細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

目的の細胞株を接着性2D単分子膜として増殖させます。培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで洗浄します。次に、トリプシンを添加し、細胞がフラスコ表面から剥離して丸い形になる間にインキュベートします。トリプシンを中和し、細胞を懸濁するために新しい培地を追加します。混合物を円錐形のチューブに移し、遠心分離機を使用して細胞をペレット

上清を新しい培地と交換し、細胞のペレットを再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞数をカウントし、作業濃度を計算します。次に、適切な量の細胞ミックスを丸底の超低接着ウェルプレートに移し、インキュベートします。セルは底に落ち着き、凝集します。それらは最終的に互いに付着し、コンパクトな3Dセルアセンブリであるスフェロイドを形成します。

このプロトコル例では、結腸がん細胞株から3Dスフェロイドを生成する方法と、その形成を追跡するためにライブイメージングを適用する方法を見ていきます。まず、目的の結腸直腸癌細胞株を5ミリリットルのPBSで洗浄し、フラスコの底から0.5ミリリットルのトリプシンで37°Cで5分間細胞を取り出します。顕微鏡で剥離を確認した後、細胞解離酵素を10ミリリットルの完全培地で中和し、遠心分離により細胞を回収します。ペレットを5ミリリットルの新鮮な完全培地に再懸濁してカウントし、細胞を1ミリリットルあたり3番目の細胞濃度の1.5倍10倍に再懸濁します。

次に、20マイクロリットルの細胞を96ウェルの丸底プレートの各ウェルに播種し、プレートを摂氏37度のインキュベーター内の5%CO2および95%の湿度の自動イメージング装置に入れます。装置の収集ソフトウェアにログインし、[取得するスケジュール]、[船舶の追加を開始]、[スケジュールに従ってスキャン]、および[船舶の作成]、[新規]を選択します。次に、スキャンタイプ、スフェロイドを選択し、目的の適切な明視野チャネルと蛍光チャネルを選択します。倍率を10倍に設定し、プレートモデルとイメージング装置の引き出し内の位置を選択します。イメージングするウェルの位置を選択し、名前、細胞の種類、細胞数など、実験の説明を入力します。

[分析設定] で、[分析を延期] を選択し、タイムラインを右クリックして [選択したスキャン グループ間隔を設定] を選択し、[スキャンの追加間隔] を 4 時間に設定し、[合計] を 24 時間に設定します。次に、開始時間を自動イメージング装置でのインキュベーション後少なくとも1時間に設定します。スフェロイドの成長の進行状況を確認するには、2日ごとにイメージングソフトウェアにログインし、[最近のスキャンを表示]を選択します。目的の実験をダブルクリックし、[画像チャネル] パネルで [明視野] を選択します。次に、[画像フィーチャの計測] ツールを使用して、回転楕円体の直径を計測します。4日目にウェルあたり50マイクロリットルの完全な培地を追加して、幻影効果の培地を制限します。