3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

ナレーター この方法の全体的な目標は、細胞凝集によって大量の堅牢な細胞スフェロイドを効率的に生成し、さまざまな細胞ベースのアッセイで使用することです。この技術の主な利点は、細胞凝集とスフェロイド形成に非タンパク質性の水溶性マトリックスを使用するため、スフェロイドを簡単かつ迅速に分離できることです。この方法は、細胞間および細胞/マトリックス相互作用が3次元微小環境での組織増殖に及ぼす影響について、細胞生物学における新たな知見を得るのに役立ちます。

ナレーター 骨材を調製する前に、50ミリリットルの超純水を摂氏80度に加熱し、10グラムのメチルセルロース粉末を加えます。粒子が均一に分散するまで懸濁液を攪拌します。次に、冷たく超純水を最終容量100ミリリットルに加え、溶液が透明で目に見える固形物のない麦わら色になるまで、粒子を摂氏4度で一晩保存します。

溶液を0.45マイクロメートルのフィルターに通して未溶解の断片を除去し、ろ過した溶液を適切な培地で1ミリリットルあたり1:5ミリグラム希釈します。次に、メチルセルロースを添加した培地を0.22マイクロメートルのストレーナーでろ過します。次に、バイオセーフティキャビネットで、70%コンフルエントな継代培養をPBSで洗浄し、細胞培養インキュベーターで3ミリリットルのトリプシン-EDTA会合バッファーで細胞を接着します。

数分後、光学顕微鏡で10倍の倍率で細胞を検査します。細胞がプレートから浮き上がったら、7ミリリットルの血清添加培地で反応を中和します。細胞溶液を新鮮な15ミリリットルチューブに移し、次いで遠心分離によって遊離細胞を回収する。

スフェロイド形成が失敗する最も一般的な原因は、粒子の汚染は別として、特定の細胞株の凝集と増殖にメチルセルロースまたは血清の濃度が最適でないことです。ナレーター - フィルターチップ付きのP1000マイクロピペットを使用して、1ミリリットルのスフェロイド形成培地でパレットを3〜5回回転させ、ピペットチップをチューブの底にわずかな角度で押し付けながら、チップの内容物全体を排出せずにゆっくりとピペッティングしてペレットを薄くします。カウント後、細胞懸濁液を1ミリリットルあたり10〜4細胞の濃度の1倍に希釈し、滅菌マルチチャンネルピペットリザーバーをろ過した超純水ですすいで、ほこりや繊維を取り除きます。

細胞をリザーバーに分注し、フィルターチップを使用して100マイクロリットルの細胞を96ウェルU底細胞忌避プレートの各ウェルに移し、細胞懸濁液を定期的に混合して細胞がリザーバーの底に沈殿するのを防ぎます。すべての細胞が着座したら、プレートを組織培養インキュベーターに置き、ウェルのスフェロイド形成を毎日検査します。細胞は6時間以内に各ウェルの底に沈殿し、通常は24〜48時間以内にスフェロイドに凝集します。

成功したスフェロイドの形成を確認するには、光学顕微鏡下でP10チップを使用して、スフェロイド上に培地を静かにピペッティングします。適切に形成されたスフェロイドはプレートから緩んで転がり、その3D構造を確認します。スフェロイドをコラーゲンに埋め込むには、リバースピペッティングを使用して、8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルの底部に、ウェルあたり最低50マイクロリットルの中和コラーゲンを均一にコーティングします。

すべてのウェルを覆ったら、超純水を入れた35mm組織培養皿にチャンバースライドを10cm培養皿に入れ、10cm組織培養皿を37°Cで約1時間インキュベートします。コラーゲンが重合したら、P1000フィルターチップを使用して、あらかじめ形成されたスフェロイドを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに慎重に移します。コラーゲン基層は、スフェロイドや培地を添加する際にコラーゲンを乱さないように、完全に重合するまでインキュベー

ナレーター 採取したスフェロイドを卓上型マイクロ遠心分離機に集め、P200ピペットを使用して上清を取り除き、必要に応じて清潔なペーパータオルでチューブを反転させて余分な上澄みを吸い取ります。ワイドボアP200ピペットチップを使用して、スフェロイドを50マイクロリットルの中和コラーゲンに直ちに再懸濁し、スフェロイドコラーゲン混合物を8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルに慎重に移します。コラーゲンが重合するまでスライドをインキュベーターに戻します。

約1時間後、目的の適切な処理を含む少なくとも100マイクロリットルの温めた培地を各ウェルにゆっくりと加え、別のインキュベーションを行います。次に、蛍光顕微鏡を使用して、侵入するスフェロイドを通じて光学イメージング切片を取得します。このプロトコルを使用すると、さまざまな細胞株からスフェロイドを生成できます。

適切なメチルセルロースおよび血清処理条件下で、個々の細胞はウェルの中心に沈殿して付着し、ウェル底への付着が最小限に抑えられたスフェロイドを形成します。一部の細胞株は、メチルセルロースの非存在下または低濃度で細胞忌避プレートに接着することができ、その結果、細胞単層に囲まれたスフェロイドが形成されます。一般に、メチルセルロース濃度が高いと、細胞がウェルに付着するのを防ぎます。

しかし、メチルセルロースの濃度が高すぎると、細胞間の接着が減少し、細胞がウェルの底に沈降するのを防ぎ、その結果、緩い凝集体と多数のサテライトスフェロイドが形成されます。コラーゲン包埋スフェロイドは、走化性物質で処理して、個々の細胞がスフェロイドから周囲のマトリックスに外側に侵入するように誘導することができます。固定コラーゲン包埋スフェロイドは、明視野顕微鏡で侵入細胞の距離と数を定量化したり、免疫蛍光顕微鏡で遊走細胞によって形成される浸潤構造を可視化したりすることができます。

的に健全なスフェロイドに凝集し、断片化することなく操作するのに十分な堅牢性を持ち、その後のアッセイで使用するために簡単に収集できるスフェロイドに凝集するのに十分な時間を確保することが重要です。当社の細胞増殖プロトコールは、複数の細胞生物学アッセイにさらに適応させることができます。例えば、高濃度のメチルセルロースを添加した培地に細胞を座らせることは、セラノイクス耐性を評価するために使用することができます。

このビデオを見れば、多くの細胞生物学アプリケーションにとって貴重なツールとなる3次元細胞スフェロイドを凝集によって生成する方法を十分に理解できるはずです。