Name: 機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぼう、スフェロイドの半自動表現型解析法を。バイオリアクター内で多数のバイオロジカルレプリカを同時培養し、LC-MSによるプロテオミクス解析でタンパク質発現を評価します。肝細胞株HepG2/C3AとTHLE-3を用いた3D培養システムは、創薬研究や疾病モデリングに有用です。

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シドリ研究室は、白血病研究財団(Hollis Brownstein New Investigator Research Grant)、AFAR(Sagol Network GerOmics賞)、Deerfield(Xseed賞)、Relay Therapeutics、Merck、およびNIH所長室(1S10OD030286-01)に感謝します。

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</ol>

Helle Sedighi Frandsenは、ClinoStarシステムのプロデューサーであるCelVivo ApSでリサーチサイエンティストとして雇用されています。Karoline Mikkelsenは、CelVivo ApSに勤務し、デンマークのオーデンセにあるSDUで博士号を取得しています。他のすべての著者は、競合する金銭的利害関係を持っていません。

3次元(3D)細胞構造の背後にある生物学を理解することは、その機能をより包括的に理解するために非常に重要です。複雑な生物学の研究や毒性スクリーニングの実施に3Dモデルを使用することへの関心が高まっています。細胞を3Dで培養する際には、モデルシステムの表現型評価など、多くの要素を考慮する必要があります。表現型は、形態、行動、生理学的および生化学的特性など、特定の生物の観察可能な特性のグループとして定義されます20。
このプロトコルでは、プロテオミクス実験が少数のスフェロイドからどのように実施され、典型的な肝臓表現型を監視するために使用できるかを示します。質量分析は、3D細胞の特性評価に広く適用されている方法となっており、さまざまな生物学的疑問の調査を可能にしています12,16,21,22。包括的なプロテオーム分析には、少なくとも20 μgのタンパク質出発物質を使用し、そこから1 μgを質量分析計に注入することが推奨されます。添加するサンプル数が少ないと感度が低下する可能性があり、添加量を増やすとクロマトグラフィーの品質が徐々に低下し、最終的にはカラムが詰まることにつながることに注意してください。この研究では、HepG2/C3AおよびTHLE-3スフェロイドには、特定の肝臓経路であり、血糖値の維持とエネルギー生産に重要な解糖系およびTCA回路からの重要なタンパク質が豊富に含まれていることを示しました23,24。実際、質量分析はタンパク質レベルでの情報を提供するだけでなく、私たちのグループ16で以前に示したように、タンパク質の翻訳後修飾を調べることもできます。
3D表現型研究で考慮すべきもう一つの側面は、回転楕円体の数とサイズです。実験の再現性を高めるだけでなく、容器内の3D構造の数がスフェロイドのサイズと代謝活性レベルに影響を与える可能性があるため、培養を複数のバイオリアクターに分割するタイミングを決定するには、スフェロイドの数を数え、そのサイズを決定することが不可欠です。ただし、スフェロイドの数とサイズは、細胞株、開始細胞数、分裂プロセス、および収集時間に依存することを強調することが重要です。HepG2/C3Aスフェロイド培養の詳細(スフェロイドあたりの細胞数、タンパク質含有量、年齢の関数としてのサイズなど)は、Fey、Korzeniowska、およびWrzesinski25によって提供されました。ここで説明する半自動分析法を使用して正確かつ正常に分析するには、最も重要なステップが適切なスフェロイドの画像です。簡単にするために、写真は携帯電話やタブレットで撮影できますが、その解像度はできるだけ高く保つ必要があります。画像は迅速に取得できるため、大規模なスクリーニング実験で特定の表現型の特徴を視覚化したり、薬物治療に対する反応を調べたりすることができます。したがって、細胞ベースのアッセイの数の増加により、過去10年間に画像解析のために多くのオープンソースソフトウェアが開発されてきました26。このプロトコルでは、ソフトウェア FIJI18 を使用してスフェロイドのサイズをカウントおよび測定する半自動システムについて説明します。画像コレクションに適用できる一連のアルゴリズム操作を定義するスクリプト(簡単なプログラミングコマンド)を提示し、解析を簡単かつ迅速に行えるようにしました。ただし、回転楕円体の特性によっては、手動測定を採用する必要があります。たとえば、回転楕円体が半透明すぎると、FIJI スクリプトが不正確になります。ちなみに、この方法が機能するための最も重要な基準の1つは、回転楕円体のコンパクトさです。この特性は、回転楕円体と背景の間の色のコントラストをより強化することに寄与し、分析法が正確であるために必要なものです。
要約すると、再現性の高いスフェロイドを増殖させるための方法論を提示するだけでなく、画像キャプチャとプロテオミクスによる表現型特性評価と組み合わせた半自動システムについても説明しました。この3D細胞解析ツールボックスは、全自動画像解析ソフトウェアと次世代質量分析計により、より堅牢になることが期待されます。

in vitroでの細胞培養は、生物学の基礎知識を確立する上で必要かつ非常に貴重であることが証明されています。特に生物学とがんの科学的理解の多くは、単層で増殖する細胞である2D培養システムからもたらされています。2D培養は主要な細胞培養システムですが、生物学的な進歩を妨げる可能性のある多くの欠点があります。例えば、2D培養では、細胞のシグナル伝達と増殖に重要な細胞間相互作用が欠如しています1。現在までに、3D培養システムは、分化、薬物反応、腫瘍浸潤、および生物学をより適切にモデル化することが示されています2,3,4,5。悪性がんの3Dモデリングは、高齢化とがん死亡率の増加により、特に重要です。肝細胞がん(HCC)は、世界中のがん関連死亡率の主要な原因の1つであり、しばしば予後が悪い6。肝細胞がんは、治癒率が低く、薬物反応が悪く、再発率が高いことが知られています6,7,8。in vivoの正常および悪性肝組織の生理機能を模倣する、正常な肝臓およびHCCのいくつかの3Dモデルが開発されています9,10。
現在の3Dシステムには、液体オーバーレイ、バイオリアクター、ハイドロゲル、足場、3Dプリント構造などがあります。バイオリアクターで生成されたスフェロイドは、栄養曝露、ガス交換、および細胞増殖/静止の腫瘍分布を模倣するため、特に独自の利点を提供します11。バイオリアクターは、その使いやすさ、大きな拡張性、栄養素の拡散、およびアクセス性により、がんモデルに特に適しています11。さらに、バイオリアクターは、ハイスループット実験、再現性の向上、人為的ミスの減少を可能にします。この研究で使用されたバイオリアクターは、重力の低減システムをシミュレートし、典型的なバイオリアクターに加えられる破壊的なせん断力を最小限に抑え、再現性を向上させるという点でユニークです12。全方向の重力とせん断力の減少により、細胞はより生理学的に発達します。その証拠に、この方法で増殖したHepG2/C3A細胞は、in vivoレベルのATP、アデニル酸キナーゼ、尿素、およびコレステロールを産生する球状の細胞小器官を発達させます13,14。さらに、この3Dシステムでの薬物治療は、2D培養と比較してより高度で自動化されています。2D培養では、トリプシン処理と細胞の健康維持が必要なため、薬物処理は多くの場合、短期間で行わなければなりません。しかし、私たちの場合、細胞の構造や生理機能を破壊することなく、スフェロイドの長期的な薬物治療を行うことができます。したがって、生体内の生命現象をより適切にモデル化し、さらなる科学的発展を遂げるためには、2次元培養から3次元培養への移行が必要です。
この論文では、再現性の高いスフェロイドを増殖させるための方法論(図1および図2)を提示し、3D構造を表現型的に特徴付けるための半自動システムを示します(図3)。画像レベルでは、回転楕円体の面積のカウントと測定に関する情報を提供します(図3)。質量分析法を用いて、プロテオミクスを用いて特定の生物学的機能を評価する方法を示します(図4)。このデータを収集して解析することで、3D細胞培養システムの背後にある生物学の理解を深めたいと考えています。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>Luer lock tip, graduated to 12 mL</td></tr><tr><td>1000 &micro;L ワイドボアピペットチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro;Lワイドボアピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルオロケムフィルタープレート</td><td>オロケム&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルスカートプレート</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル真空マニホールド</td><td>ミリポア</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>気管支上皮細胞増殖培地 (BEGM)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養グレード水</td><td>コーニング</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>3D細胞培養用バイオリアクター</td></tr><tr><td>ClinoStarインキュベーター</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 3D細胞培養用インキュベーター</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia 24ウェル丸底超低アタッチメントプレート、マイクロウェル入り</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Formic</td><td>acid Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>CO2 インキュベーター 2D細胞培養用</td></tr><tr><td>HPLCグレード アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレード メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレード水</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>シグマ</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>オアシス HLB レジン 30 & マイクロ;m</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>高分解能質量分析計</td></tr><tr><td>PAULA 顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Victor X2 マルチラベルマイクロプレートリーダー</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHペーパー</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>ホスホエタノールア</td><td>ミン Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>リン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>ピペットガン</td><td>エッペンドルフ</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>サーモ</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>レプロシル-ピュア樹脂</td><td>MSWIL</td><td>R13.AQ.003</td><td>120 &Aring; 細孔径, C18-AQ phase, 3 &mu;M ビーズサイズ</td></tr><tr><td></td><td>SDS バイオ・ラッド</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシンググレード修飾トリプシン</td><td>Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空濃縮器 (96 ウェルプレート)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>滅菌フード</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>滅菌血清ピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-trap</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ針 (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>長さ 3 インチ、直径 0.05 インチ</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

機能的3dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

3D細胞培養の増殖、処理、モニタリングにスタンドアロンのクリノスタットインキュベーターを使用することの特性と利点を説明するプロトコルを紹介します。クリノスタットは、細胞が低せん断力と活発な栄養素拡散で再現性の高いスフェロイドとして組み立てることができる環境を模倣しています。がん肝細胞と非がん肝細胞(HepG2/C3AおよびTHLE-3細胞株)の両方が、肝細胞に匹敵する機能性を獲得するまでに3週間の増殖が必要であることを実証しました。このプロトコルは、処理時にスフェロイドをカウントおよび測定するためにスナップショットを撮ることができるため、細胞増殖を監視するカメラを備えた3D細胞用のインキュベーターを利用することの利便性を強調しています。THLE-3細胞株とHepG2/C3A細胞株の比較について説明し、非がん細胞株と不死化がん細胞の増殖方法を示します。プロテオミクス実験が、細胞シグナル伝達を乱すことなく、つまりトリプシン処理を必要とせずに収集できる少数のスフェロイドからどのように実施できるかを実証し、説明します。プロテオミクス解析は、呼吸鎖代謝の典型的な肝臓表現型と金属解毒に関与するタンパク質の産生をモニターするために使用できることを示し、スフェロイドの面積をカウントおよび測定する半自動システムについて説明します。全体として、プロトコルは3D細胞培養モデルで実験するためにイメージの捕獲およびプロテオミクスのパイプラインによって表現型の性格描写を構成する道具箱を示す。

このプロトコルでは、3Dスフェロイドの培養用に特別に設計された革新的なストレスフリー3D細胞インキュベーターの特性について説明します(図2)。THLE-3およびHepG2/C3A細胞株の3D培養のプロトコルを最適化しました。ここで説明するプロトコールは使い方が簡単で、バイオリアクターあたり&gt;100個のスフェロイドの再現性と費用対効果の高い培養が可能です。バイオリアクターに入ると、スフェロイドは2D培養で維持された細胞と同様に扱われます。週に2〜3回培地を交換し(図2B)、スフェロイドの成長とサイズに応じて回転速度を調整することで、最適な増殖条件が得られます(図2C)。回転するバイオリアクターで3Dスフェロイドを培養するこのシステム(図2E、F)は、回転楕円体を等しい非常に低いせん断力にさらすことで、3D構造に最適な増殖環境を提供します。
我々は以前、スフェロイドがクロマチン修飾の分析にどのように使用できるかを示した16。ここでは、肝臓スフェロイドの入手方法と、フルプロテオーム解析のためのプロテオミクス実験の実施方法について詳しく説明します(図1)。簡単に言うと、培養液が80%のコンフルエントに達するまで、THLE-3またはHepG2/C3Aフラットセルを使用してプロトコルを開始しました。細胞をスフェロイドとして培養するには、約2,000個の細胞をマイクロウェルを含む超低接着プレートに播種して自己凝集させ、形成したスフェロイドをバイオリアクターに移しました(図1A)。以前に実証したように、培養後3週間で機能的に活性を示しますが17、このプロトコルでは培養36日後に収集されたスフェロイドの結果を示します。回収後、スフェロイドをスピンダウンし、ペレットと上清の両方を分析用に保管しました。細胞生存率は、前述のように、損傷した細胞によって放出されるアデニル酸キナーゼの定量のために上清から評価された17。細胞ペレットから細胞タンパク質を抽出し、フルプロテオームを高分解能質量分析で分析しました(図1B)。
このプロトコルは、公開画像処理プログラムFIJI(Fiji Is Just ImageJ)18を使用して、スフェロイドカウント(図3A)の半自動方法も実証しています。分析のために回転楕円体の高品質の画像を撮影し、セクション5で述べたようにいくつかのパラメータを考慮する必要があります。次に、分析用の画像を準備した後、マクロスクリプト(補足ファイル1)を使用して回転楕円体をカウントします。このマクロは、最初に回転楕円体の画像が配置されているフォルダー内に FIJI Spheroids counting というフォルダーを作成することで機能します。このフォルダーには、分析のすべての情報が保存されます。これには、カウントされた回転楕円体の写真と、各回転楕円体にID番号が含まれます。また、回転楕円体計数と呼ばれるExcelファイルも含まれています。このファイルには、カウントされた各回転楕円体のピクセル領域と ID 番号が含まれています。分析された 1 つの画像に対応するデータは、ファイルの各タブに表示されます。タブには、分析された画像の名前に従ってラベルが付けられます。スフェロイドのサイズは、血管内の構造の数や薬物処理など、多くの要因によって損なわれる可能性があるため、その表面積を監視することも重要です(プラニメトリー)。ここで紹介するマクロスクリプト(補足ファイル2)は、写真の回転楕円体に対応する黒い領域を測定することで機能します(図3B)。出力は、各回転楕円体の計測面積、周長、および直径を含む planimetry.xlsx というファイルに収集されます。直径を計算するために使用されるフェレと呼ばれる測定値もあります。Feret は可能な限り長い直径で、minFeret は最短です。直径はこれら2つの平均です。出力フォルダー内には、プラニメトリー.xlsxファイルの他に、測定された回転楕円体の画像もあります。
プロテオーム解析に進む前に、スフェロイドの生存率を培養時間にわたって評価しました。AKのレベルは17日目まで増加し、細胞死の約7%に達し、その後死滅は5%未満のレベルまで減少します(図4A)。このプロトコルはまたセル表現型を監視するための完全なプロテオームの分析を示す。まず、THLE-3とHepG2/C3Aの扁平細胞とスフェロイドのプロテオームを比較しました。第1主成分(PC1)を分析すると、平坦な細胞培養からスフェロイドサンプルが厳密に分離されており、細胞タイプ(THLE-3とHepG2/C3A)の相関関係は関係ないことが明らかになりました(図4B)。THLE-3スフェロイドとHepG2/C3Aスフェロイドはクラスター化しませんが、肝機能と一致する類似したプロファイルを共有しています。このプロトコルでは、肝臓で行われる金属解毒に関与するメタロチオネインの例を示します。プロテオミクス解析では、平坦細胞(MT1EおよびMT1X)と比較して、スフェロイドで過剰発現している2つのアイソフォームを同定しました(図4C)。また、スフェロイドとして増殖した両細胞株の遺伝子オントロジー(GO)濃縮も示します。糖鎖代謝プロセスは、トリカルボン酸回路(TCA回路)、電子伝達鎖(細胞呼吸)、ピルビン酸代謝から構成され、HepG2/C3AスフェロイドとTHLE-3スフェロイドの両方に多く含まれています(図4D、E)。細胞の解毒、脂肪酸、コレステロールの代謝は、両方のスフェロイドに豊富に含まれる他の機能です。これらの機能は、肝機能にとって重要であることが知られています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> 図1:スフェロイドの培養とサンプル調製のワークフロー 。 (A)3D細胞培養実験的アプローチ。所望のコンフルエントで平坦な細胞培養をトリプシン処理し、細胞が自己組織化してスフェロイドになるマイクロウェルを含む超低付着性24ウェルプレートに播種した。24時間後、スフェロイドをバイオリアクターに移し、分析の準備が整うまで培養しました。(B)回収後、スフェロイドをペレット化し、ペレットと培養上清の両方を加工まで保存しました。ヒストン16および非ヒストンタンパク質を抽出し、ペプチドに消化し、高分解能質量分析で分析しました。質量分析から得られた生ファイルをヒトデータベースと照合し、データをさらに処理しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> 図2:3D細胞培養システム 。 (A)バイオリアクター部品。バイオリアクターは、水ビーズを含むガス交換および加湿チャンバーと、培地交換とスフェロイド収集用の2つのプラグを備えた開閉可能なセルチャンバーで構成されています。(B)バイオリアクター培地の交換。バイオリアクターは、針付きのシリンジを使用して10mLの成長培地で満たされます。(C)システム制御アプリ。回転数、CO2レベル、温度、アラームログなどの機能をコントロールユニットで制御できます。(D)バイオリアクターを3Dインキュベーターに入れる。各バイオリアクターには、バイオリアクターをゆっくりと回転させることができるモーターが関連付けられています。(E)(C)錠剤によって制御される速度(rpm)で移動中のバイオリアクター。速度(rpm)は、回転楕円体のサイズに応じて調整されます。(F)de 3Dインキュベーター内のバイオリアクター。3Dインキュベーターは、個別に制御されたバイオリアクターを最大6台まで設置できます。写真提供:Jason Torres Photography <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> 図3:画像キャプチャによるスフェロイドの表現型特性評価 。 (A)半自動スフェロイドカウント。バイオリアクターでスフェロイドのスナップショットを撮った後、画像はフィジーでの分析用に準備されます。各回転楕円体がカウントされ、それぞれに ID 番号が付けられます。マクロを使用し、カウントされた回転楕円体のID、ラベル(分析された画像の名前)、および領域(回転楕円体でカウントされたピクセル数)を示す結果が表示されます。(B)回転楕円体面積の平面測定。マクロを使用して、特定の回転楕円体の面積、周囲長、および直径が決定されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> 図4:肝スフェロイドのプロテオーム解析 。 (A)スフェロイドの生存率は、培養上清に対するアデニル酸キナーゼ(AK)の放出に基づいて計算されました。±(B)主成分分析(PCA)を行い、THLE-3とHepG2/C3Aの扁平細胞およびスフェロイドのプロテオームを比較した。(C)ヒトの肝臓で発現されるタンパク質であるメタロチオネインの相対的な存在量。データはSEM±平均として表されます。 (D)機能的にグループ化されたネットワークは、HepG2/C3Aスフェロイドおよび(E)THLE-3スフェロイドのGO濃縮を示し、グループごとに最も重要な項のラベルのみを示しています。ネットワークは ClueGo19 を使用して構築されました。ノード サイズは、エンリッチメントの有意性という用語を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:回転楕円体計数用のマクロスクリプト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:回転楕円体の平面測定のためのマクロ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

このプロトコルは、再現性の高いスフェロイドを育てる方法を示し、プロテオミクス実験が3D構造の生物学的機能を特徴付けるためにどのように実施できるかを示しています。当社の 3D 培養では、同じバイオリアクターで数百の生物学的複製を同時に生成でき、LC-MS アプローチでは、1 回の実験で数千のタンパク質の存在量を測定できます。この手順を実演するのは、研究室のポスドクであるStephanie Stransky氏です。まず、HepG2 / C3AおよびTHLE-3細胞の懸濁液を取ります。細胞数を数え、細胞懸濁液を完全増殖培地で希釈して、最大容量1.5ミリリットルで100万個の細胞を得ます。0.5ミリリットルの成長培地で超低アタッチメントの24ウェル丸底板のウェルを洗浄し、3, 000gで5分間遠心分離します。細胞懸濁液をプレートに移し、120gで3分間遠心分離します。次に、プレートをインキュベートしてスフェロイド形成を開始します。次に、長い針が付いた10ミリリットルのシリンジを使用して、湿度チャンバーに25ミリリットルの滅菌水を、細胞チャンバーに9ミリリットルの成長培地を充填することにより、スフェロイドを移送する24時間前にバイオリアクターを平衡化します。次に、バイオリアクターを3Dインキュベーターに摂氏37度で24時間、5%の二酸化炭素を入れます。1ミリリットル幅のボアチップを使用してスフェロイドを静かに上下にピペットで移動し、超低アタッチメントプレートからスフェロイドを取り外し、組織培養皿に移します。残っているスフェロイドを捕捉するには、0.5ミリリットルの予熱した増殖培地でプレートを洗浄し、培養皿に移します。光学顕微鏡を使用して、スフェロイドのサイズ、コンパクトさ、真円度を評価し、適切に形成されたスフェロイドを選択します。選択したスフェロイドを、5ミリリットルの新鮮な増殖培地で満たされた平衡化バイオリアクターに移します。次に、バイオリアクター全体を新鮮な増殖培地で満たします。バイオリアクターを3Dインキュベーターに配置し、コントロールユニットを使用して回転速度を調整します。2〜3日ごとに10ミリリットルの古い培地を10ミリリットルの新鮮な培地と交換します。メディア交換後は毎回回転数を変えてください。スフェロイドを 15 日間培養し、2 つの新鮮なバイオリアクターに分割します。タブレットにインストールされている3Dアプリを開き、バイオリアクターを選択して画像をキャプチャします。別の方法として、バイオリアクターの後ろに黒い背景を配置し、細胞室で光が反射しないようにします。できるだけバイオリアクターの近くで画像を撮影します。次に、上部ポートから長い針に取り付けられたシリンジを使用して、バイオリアクターから5ミリリットルの培地を取り除き、スフェロイドを回収します。スフェロイドがバイオリアクターの下部中央に下降していることを確認します。次に、フロントポートを開き、1ミリリットル幅のボアチップを使用してスフェロイドを収集します。これらのスフェロイドをマイクロ遠心チューブに移し、500gで5分間遠心分離し、培地を廃棄します。FBSを除去するために、200マイクロリットルのHBSSを加えてスフェロイドを洗浄します。この後、500gで5分間遠心分離を行い、上清を廃棄する。次に、回転楕円体ペレットを液体窒素に急速に浸漬して凍結し、この凍結ペレットをマイナス80°Cでさらに処理するまで保存します。細胞を溶解するには、採取したスフェロイドのチューブを取り、25マイクロリットルの5%SDSに再懸濁します。ピペッティングで上下させてペレットを均質化します。次に、1マイクログラムのサンプルと10マイクロリットルの0.1%トリクロロ酢酸を溶解します。タンパク質を抽出し、サンプルを洗浄した後、同定されたペプチドシグナルからMS/MSスペクトルを生成するようにMS取り込みメソッドを設定します。次に、プレートをナノリットル液体クロマトグラフィーオートサンプラーに移します。Orbitrap でフル MS スキャンを 300 対 1, 100 の質量電荷比に設定します。解像度を 120000 に調整し、自動ゲイン制御ターゲットを 125 に設定します。次に、質量電荷比 50 のシーケンシャル分離ウィンドウで Orbitrap の MS/MS を設定します。自動ゲイン制御の目標を 400 に向け、より高いエネルギーの衝突解離エネルギーを 30 に設定します。スフェロイドの生存率分析によると、アデニル酸キナーゼのレベルは17日目まで増加し、細胞死の約7%をもたらします。その後、死亡率は5%未満に減少し、さらに、第1主成分の分析により、スフェロイドサンプルと平坦な細胞培養の明確な区別が明らかになります。プロテオミクス解析により、THLE-3スフェロイドとHepG2/C3Aスフェロイドは、肝機能を反映する類似したプロファイルを持つことが示されました。さらに、スフェロイドは、平坦な細胞と比較して、メタロチオネインの2つのアイソフォームの過剰発現を示しました。機能的にグループ化されたネットワークは、HepG2/C3AおよびTHLE-3スフィアにおける炭水化物代謝プロセスの遺伝子オントロジー濃縮を示しました。増殖培地のこぼれを防ぐため、細胞室が液体で完全に満たされているときは、フロントポートを開閉しないでください。このプロトコルで記述されているサンプル準備および分析がティッシュのサンプルと同様、第2および3D方法を使用して細胞培養のプロテオームを探検するのに使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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