><li>剖検は、研究者のサイトで実行されない場合は、明らかに腫瘍サンプルを収集する方法を述べた文書が含まれます。これは、このような、無菌性を維持する湿った氷上でサンプルチューブを保持し、TUとして中脳及び延髄からのサンプルを含む、などの詳細が含まれてMOR細胞は、しばしば、これらの領域に侵入します。 </li></ol></li><li>剖検時の無菌性を維持します。頭蓋内部の無菌脳を考えるので、頭蓋骨を開いたら（変更手袋を含む）を滅菌技術を観察します。肌や髪の混入を避けることが重要です。 </li><li> （橋の「腹」、 補足図1を参照）腹側から腫瘍を解剖。滅菌メスで、腫瘍から小さな1cmの塊をカットし、すぐに冷たい出荷メディアに転送する（ステップ1.1.2で注意を参照）、濡れた氷の上に置きます。 40ミリリットルの各チューブ内の組織やメディアの最終容量で、その結果、各チューブに組織を10mLを置きます。 注：DIPGの場合では、腫瘍はびまん性脳橋と頻繁に脳幹の残りの部分に浸透します。橋から - （40 mLの組織30）と1から4のチューブ - 中脳および髄質から - （20 mLの組織10）各2チューブのような、典型的には3を含め、可能な限りサンプルをできるだけ多く集めます。 </li><li> SAMを収集中脳および髄質からplesは、多くの場合、多くの腫瘍細胞が含まれている橋に並置されました。 </li><li>サンプル採取後、断熱容器に濡れた氷の上のサンプルO / Nを出荷。凍結が細胞を殺すように、ドライアイス上のサンプルを出荷しないでください。 </li></ol>サンプル処理のため2.準備<ol><li>試料の調製を開始する前に、1時間、UV光下でカミソリ刃、湾曲止血剤、および他の非滅菌ツールと共に組織培養フードを滅菌します。文化の汚染を防止するために、無菌条件下で、以下の手順をすべて実行します。 </li><li>準備し、滅菌フィルターソリューションを提供しています。 <ol><li> 1.8 Mのショ糖溶液を調製し、300 mLの蒸留水中に308.07グラムのスクロースを溶解させます。カルシウムまたはマグネシウムを含まない50mLの10倍Hank&#39;s緩衝食塩液（HBSS）を加え、蒸留水を用いて500 mLの総容量をもたらします。 4℃で保存。 </li><li>酵素消化溶液を調製し、5を取ります細分化した組織のすべての10 mLのためのカルシウムとマグネシウムと 0 mLのHBSSおよびI（最終濃度を50μg/ mL）を、500μLの2.5mg / mLのコラゲナーゼI / IIおよびディスパーゼ溶液（最終濃度25 500μLを5mg / mLのデオキシリボヌクレアーゼを追加μgの/ mL）に溶解し、500μLの1 M HEPES緩衝液。 37℃の水浴中でPrewarm消化溶液。 </li><li>腫瘍幹メディア（TSM）ベースを準備するには、250ミリリットルたNeurobasal-A、250 mLのダルベッコ改変イーグル培地を混ぜる：栄養混合F12（DMEM / F12）、5 mLの100倍の抗生物質 - 抗真菌、5 mLの200 mMのL-アラニル-1-グルタミンジペプチド（グルタマックスA）、5mLのHEPESバッファー、5mLの100mMのピルビン酸ナトリウム、および5 mLの100×MEM非必須アミノ酸。 </li><li> TSMベースに以下のサプリメントを追加し、成長因子と完全なTSMを準備するには：50×B27サプリメントマイナスビタミンA（1：50）、ヒト上皮成長因子（H-EGF、20 ngの/ mL）を、ヒトの線維芽細胞増殖因子（H- FGF、20 ngの/ mL）を、ヒト血小板由来増殖因子AA（H-PDGF-AA、10ng / mLの）ヒト血小板由来成長因子BB（H-PDGF-BB、10ng / mLの）、およびヘパリン溶液（2 / mlの）。 </li></ol></li><li> 4°Cにスイングバケットローターを装備した遠沈管を予冷。 </li></ol> 3.機械的解離<ol><li>高壁100ミリメートルX 20ミリメートルの細胞培養皿に組織を転送します。出荷からメディアの残りを削除し、10と交換 - 15 mLの冷たい培養培地。 </li><li>明らかな血管や髄膜を除去しながらカミソリの刃を把握するために湾曲した止血剤を使用して、細かく組織をミンチ。 注：最終的な組織断片を1mm未満であるべきである（ 図1B参照）。 </li><li>きれいな50 mLコニカルチューブに組織を移します。さらに5 mLで細胞培養皿を洗う冷たい培養培地およびコニカルチューブに移します。残りの組織を転送するために、必要に応じて、この洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> （ - 5回4）10 mLの血清学的ピペットを用いて、優しくを粉砕します。より大きなTISSを許可しますチューブの底に沈殿するようにUEの断片。必要であれば、簡単に1分（350×gで、4°C）のためのサンプルを遠心します。 </li><li>機械的に分離画分を収集します。 <ol><li>上清を除去し、標識された新しい50 mLコニカルチューブに100μmのフィルターを通してそれをフィルタリングする「機械的解離。」元のコニカルチューブの上にフィルタを反転し、組織片を回収する培地で洗浄します。 </li><li> 5分間遠心（350×gで、4℃）のための「機械的解離」分数。 </li><li>ペレット化した「機械的解離」画分から上清を除去し、冷たい培養培地で組織を再懸濁します。 「機械的解離 &quot;コニカルチューブ内の組織のより5mLの存在する場合は、チューブがより5mLの組織を有していないように、他の50 mLコニカルチューブに組織を分割します。 </li></ol></li><li>ショ糖勾配遠心分離工程まで氷の上で機械的に解離した分画を保存（スイートP 5）。代わりに、機械的に解離した画分を酵素的解離のインキュベーション期間（ステップ4.4）の間にステップ5に進むことができます。 </li></ol> 4.酵素的解離<ol><li>残りのより大きな組織フラグメントを含むチューブ内の組織の5つ以上mLである場合、チューブはより5mLの組織を有していないように、他の新しい50 mLコニカルチューブに組織を分割します。 </li><li>遠心5分（350×gで、4℃）のために残りの組織フラグメントを含むコニカルチューブ（単数または複数）。 </li><li>上清を除去し、予め温め酵素消化液を追加し、すべての1mLの組織（5 mLの組織のための例えば、25 mLの消化液）のための5 mLの消化液が存在するように。 </li><li>実験用フィルムでコニカルチューブの蓋を密封し、37℃で30分間ローテータで反応をインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、（ 図1C参照）静かにサンプルを粉砕します。 <ol><li> 10mLの血清学的ピペットを使用して、ピペットサンプルアップと6ダウン​​ - 8回。過剰な気泡を発生させることは避けてください。 </li><li>ピペットの先端に千μLのピペットチップを追加し、追加の6粉砕する - 8回。 </li><li>残りのチャンクは、チューブの底に沈殿することを可能にします。削除し、まだ &quot;酵素的解離」と表示された新しい50 mLコニカルチューブに100μmのフィルターに通して懸濁した細胞と上清をフィルタリングし、氷上で保存します。 </li><li>大幅な組織断片が残っている場合、フラグメントへのカルシウムとマグネシウムでさらに10 mLのHBSSを追加し、ステップ3.5.1と3.5.2を繰り返します。 「酵素的解離」チューブに100μmのフィルターに通して、この最終溶液をフィルタリングします。 </li></ol></li><li> 5分（350×gで、4°C）のための「酵素的解離」チューブを遠心し、ショ糖勾配遠心分離に進みます。 </li></ol> 5.ショ糖勾配遠心<ol><li>サンプルは依然として溶液中に懸濁されている場合、centrifu5分（350×gで、4°C）のためのGE。 </li><li>カルシウムとマグネシウムを含まない20 mLの冷HBSSで上清と再懸濁組織を削除します。冷HBSS 25 mLの合計にボリュームを起動します。 </li><li>ゆっくりと25 mLの1.8 Mショ糖溶液を添加し、混合するためにチューブを反転。これは、0.9 Mショ糖勾配になります。 </li><li> 10分（800×gで、4°C）のためのブレーキなしで遠心分離します。遠心分離のブレーキを使用して（遠心分離前と後の試料の例については、 図1Dを参照）の勾配を破壊し、歩留まりを低下させます。 </li><li>慎重ミエリン破片とできるだけ多くの蔗糖液を吸引します。カルシウムとマグネシウムを含まない30 mLの冷HBSSを添加し、穏やかに混合することにより、サンプルを洗ってください。 5分（350×gで、4℃）遠心します。 </li></ol>前記ACK赤血球溶解<ol><li>洗浄上清を取り除きます。 5mLのACK溶解緩衝液を添加し、穏やかに細胞ペレットを再懸濁し、室温で1分間チューブを旋回。 </li><li>リットルをクエンチカルシウムとマグネシウムを含まない30 mLの冷HBSSを追加することによりysis。 </li><li> 5分（350×gで、4℃）遠心します。 </li></ol> 7.初期文化のメンテナンス<ol><li>成長因子と暖かい完全TSM 15 mLおよびトリパンブルー排除を使用して、血球計数器で生細胞密度を定量 - 10で、最終的な細胞ペレットを再懸濁します。 注：生細胞の範囲が広く組織の寄付の状況に応じて変化し、定量化が原因で残りの細胞の破片に、この初期の段階では困難な場合があります。理想的なケースでは、サンプルごとに百万生細胞を持つことを目指しています。過度のデブリは、T175フラスコ中の低密度でプレートのまま例中。 </li><li>新しいT75培養フラスコに、最終的な細胞懸濁液を転送します。 （ 図1Eおよび図2を参照）全体の成長因子レベルを維持し、腫瘍細胞のニューロスフェアの開発を監視するために一日おきに追加の成長因子でスパイク。 </li><li>また、プロセスフローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別を含めたさらなる分析のために酵素的に解離した細胞を、。 </li><li> （平均で3取る - 4週間、しかし限り、2ヶ月に数日の範囲）ニューロスフェアの現像後、破片の量を減らすために、100μmのナイロンメッシュフィルターを使用してサンプルフィルタを逆にします。 注：ろ液を、生存単一細胞または小さな球が存在する場合に、培養物中に維持されるべきです。 </li><li>最初の患者サンプルと比較し、継代しながら、DNAフィンガープリンティングを行うことにより、文化の完全性と純度を確認してください。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、インビトロの種々またはインビボ実験で使用することができ、患者由来の細胞培養物を、開発するための死後腫瘍組織寄付の迅速な処理のための方法が記載されています。そのため剖検試料での作業の性質上、サンプルの生存率を維持することは重要な課題を提起します。剖検する死後変化や組織の輸送に必要な時間を含むいくつかの要因は、可能な限り最小限に抑えますが、多くの場合、制御することが困難であるべきです。我々の経験では、6未満の死後変化 - 8時間（死亡の時に組織を氷冷出荷および輸送媒体に置かれている時間には）耐久性のある細胞培養を確立するための最善の機会をもたらしました。その後、24時間以内に実験室で組織を受信し、受信時に直ちに培養のためにそれを処理するのが最善です。 これらの稀な例の場所は広く変化するため、および組織検索ステップの品質が強く剖検を行うの物流が挑戦することができ、成功のチャンスに影響を与えます。多くの場合、6~8時間の時間枠を達成するためには、学術センターで組織採取を行うことは不可能です。その代わりに、IRB承認のプロトコルの下で葬儀場での腫瘍組織を回復するために、コールに組織回収サービスを持つことは、多くの場合、組織の回復のために、より好都合です。死の前にインフォームドコンセントを得ることは推奨されており、物流計画を容易にされます。組織検索（手袋、ドレープ、メス）のための明確かつ徹底的な指示や無菌電源で自己完結型の剖検キットを準備することを強くお勧めします。さらに、研究者、病理学者、および葬儀場の間で通信の明確なポイントを確立することが重要です。例えば、研究者は前剖検に病理学者でプロトコルを議論し、一般的なエラーを強調表示する必要があります。これらのエラーはマイクロを含みます組織検索、thermoinsulated容器内に十分な濡れた氷の上にサンプルを出荷するために一晩/迅速発送、失敗を通じて出荷する障害が発生したときにBial社の汚染（通常は酵母）。最後に、我々は輸送時間を最小限にするために、サンプルの出荷のためのドア・ツー・ドアの宅配便を使用することをお勧めします。 注意はまた、細胞の生存率を維持するために組織解離の間に取られるべきです。例えば、輸送のための神経組織の健康を維持するために設計されたメディアの使用は、（休止-抗生物質/抗真菌剤で補充を）成功した​​文化を生成する機会が増加します。常に氷上でサンプルを転送することにより、プロトコルを通して冷たい温度でサンプルを維持することも重要です。両方のステップは、細胞に外傷性であるため、プロトコルの成功を向上させることができトリチュレーションを最小限に抑えるとともに、両方の機械的および酵素的解離の画分を収集します。我々の経験では、最も成功した培養物は、両方の画分のうちに成長しながら、、我々は2つの調製物の一方のみが潜在的にこれらのサンプルのデリケートな性質を反映して、耐久性のある文化を確立インスタンスを持っていました。プロトコルにおける別の外傷のステップは、トリチュレーションです。必要なの磨砕の程度を減らすことができる1つの戦略は、サンプルが完全に準備の先頭にミンチされるようにするためです。サンプルの生存率を改善するために設計されたプロトコルの態様の他の例は、酵素的解離の際に特に重要であるプロトコル、全体緩衝液（ 例えば、HEPES）を添加することが挙げられます。 さらに、細胞の生存率を高めるために、このプロトコルの可能な変更は、ACK赤血球溶解ステップの除去です。しかしながら、この場合には、赤血球を除去するために、培養の最初の週の間にACK溶解ステップを実行するために、その後しばしば必要です。修正することができるこのプロトコルの他の態様は、ショ糖を使用して、ミエリンおよび細胞破片の除去であるdensityの勾配。具体的に、ミクログリア細胞の細胞生存率を改善することが報告されている他の戦略は、不連続パーコール密度勾配18又は磁気ミエリン除去ビーズとして、この段階でも可能です。 最後に、初期の組織解離およびニューロスフェアの外観の間の期間は、試料間で変化し、月またはそれ以上の週からどこでも取ることができます。初期の培養は、通常、死細胞および細胞破片のかなりの程度を含んでいるので、生存細胞が残っているかどうかを決定するために挑戦することができます。 8週間（ 図2） -培養物は、少なくとも4のために維持されるべきです。ここに提示され、残りの破片から増殖している細胞を単離するための一つの戦略（ すなわち 、新鮮な培地に細胞クラスターと再メッキをフィルタリング逆）。文化を維持し続けるべきかどうかについての決定は、最終的には目の周囲の要因に基づいてケースバイケースの判断であり、電子の剖検（ 例えば、長期の死後変化、組織輸送中の問題）、組織解離（ 例えば、過度の血液や破片）、およびどのようにサンプルが培養中に表示されます。培養物が確立されると、同一性は、この目的のために保持された元の腫瘍のサンプルを培養物を比較すると、短いタンデム反復の分析または類似の方法を用いて、DNAフィンガープリンティングによって検証されるべきです。 6ヶ月 - 私たちは日常的にすべての3例えば、他の文化によって全く汚染が発生していないことを確認するためにDNA指紋によって文化を検証することをお勧めします。 これらの患者由来のDIPG培養物の生成は有効な治療法の開発に成功の重要なステップを表します。利用可能な患者由来DIPGの文化や異種移植モデルの拡大は、最も効果的な治療戦略を識別し、最終的には、この壊滅的な疾患を克服するために重要となります。

DIPGは、通常、小児期中期1、2の間に、腹側橋で発生積極的な中枢神経系悪性腫瘍です。臨床試験の数十年にもかかわらず、現在の治療は、症状の一時的な改善または安定化を提供し、わずか3ヶ月平均で生存期間の中央値を拡張し、放射線治療、に限定されています。でも放射線治療で、全生存期間の中央値は、初期診断の2年以内に病気で死亡する子どもの90％とわずか9ヶ月です。そのため、腫瘍の浸潤性の性質および脳幹の重要な機能の、外科的切除は不可能です。組織病理学的分析は、典型的には、単独の神経画像によって作製することができる臨床治療及び診断を導くには、現在の役割を持たないようにまた、米国では、DIPGための外科的生検を得る歴史的に、3を行っていません。腫瘍組織のFしたがって、可用性または研究は、候補薬物分子とその下の腫瘍生物学に関する研究を行うための努力を制限し、制限されています。特に、神経画像と定位技術の向上は、分子生物学の進歩と相まって、近年のDIPGの安全な生検の開発4、のために許可している、疾患の我々の理解を変えました。現在、治療計画を個別化するための先行投資生検およびDIPGの分子プロファイリングを使用して、複数の臨床試験は（NCT01182350、NCT02274987）5進行中です。 DIPGおよびその他の小児高悪性度神経膠腫は、それらの成人の神経膠芽腫の対応6、7は異なる疾患を表し、従って、DIPGの忠実な実験モデルは、そのユニークな病態生理を理解し、効果的な治療戦略を発見するために必要です。近年では、DIPG腫瘍トンを得るための努力を集中剖検時の研究のための問題は、または、あまり一般的ではないが、生検は、私たちの理解とDIPGを研究する能力に革命をもたらしてきました。ゲノム全体の配列決定の努力は、H3ヒストン、ファミリー3A（H3F3A）およびヒストンクラスター1タンパク質8、9、10、11符号化ヒストンの突然変異によって引き起こされるヒト疾患の第1の例を示す、H3B（HIST1H3B）における再発性変異を明らかにしました。さらに、DIPGsのサブセットは、以前に癌で報告が、先天性小児期発達障害の進行性骨化性線維形成異常症8、9、10、11に見られる変異と同一であるれていないACVR1遺伝子における突然変異を発現します。同様に、最初の患者由来のDIPG細胞培養および同所性異種移植片カ月DELSは現在1、2、12、13、14、ならびにマウスモデルは、シリアル異種移植3、14、15を生成するために免疫不全マウスに腫瘍細胞の直接的な異種移植を通じて確立確立されています。これらの患者由来のモデルを使用して初期薬物スクリーニングの努力は、臨床翻訳4、14のための有望な新規薬剤を同定していると、少なくとも1つの臨床試験（NCT02717455）のための基礎を築いてきました。 進歩に向けたこれらの最初のステップはほんの始まりであり、多数の患者由来の組織試料および培養モデルは、疾患のサブタイプを定義し、最も効果的な治療戦略を開発する必要があります。遺伝的にエンジンDIPGのeredマウスモデルはまた、疾患の私達の基本的な理解を促進することを目的とした研究を促進します。 DIPGの遺伝的モデルを生成するための努力は、上述の基礎ゲノム研究によって支援されますが、オプションの現在の限られた数が用意されています。組織学的に類似した高品位の脳幹神経膠腫を発生させる一つのこのようなモデルは、新生児マウス5、16の後頭蓋窩にネスチン陽性細胞にPDGF-Bの過剰発現とのINK4a-ARF損失を駆動するために、ウイルスRCAS / TV-システムを使用しています。別のアプローチは、6、7、17腫瘍形成、これらの細胞をレンダリングするのに十分である、ヒト胚性幹細胞由来の神経前駆細胞におけるいくつかの主要なDIPG関連変異（ヒストンH3.3のK27M変異、p53の損失とPDGFRA活性化）を反復することを含みます。遺伝子的方法および患者DERIVの組み合わせEDモデルは、前臨床試験を可能にし、効果的な治療法の開発を促進します。 上記に詳述DIPG研究の課題に対処するために、この迅速剖検プロトコルは調査8、9、10、11、12、14のための患者由来の細胞培養物を生成するために開発されました。プロトコルは、組織の生存能力を保護し、拡張死後間隔と輸送時間に伴う課題にもかかわらず、耐久性のある培養物を生成する可能性を最大化することを意図しています。正常に生成されたとき、これらのDIPG培養物は、患者由来の細胞に対する潜在的な治療用分子の評価を可能にする、その後のインビトロ操作およびin vivo異種移植実験において使用され得ます。

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with Calcium/Magnesium</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (Collagenase/Dispase)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント マイナス ビタミン</td><td>A Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ヒト PDGF-AA</td><td>シェナンドー バイオテクノロジー</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>ヒト PDGF-BB</td><td>シェナンドー バイオテクノロジー</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF</td><td>シェナンドー バイオテクノロジー</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>ヒトFGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>滅菌メスの刃</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>湾曲した止血剤</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 細胞培養皿</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>滅菌鉗子</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドレープ</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td>キンバリー・クラーク</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>ギブコ</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>100ミクロン メッシュフィルター</td><td>フィッシャー</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（dipg）

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

びまん性内因ポンティーネ神経膠腫（DIPG）は普遍的に致命的な予後を運ぶ子供の頃の脳幹腫瘍です。外科的切除は、実行可能な治療戦略ではなく、生検が日常的に行われていないため、研究のための患者サンプルの利用可能性は限られています。したがって、この病気を研究するための努力は、忠実な疾患モデルの不足によって挑戦されています。この必要性に対処するために、我々は、in vitroアッセイまたはin vivo同所異種移植実験に使用することができる耐久性のある患者由来の細胞培養モデルを生成するために、ここでは、死後剖検組織サンプルの迅速な処理のためのプロトコルを説明します。これらのモデルは、潜在的な薬物標的をスクリーニングするとDIPG内の基本的な病理生物学的プロセスを研究するために使用することができます。このプロトコルは、さらに分析した遺伝子の元のその後の分析を可能にする（FACS）、蛍光活性化細胞選別を用いて、腫瘍および微小環境の細胞を単離するために拡張することができますPRESSION、タンパク質の発現、またはバルク細胞または単一細胞レベルでDNAのエピジェネティック修飾。最後に、このプロトコルは、他の中枢神経系の腫瘍の患者由来の培養物を生成するように適合させることができます。

記載されたプロトコルは、 図1の処理の様々な段階での組織の画像を5段階のワークフローのように要約されます。サンプルは、最初の急速な滅菌剖検によって得られます。試料からの血管と髄膜を除去しながら、機械的解離の際に、組織を細切し、100μmのナイロンメッシュフィルターを通して濾過しました。残りの組織フラグメントを、酵素的に加温オーブン内で解離されます。次に、破片は、試料からのミエリンの別個の層を分離する、ショ糖勾配遠心分離によって低減されます。また、ACK溶解は、視覚的試料中に存在する赤血球の量を減少させます。最後に、細胞を、成長因子を補充した無血清培地中に播種します。 補足図1は、剖検時に腫瘍の一例です。腫瘍は橋ANのびまん性浸潤として成長します脳幹のDに隣接する地域。試料調製時には、小〜1センチメートル×1センチチャンクがカットされるべきであり、直ちに氷上に冷たい出荷メディアに入れました。 図2は、サンプルが耐久性のある文化に培養の初期段階から現れることができる方法の様々な例を示しています。最初にプレートし、早期の文化（A、B）は、しばしば、多くの生存細胞を含むように表示されません。また、初期の細胞クラスター（C、D）は、多くの場合、一般的に、神経球に関連したコントラストの程度を示しません。特に、前の細胞クラスターの出現に培養時間の期間は数ヶ月に数週間かかることがあります。しかし、セルクラスタの逆フィルタリングと組み合わされ、これらの細胞クラスターの最初の通過は、球体（F）を形成することができる健康な腫瘍細胞を単離することができます。ろ液（E）は、典型的には、残りの破片が含まれしかし、我々は、メッキ、ろ液を維持するとの監視をお勧めします<html>細胞クラスターの開発。これらの患者由来の試料は、複数の通路（G、H）培養中で維持することができます。 図3は、マウスに異種移植されたことがこれらの細胞の能力を実証します。これらの場合の各々において、DIPG細胞は生物発光（A）を介して腫瘍の発生を監視するためにGFP-ルシフェラーゼレポーターをトランスフェクトしました。腫瘍は、腫瘍生着（B）または特異的マーカー（C）の発現を観察するために、例えば、組織学的に調べることができます。 インビトロアッセイと組み合わせてこれらのin vivoモデルは、様々な薬物または遺伝子操作の効果を評価するために使用され得る（ 例えば、8、9、10、11、14）。 レ/ ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; 処理の様々な段階における図1.組織サンプル。 （A）無菌剖検手順および濡れた氷の上で一晩出荷を介してサンプルを入手。左から右へ（B）：（行1）出荷メディアにおける腫瘍組織を含むチューブ。 100ミリメートルX 20ミリメートルの細胞培養皿で新鮮な組織。組織の最初のミンチ。 （行2）部分的に細分化した組織。髄膜及び血管を除去します。刻んだ組織片の最終的なサイズ。左から右へ（C）：（行1）37℃のオーブン中で回転テーブル上でインキュベート組織。 （行2）10 mLのピペットに取り付けられた1000年μLのピペットチップを介して、組織の摩砕。 100μmのナイロンメッシュフィルターを通して解離した組織のフィルタリング。左から（D）は ：遠心分離前に0.9 Mショ糖溶液中に懸濁し、組織を解離しました。遠心分離後のショ糖勾配に分かれた組織を分離し;目に見える層Oショ糖勾配の上にFミエリンの破片。 ACK溶解および洗浄後の最終的な細胞ペレット。 （E）最後のサンプルは、培養物中に配置されるか、または他の下流の分析に使用することができます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> 初代培養および初期継代細胞の2.イメージ図。 （A - B）培養物を解離（SU-DIPG-XXX、A）の直後にメッキ、または（SU-DIPG-XXIX、B）まだニューロスフェアを成長していないこと。 （C - D）SU-DIPG-XXVIII（C）とSU-DIPG-XXIX（D）の初代培養物におけるニューロスフェアの早期出現。 Fi付き（EF）を100μmのナイロンフィルターを使用して、Dからの初代培養の最初の継代、濾液（E）およびリバースろ液（F）を播種しました。 （G - H）SU-DIPG-XXVII（G）の第一通路とSU-DIPG-XXVの第3通路（H）から成熟した神経球を培養液中で成長しています。スケールバー=200μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> 図3.患者由来の培養細胞は生着し、マウスで腫瘍を形成することができます。 （A）GFP-ルシフェラーゼレポーターでトランスフェクトされた四つの異なる患者由来の細胞培養物の生物発光画像。 （B）マウス異種移植片からサジタル断面、マウス脳橋に移植腫瘍細胞を示します。緑：GFP、赤：ミエリン塩基性タンパク質。スケールバー= 1ミリメートル。 （C）の例immunofluoresマウス脳に移植GFP腫瘍細胞を示すcence画像。青：DAPI、緑：GFP、赤：IGF2R。 =40μmのスケールバー。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 橋腫瘍の補足図1剖検例 。びまん固有橋グリオーマの即時死後の外観。腫瘍は橋の腹面に大きな、ミエリンが豊富な塊として表示されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">このイメージをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、患者由来の細胞培養モデルまたは腫瘍および微小環境細胞の直接的な特徴付けの確立のための死後拡散固有橋グリオーマサンプルを迅速に処理するための方法を記載します。

びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

この迅速な死後細胞培養プロトコルの全体的な目的は、びまん性内在性橋腫瘍（DIPG）の耐久性のある患者由来細胞培養系を構築し、DIPGの理解および最終的な効果的治療法の開発に必要な実験を促進することです。この手法は、特定の薬剤が異なる患者由来の培養細胞にわたって有効であるかなど、びまん性内在性橋腫瘍の基礎生物学や治療戦略に関する重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、患者由来細胞の生物学的特性を直接的に研究できることです。この手法の意義はDIPGの治療にまで及び、疾患の異なる遺伝的サブタイプにわたってさまざまな治療戦略を検証することが可能になります。本手法はDIPGへの洞察を提供するだけでなく、他の小児高グレードグリオーマや成人神経膠芽腫、あるいはその他の中枢神経系腫瘍などの他の疾患にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな者は、剖検サンプルを効率的に入手し、迅速に処理することが困難であるため、苦労することがあります。試料調製に先立ち、組織培養フード、カミソリの刃、曲型止血鉗子、およびその他の非滅菌器具をUVライトの下で1時間滅菌し、以降のすべての手順を滅菌条件下で行う。次に、組織を壁の高い100 mm × 20 mmの細胞培養ディッシュに移す。輸送時に残っていた培地を除去し、10～15 mLの冷えた培養培地と交換する。次に、曲がった止血鉗子でカミソリを挟み、血管や髄膜を取り除きながら組織を細かく刻みます。最終的な組織片は1 mm以下になるようにしてください。その後、組織を清潔な50 mLコニカルチューブに移します。細胞培養皿をさらに 5 mL の冷した培養液で洗浄し、サンプルをコニカルチューブに移します。残っている組織をすべて移すまで、必要に応じてこの洗浄ステップを繰り返します。10 mL セロロジカルピペットを用いて、サンプルを 4〜5 回静かにピペッティングして混和させます。大きめの組織断片をチューブの底に沈殿させます。必要に応じて、サンプルを1分間短時間遠心分離してください。解離分画を回収するため、上清を取り除き、100-micronフィルターを用いて「Mechanical Dissociation」とラベルを貼った新しい50-milliliterコニカルチューブにろ過します。フィルターを元のコニカルチューブの上に逆さまに置き、培養液で洗浄して組織片を回収します。続いて、機械的解離画分を5分間遠心分離します。その後、ペレット化した機械的解離画分から上清を除去し、組織を冷えた培養液で再懸濁します。機械的解離用のコニカルチューブ内の組織量が5 mLを超える場合は、どのチューブも5 mLを超えないように、組織を別の50 mLコニカルチューブに分注します。その後、機械的に解離した画分を、スクロース密度勾配遠心分離のステップまで氷上で保存します。本手順では、組織断片が残っているコニカルチューブを5分間遠心分離します。その後、上清を除去し、あらかじめ加温した酵素消化液を、組織1 mLあたり5 mLの割合で加えます。次に、コニカルチューブの蓋をラボフィルムで密閉し、ローテーターを用いて37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを穏やかにトリチュレーション（破砕）します。10 mLのセロロジカルピペットを用いて、過剰な気泡が発生しないように注意しながら、サンプルを6〜8回ピペッティングします。次に、ピペットの先端に1,000 µLのピペットチップを装着し、さらに6〜8回サンプルをトリチュレーションします。残っている凝塊がチューブの底に沈殿するまで待ちます。次に、細胞を懸濁させたまま上清を取り出し、100 µmフィルターを用いて「Enzymatic Dissociation」と表記した新しい50 mLコニカルチューブにろ過し、氷上に保存します。その後、酵素解離チューブを5分間遠心分離し、ショ糖密度勾配遠心分離へと進みます。サンプルがまだ溶液中に懸濁している場合は、さらに5分間遠心分離してください。次に、上清を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない冷HBSS 20 millilitersで組織を再懸濁します。その後、冷HBSSを用いて全量を25 millilitersに合わせます。1.8 molar sucrose溶液25 millilitersをゆっくりと加え、チューブを反転させて混ぜ合わせます。これにより、0.9 Mのスクロース勾配が形成されます。続いて、ブレーキをかけずに10分間、サンプルを遠心分離します。髄鞘のデブリを、可能な限り多くのスクロース溶液とともに慎重に吸引してください。次に、カルシウムおよびマグネシウムを含まない冷たいHBSSを30 milliliters加え、緩やかに混ぜてサンプルを洗浄します。その後、5分間遠心分離します。この手順において、洗浄上清を除去してください。5 mLのACK溶血バッファーを加え、室温でチューブを1分間 swirling して、細胞ペレットを穏やかに再懸濁させます。次に、カルシウムおよびマグネシウム不含の冷HBSSを30 mL加えて溶血を停止させます。その後、5分間遠心分離を行います。最終的な細胞ペレットを、成長因子を含む温めた完全TSM 10～15 mLで再懸濁し、トリパンブルー排除法を用いてヘモサイトメーターで生存細胞密度を定量します。その後、最終的な細胞懸濁液を新しいT75培養フラスコに移します。全体の成長因子レベルを維持するために、1日おきに追加の成長因子を加え、腫瘍細胞ニューロスフィアの形成をモニタリングします。以下に、培養の初期段階から安定した培養に至るまで、サンプルがどのように見えるかのさまざまな例を示します。初期段階では、播種直後や初期の培養において、生存細胞があまり多くないように見えることがよくあります。さらに、初期の細胞クラスターは、通常ニューロスフィアに関連して見られるようなコントラストを十分に示さないことが多くあります。しかしながら、これらの細胞クラスターを初回継代し、さらに細胞クラスターの逆ろ過を組み合わせることで、スフェアを形成可能な健康な腫瘍細胞を単離することができます。ろ液には通常、残存したデブリが含まれます。これらの患者由来サンプルは、その後、複数回の継代にわたって培養を維持することが可能です。この手法に習熟すれば、適切に実施することで3〜4時間で完了させることができます。この手順を行う際は、酵素的解離以外のすべてのステップにおいてサンプルを低温に維持し、サンプルへの物理的なダメージを最小限に抑えることが重要です。本手順に続いて、in vitro薬物スクリーニングや異所性異種移植などの追加研究を行うことで、DIPGの病理生物学に関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。この培養法の開発により、小児神経腫瘍学分野の研究者がDIPGの患児に対する新たな治療法を模索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、脳腫瘍検体を用いた迅速な死後細胞培養プロトコルの実施方法について十分に理解できるはずです。ヒト組織の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、個人用保護具の着用や無菌操作などの予防策を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

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