3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法
2017年3月27日
ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。
ナレーター この方法の全体的な目標は、細胞凝集によって大量の堅牢な細胞スフェロイドを効率的に生成し、さまざまな細胞ベースのアッセイで使用することです。この技術の主な利点は、細胞凝集とスフェロイド形成に非タンパク質性の水溶性マトリックスを使用するため、スフェロイドを簡単かつ迅速に分離できることです。この方法は、細胞間および細胞/マトリックス相互作用が3次元微小環境での組織増殖に及ぼす影響について、細胞生物学における新たな知見を得るのに役立ちます。
ナレーター 骨材を調製する前に、50ミリリットルの超純水を摂氏80度に加熱し、10グラムのメチルセルロース粉末を加えます。粒子が均一に分散するまで懸濁液を攪拌します。次に、冷たく超純水を最終容量100ミリリットルに加え、溶液が透明で目に見える固形物のない麦わら色になるまで、粒子を摂氏4度で一晩保存します。
溶液を0.45マイクロメートルのフィルターに通して未溶解の断片を除去し、ろ過した溶液を適切な培地で1ミリリットルあたり1:5ミリグラム希釈します。次に、メチルセルロースを添加した培地を0.22マイクロメートルのストレーナーでろ過します。次に、バイオセーフティキャビネットで、70%コンフルエントな継代培養をPBSで洗浄し、細胞培養インキュベーターで3ミリリットルのトリプシン-EDTA会合バッファーで細胞を接着します。
数分後、光学顕微鏡で10倍の倍率で細胞を検査します。細胞がプレートから浮き上がったら、7ミリリットルの血清添加培地で反応を中和します。細胞溶液を新鮮な15ミリリットルチューブに移し、次いで遠心分離によって遊離細胞を回収する。
スフェロイド形成が失敗する最も一般的な原因は、粒子の汚染は別として、特定の細胞株の凝集と増殖にメチルセルロースまたは血清の濃度が最適でないことです。ナレーター - フィルターチップ付きのP1000マイクロピペットを使用して、1ミリリットルのスフェロイド形成培地でパレットを3〜5回回転させ、ピペットチップをチューブの底にわずかな角度で押し付けながら、チップの内容物全体を排出せずにゆっくりとピペッティングしてペレットを薄くします。カウント後、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり10〜4細胞の濃度の1倍に希釈し、滅菌マルチチャンネルピペットリザーバーをろ過した超純水ですすいで、ほこりや繊維を取り除きます。
細胞をリザーバーに分注し、フィルターチップを使用して100マイクロリットルの細胞を96ウェルU底細胞忌避プレートの各ウェルに移し、細胞懸濁液を定期的に混合して細胞がリザーバーの底に沈殿するのを防ぎます。すべての細胞が着座したら、プレートを組織培養インキュベーターに置き、ウェルのスフェロイド形成を毎日検査します。細胞は6時間以内に各ウェルの底に沈殿し、通常は24〜48時間以内にスフェロイドに凝集します。
成功したスフェロイドの形成を確認するには、光学顕微鏡下でP10チップを使用して、スフェロイド上に培地を静かにピペッティングします。適切に形成されたスフェロイドはプレートから緩んで転がり、その3D構造を確認します。スフェロイドをコラーゲンに埋め込むには、リバースピペッティングを使用して、8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルの底部に、ウェルあたり最低50マイクロリットルの中和コラーゲンを均一にコーティングします。
すべてのウェルを覆ったら、超純水を入れた35mm組織培養皿にチャンバースライドを10cm培養皿に入れ、10cm組織培養皿を37°Cで約1時間インキュベートします。コラーゲンが重合したら、P1000フィルターチップを使用して、あらかじめ形成されたスフェロイドを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに慎重に移します。コラーゲン基層は、スフェロイドや培地を添加する際にコラーゲンを乱さないように、完全に重合するまでインキュベー
トすることが重要です。ナレーター 採取したスフェロイドを卓上型マイクロ遠心分離機に集め、P200ピペットを使用して上清を取り除き、必要に応じて清潔なペーパータオルでチューブを反転させて余分な上澄みを吸い取ります。ワイドボアP200ピペットチップを使用して、スフェロイドを50マイクロリットルの中和コラーゲンに直ちに再懸濁し、スフェロイドコラーゲン混合物を8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルに慎重に移します。コラーゲンが重合するまでスライドをインキュベーターに戻します。
約1時間後、目的の適切な処理を含む少なくとも100マイクロリットルの温めた培地を各ウェルにゆっくりと加え、別のインキュベーションを行います。次に、蛍光顕微鏡を使用して、侵入するスフェロイドを通じて光学イメージング切片を取得します。このプロトコルを使用すると、さまざまな細胞株からスフェロイドを生成できます。
適切なメチルセルロースおよび血清処理条件下で、個々の細胞はウェルの中心に沈殿して付着し、ウェル底への付着が最小限に抑えられたスフェロイドを形成します。一部の細胞株は、メチルセルロースの非存在下または低濃度で細胞忌避プレートに接着することができ、その結果、細胞単層に囲まれたスフェロイドが形成されます。一般に、メチルセルロース濃度が高いと、細胞がウェルに付着するのを防ぎます。
しかし、メチルセルロースの濃度が高すぎると、細胞間の接着が減少し、細胞がウェルの底に沈降するのを防ぎ、その結果、緩い凝集体と多数のサテライトスフェロイドが形成されます。コラーゲン包埋スフェロイドは、走化性物質で処理して、個々の細胞がスフェロイドから周囲のマトリックスに外側に侵入するように誘導することができます。固定コラーゲン包埋スフェロイドは、明視野顕微鏡で侵入細胞の距離と数を定量化したり、免疫蛍光顕微鏡で遊走細胞によって形成される浸潤構造を可視化したりすることができます。
細胞が構造的に健全なスフェロイドに凝集し、断片化することなく操作するのに十分な堅牢性を持ち、その後のアッセイで使用するために簡単に収集できるスフェロイドに凝集するのに十分な時間を確保することが重要です。当社の細胞増殖プロトコールは、複数の細胞生物学アッセイにさらに適応させることができます。例えば、高濃度のメチルセルロースを添加した培地に細胞を座らせることは、セラノイクス耐性を評価するために使用することができます。
このビデオを見れば、多くの細胞生物学アプリケーションにとって貴重なツールとなる3次元細胞スフェロイドを凝集によって生成する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、細胞凝集を通じて3D細胞球体を生成するための迅速で柔軟なプロトコルを提示します。この方法は様々な細胞タイプに適応可能で、細胞移動、侵襲、細胞-マトリックス相互作用に関連するアッセイに適用可能です。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 3D細胞培養
- 細胞凝集技術
背景
- 細胞間および細胞/マトリックス相互作用の理解は組織成長にとって重要です。
- 3D細胞球体は2D培養と比較してより生理学的に関連したモデルを提供します。
- 非タンパク質マトリックスの使用により、球体の形成が容易になります。
- この方法により、様々なアッセイのために球体を迅速に分離することができます。
研究の目的
- 堅牢な細胞球体の効率的な生成のためのプロトコルを開発すること。
- 細胞の挙動に対する微小環境の影響を調査すること。
- 組織成長力学の理解を深めること。
使用した方法
- 細胞凝集のためのメチルセルロース溶液の調製。
- 超純水とメチルセルロース粉末の加熱と攪拌。
- 使用前に溶液の透明度を達成するための保存。
- 様々な細胞ベースのアッセイへの方法の適用。
主な結果
- 異なる細胞タイプからの3D細胞球体の成功的な形成。
- 非タンパク質マトリックスを使用した球体の容易な分離の実証。
- 3D環境における細胞-マトリックス相互作用の洞察。
- 移動、侵襲、アノイキスアッセイにおける潜在的な応用。
結論
- このプロトコルは3D細胞培養のための汎用的なアプローチを提供します。
- 細胞生物学の様々な研究応用に適応可能です。
- この方法は複雑な細胞間相互作用の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust 3D spheroid models are essential for bridging the gap between traditional 2D cell culture and the complex in vivo tumor microenvironment, enabling more predictive preclinical evaluation. This flexible aggregation protocol supports high-throughput, reproducible generation of spheroids from diverse cell lines, directly impacting early discovery, target validation, and translational research. Its adaptability and scalability position it as a reusable platform for mechanistic de-risking and quantitative phenotypic screening in oncology and tissue biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-cell and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D context.
- Supports functional validation of targets by modeling anchorage-independent growth and anoikis resistance.
- Facilitates mechanistic de-risking by recapitulating tumor-like microenvironments.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies of invasion and migration pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, size-consistent spheroids suitable for quantitative drug screening assays.
- Improves assay reproducibility and scalability across multiple cell types and conditions.
- Enables preparation of validated 3D systems for downstream imaging and molecular analyses.
- Supports reliable evaluation of compound effects on invasion, migration, and viability endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant 3D biology for translational biomarker studies.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by supporting invasion and migration assays in a 3D matrix.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing predictive data on tumor-like behaviors.
- Supports mechanistic studies of resistance and metastatic potential in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both mechanistic and phenotypic workflows.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of cell behavior in 3D, clarifying pathway dependencies and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in standardized 3D systems.
- Analytics: Enables measurement of invasion, migration, and viability with imaging and molecular readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by modeling tumor microenvironments and resistance mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable protocol adaptable across cell lines and assay formats for portfolio-wide application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and pathway studies.
- Operational Value: Standardizes 3D culture workflows, improving reproducibility and scalability for screening and mechanistic assays.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, disease-relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated 3D phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and handling of methylcellulose-based matrices.
- Needs access to cell-repellent plates, imaging platforms, and standard tissue culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of spheroid size, matrix composition, and assay timing for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of tumor and normal cell lines with optimization of serum and methylcellulose concentrations.
- Limitations include cell line-specific aggregation behaviors and the need for careful matrix optimization to avoid loose aggregates or monolayer formation.
