Name: 3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶメチルセルロースを用いた細胞凝集法による3Dスフェロイドの効率的な生成技術。非タンパク質性マトリックスを活用し、細胞移動や浸潤アッセイなど多様な細胞ベースアッセイに応用可能な方法です。

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著者は、クイーンズ大学生物医学イメージングセンターのM.ゴードン氏に感謝します。この研究は、カナダがん研究協会(19439)およびカナダ保健研究所(MOP-142303)(LMM)からの運営助成金、およびテリーフォックス研究所の学際的がん研究のトレーニングプログラム(SMM、EYL)からのオンタリオ大学院奨学金と学生シップ、およびクレイグジュリーサマースチューデントシップ(SMM)によって支援されました。

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<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

私たちは、安価で広く入手可能な試薬を用いたin vivo組織のアーキテクチャをモデル化するために、3Dスフェロイドを生産するための迅速かつ柔軟な方法を提示します。我々のプロトコルは、細胞凝集を媒介し、細胞単層の形成を最小限にするためにMC 8,9の非細胞毒性および接着促進特性を利用します。動物源から単離されたタンパク質ベースのマトリックスとは異なり、MCは、不活性でない成長因子を含まず、かつ容易に残差行列が存在しない様々な用途に使用するための球状の単離を可能にすること、洗浄することによって除去されます。私たちのプロトコルは、様々な実験条件下で成長させたスフェロイドの直接比較を可能にする、均一なサイズのスフェロイドを生成するために、一貫性のある細胞数の急速な凝集を使用しています。この方法は、（複数の腫瘍関連細胞型の固定数を組み合わせることにより、インビボ腫瘍増殖にモデル化するために混合培養に適合させることができますより正確に腫瘍環境を表すために、例えば、線維芽細胞、白血...

腫瘍細胞の挙動の生物学的に関連する評価は、これらが十分に生体内で見つかった細胞微小環境を反映していないため、部分的には、従来の2次元（2D）細胞培養法を用いて挑戦されています。培養物（ 例えば 、Boydenチャンバーアッセイ）に細胞外マトリックス成分を組み込んだ別のアプローチは、生体内の組織環境の複数の生理的に代表的なものです。しかしながら、それらは個々の細胞の挙動の評価に限定することができ、組織または腫瘍増殖1、2、3に寄与する細胞-マトリックス及び細胞-細胞間相互作用のインビボでの組み合わせで複合体を再現しません。 多細胞スフェロイドの使用は、より正確にin vivoでの細胞増殖1のコンパクトなアーキテクチャを再現最近のアプローチであります4。スフェロイドは、正常細胞の細胞-マトリックス相互作用を調査するために使用することができるだけでなく、転移性増殖または薬剤耐性4のように、腫瘍進行の特性をモデル化するために、腫瘍の類似体として作用することができます。 スフェロイドは、単一細胞クラスター（ 例えば 、懸滴、遠心分離法）6,7を形成するために、複数の細胞の凝集を促進することにより、より迅速マトリックス5内に埋め込まれた単一細胞の増殖により形成された、又はされてもよいです。既存の細胞凝集技術は、高価な材料や特殊な装置を必要とし得ます。加えて、これらのスフェロイドは、サイズ及び形態の広い範囲を有し、成長条件または困難な処置間の比較を行う、大量に製造することが困難であってもよいです。最後に、これらの方法によって生成されたスフェロイドは、タンパク質extracelから単離することは困難ですそれらは、他のアプリケーションで使用するために埋め込まれたlularマトリックス。 ここでは、市販のU底細胞撥プレートと不活性接着促進マトリックス、メチルセルロースを使用して、一貫サイズのスフェロイドの急速な形成のための堅牢かつ容易に修正細胞凝集方法を説明します。一旦形成されると、これらの多細胞スフェロイドを容易に広範囲の用途での使用のために単離されます。プロトコルはまた、容易に他の細胞プロセスを評価するために使用され得る細胞増殖を介してスフェロイドを生成するように適合されています。ここでは、これらの二つの異なる回転楕円体形成プロトコルのアプリケーション例として、免疫蛍光染色によって定量し、細胞浸潤アッセイ、およびアノイキスアッセイを示します。

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate buffered saline</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>PBS+洗浄バッファーに使用されます。塩化カルシウムを添加してPBS+洗浄バッファーをオートクレーブしないでください</td></tr> 塩化<tr><td>マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>PBS+ 洗浄バッファーに使用されます。塩化マグネシウムを添加してPBS+洗浄バッファーをオートクレーブしないでください</td></tr><tr><td>Name</strong<></td><td>strong>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>スフェロイド形成用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルU底細胞撥水プレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改良型イーグルス培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>SH-SY5Y、PANC-1、TPC-1細胞株の培養用</td></tr><tr><td>F12K 中型</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2112722</td><td>TT細胞株の培養用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>フィルター 使用前に微粒子汚染物質を除去するために</td></tr><tr><td>メチルセルロー</td><td>スSigma-Aldrich</td><td>M7027</td> 水<td>で100 mg/mLに調製</td></tr><tr><td>ロズウェルパーク記念研究所 培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>HCT-116、BxPC-3細胞株の培養用</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Dissociation buffer</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3.1 mg/mL;使用中は氷上で保持します</td></tr><tr><td>DMEMフェノールレッドフリー低グルコース&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11054-20</td><td>Phenol Redサプリメント培地と比較してバックグラウンド蛍光が少ない</td></tr><tr><td>グリア細胞株由来神経栄養因子</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>化学誘引剤</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</strong</td><td>>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>For Immunofluorescence Microscopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>切除されたスフェロイドの取り付け用</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>アクチンを1:200で染色するために使用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>BSAブロッキングバッファーに使用</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>退色防止</td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>MOWIOL封入剤に使用</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Freeware, NIH</td><td>-</td><td>画像解析に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>切除されたスフェロイドの取り付け用</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>MOWIOLの取り付け媒体に使用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>固定バッファーに使用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>透過化バッファーに使用</td></tr></tbody></table>

3dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

単層細胞培養物は十分に複雑な細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用に関与する組織のインビボ挙動をモデル化しません。三次元（3D）細胞培養技術は、接着細胞培養物の欠点に対処するために開発され、最近の技術革新です。 インビトロ組織類似体を生成するためのいくつかの技術が開発されてきたが、これらの方法を確立すること、高価、しばしば複雑であり、特殊な装置を必要とし、一般的にのみ、特定の細胞型との互換性により制限されます。ここでは、腫瘍の様々な成長と正常細胞株と互換性のある一貫したサイズの多3Dスフェロイドに細胞を集約するための迅速かつ柔軟なプロトコルを記述します。我々は、足場非依存性スフェロイドの生成を促進し、高度に再現可能な方法で細胞単層の形成を防止するために、血清およびメチルセルロース（MC）の種々の濃度を使用します。 INDIVのための最適条件idual細胞株はスフェロイド形成培地中MCまたは血清濃度を調整することによって達成することができます。生成された3Dスフェロイドは、細胞シグナル伝達または遺伝子発現研究、候補薬物のスクリーニング、またはそのような腫瘍細胞の浸潤および遊走などの細胞プロセスの研究に含めた幅広い用途での使用のために収集することができます。プロトコルはまた、容易に単一細胞からクローンスフェロイドを生成するように適合され、足場非依存性増殖およびアノイキス耐性を評価するために適合させることができます。全体として、我々のプロトコルは、組織の三次元微小環境を再現し、正常細胞および腫瘍細胞のインビボ増殖をモデル化するために、3D細胞スフェロイドを生成し、利用するための簡単に修正する方法を提供します。

我々は、細胞撥プレートとMCを補充したスフェロイド形成媒体を使用して個別のスフェロイドを生成するための柔軟で効率的な方法を説明します。 MCおよび血清の適切な条件の下では、個々の細胞が落ち着くとウェル底への最小限の遵守とスフェロイドを形成するために、ウェルの中央で一緒に接着します。このプロトコルを使用して、スフェロイドは、細胞株の様々な（ 図2B）から生成されました。 MCおよび血清濃度の滴定は、単一のスフェロイドの断片化することなく、操作を可能にするのに十分に頑強であるが形成される最適な条件を同定するために、各細胞株のために必要とされます。最適には、スフェロイドは、直径200〜500ミクロンの間であった、と最小限の細胞破片と緊密に付着細胞から成っていました。スフェロイドは、彼らが収集され、多種多様なアッセイで使用することができるように、損傷を与えることなく、穏やかな処理を生き延びました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-ページは= &quot;1&quot;&gt;...

ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ナレーター：この手法の総合的な目的は、細胞凝集によって、さまざまな細胞ベースのアッセイに使用される堅牢な細胞スフェロイドを大量かつ効率的に作製することです。この技術の主な利点は、細胞凝集とスフェロイド形成に非タンパク質の水溶性マトリックスを使用するため、スフェロイドを迅速かつ容易に単離できることです。本手法は、三次元微小環境における組織成長に対する細胞間相互作用および細胞・マトリックス間相互作用の影響について、細胞生物学における新たな知見を得るのに役立ちます。ナレーター：凝集体を調製する前に、50 millilitersの超純水を80 degrees Celsiusまで加熱し、10 gramsのメチルセルロース粉末を加えます。粒子が均一に分散するまで懸濁液を撹拌してください。その後、最終容量が100 millilitersになるまで冷超純水を加え、溶液が透明になり、目に見える固形物がない麦わら色になるまで、4 degrees Celsiusで一晩保存します。溶液を0.45 µmフィルターでろ過して未溶解の破片を除去し、ろ過後の溶液を適切な培地で1:5 mg/mLに希釈します。次に、メチルセルロースを添加した培地を0.22 µmストレイナーでろ過します。続いて、バイオセーフティキャビネット内で、コンフルエンシー70%のサブカルチャーをPBSで洗浄し、細胞培養インキュベーター内で3 mLのTrypsin-EDTA剥離緩衝液を用いて細胞を処理します。数分後、光学顕微鏡の10倍倍率で細胞を確認します。細胞がプレートから剥離したら、血清添加培地 7 mL を加えて反応を停止させます。細胞懸濁液を新しい 15 mL チューブに移し、遠心分離によって遊離した細胞を回収します。汚染粒子の混入を除き、スフェロイド形成が不成功となる最も一般的な原因は、使用した細胞株の凝集および増殖に適さない濃度のメチルセルロースまたは血清を用いたことです。ナレーター：フィルターチップを装着したP1000マイクロピペットを用い、1 mLのスフェロイド形成培地でペレットを3〜5回トリチュレーションします。この際、ピペットチップをチューブの底にわずかに角度をつけて押し当て、チップの内容物を完全に排出し切らずにゆっくりとピペッティングすることで、ペレットを剪断します。細胞数をカウントした後、細胞懸濁液を1×10⁴ cells/mLの濃度に希釈し、滅菌済みのマルチチャンネルピペット用リザーバーをろ過済み超純水で洗浄して、ほこりや繊維を取り除きます。細胞をリザーバーに分注し、フィルターチップを用いて、96ウェルU底細胞忌避プレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。その際、細胞がリザーバーの底に沈殿するのを防ぐため、定期的に細胞懸濁液を混ぜ合わせます。すべての細胞を分注し終えた後、プレートを組織培養インキュベーターに入れ、毎日ウェルを確認してスフェロイドの形成を観察します。細胞は6時間以内に各ウェルの底に沈降し、通常24～48時間以内に凝集してスフェロイドを形成します。スフェロイドが正常に形成されたかを確認するため、光学顕微鏡下でP10チップを用い、スフェロイドの上に培地を静かにピペッティングします。適切に形成されたスフェロイドは、プレートから離れて転がるため、これにより3次元構造が確認されます。スフェロイドをコラーゲンに包埋させるには、リバースピペッティングを用いて、8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルの底に、1ウェルあたり最低50 µLの中和コラーゲンを均一に塗布します。すべてのウェルを覆った後、超純水を満たした35 mm組織培養皿に入ったチャンバースライドを10 cm組織培養皿に入れ、10 cm組織培養皿を37 °Cで約1時間インキュベートします。コラーゲンが重合したら、P1000フィルタチップを用いて、あらかじめ形成したスフェロイドを1.5 mLマイクロ遠心チューブに注意深く移します。スフェロイドや培地を添加する際にコラーゲンを乱さないよう、コラーゲンのベース層が完全に重合するまでインキュベートすることが極めて重要です。ナレーター：回収したスフェロイドを卓上マイクロ遠心分離機にかけ、P200ピペットを使用して上清を除去します。必要に応じて、チューブを清潔なペーパータオル上で反転させ、余分な上清を吸い取ってください。広口のP200ピペットチップを用いて、直ちにスフェロイドを50 µLの中和済みコラーゲンに再懸濁し、スフェロイドとコラーゲンの混合液を8ウェル組織培養チャンバースライドの各ウェルに慎重に移します。コラーゲンが重合するまで、スライドをインキュベーターに戻します。約1時間後、目的の適切な処理を含む温めた培地を、各ウェルに少なくとも100 µLずつゆっくりと加え、さらにインキュベーションを行います。その後、蛍光顕微鏡を用いて、浸潤したスフェロイドの光学イメージング切片を撮影します。このプロトコルを用いることで、さまざまな細胞株からスフェロイドを作製することが可能です。適切なメチルセルロースおよび血清の処理条件下では、個々の細胞が沈降してウェルの中心で互いに凝集し、ウェル底面への付着を最小限に抑えたスフェロイドを形成します。一部の細胞株では、メチルセルロースが存在しないか、あるいは低濃度である場合に細胞忌避プレートに付着することがあり、その結果、細胞単層に囲まれたスフェロイドが形成されます。一般的に、メチルセルロースの濃度が高くなるほど、細胞のウェルへの付着が抑制されます。しかし、メチルセルロースの濃度が高すぎると細胞間接着が低下し、細胞がウェルの底に沈降できなくなるため、緩い凝集体や多数のサテライト・スフェロイドが形成されます。コラーゲン埋没スフェロイドに化学誘引物質を処理することで、個々の細胞がスフェロイドから周囲のマトリックスへと外側に浸潤するように誘導できます。固定したコラーゲン埋没スフェロイドを明視野顕微鏡で観察して浸潤細胞の距離と数を定量化するか、あるいは免疫蛍光顕微鏡で観察して遊走細胞によって形成された浸潤構造を可視化することができます。細胞を、断片化することなく操作できる十分な堅牢性と構造的な安定性を備えたスフェロイドに凝集させ、その後のアッセイで容易に回収できるように、十分な時間を確保することが重要です。本細胞増殖プロトコルは、さらにさまざまな細胞生物学アッセイに適応させることができます。例えば、高濃度のメチルセルロースを添加した培地で細胞を静置させることで、細胞の浸潤能を評価することが可能です。このビデオを視聴することで、凝集による三次元細胞スフェロイドの作製方法について十分な理解を得ることができます。これは、多くの細胞生物学的応用において有用なツールとなります。

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生物学

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本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

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スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

細胞スフェロイドは、生物学的応用の分野における1つの潜在的なモデルと見なされてきました。本稿では、均一な細胞スフェロイドを頑健かつ迅速に作製するための効率的な方法を提供する3D音響アセンブリデバイスを使用して細胞スフェロイドをスケーラブルに生成するためのプロトコルについて説明します。...

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ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。...

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

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新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

学ぶメチルセルロースを用いた細胞凝集法による3Dスフェロイドの効率的な生成技術。非タンパク質性マトリックスを活用し、細胞移動や浸潤アッセイなど多様な細胞ベースアッセイに応用可能な方法です。

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