2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

このプロトコルの総合的な目的は、細胞周期特異的な様式で遺伝子発現を解析するためのコンテクストを提供することです。この手法は、悪性転換および抗がん剤治療の根底にある細胞周期依存的な転写イベントに関連する、がん分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本プロトコルの主な利点は、2つの条件下および化学療法への曝露後における細胞周期相特異的な遺伝子発現パターンを正確に確立できることです。

本実験ではU2OS細胞を使用します。後続の工程を勤務時間内に行えるよう、午後7時頃に100 mmディッシュに播種してください。その後、5% CO2を含む湿潤環境下、37 °Cで24時間インキュベートし、細胞を接着させます。

翌日、細胞を観察し、コンフルエンシーが50%であることを確認します。チミジンブロックを行うため、100mm培養皿それぞれに、調製したばかりの200mMチミジンストック溶液を100μL添加します。チミジンを加えた細胞を、5% CO2濃度の加湿条件下、37℃で20時間インキュベートします。

翌日の午後3時頃、チミジン含有増殖培地を除去し、チミジンブロックから細胞を解放します。あらかじめ温めておいた1X PBSで細胞を2回洗浄します。

次に、各100 mmディッシュに完全培地10 mLを加えます。細胞を37 °Cで5時間インキュベートします。有糸分裂細胞周期停止させるには、最終濃度が50 ng/mLになるようにノコダゾールを添加します。

細胞をノコダゾールで10〜11時間以内でインキュベートします。翌朝の午前6時から7時の間に、顕微鏡下で細胞を確認し、細胞が丸くなっていることで、実際にG2-M期で停止していることを確認します。

各プレートを振盪させて有糸分裂細胞を剥離させ、剥離した細胞を含むノコダゾール含有増殖培地を100 mmプレートから穏やかにピペッティングして回収します。すべてのディッシュから回収した有糸分裂細胞を50 mL滅菌チューブにまとめます。4 °Cで5分間、300 ×gで遠心分離します。

冷たい1X PBSを加えて細胞を2回洗浄し、続いて遠心分離を行います。2回目の洗浄後のPBSを除去した後、有糸分裂期の細胞を完全培地に再懸濁します。0時間目のタイムポイントとして、RNA抽出用に2 mL、およびFACS解析用に2 mLを保存します。

後続のタイムポイントに向けて、残りの有糸分裂細胞を6ウェルプレートに再播種します。この手順を開始するには、6ウェルプレートの1ウェルあたり0.25 × 10⁶個のU2OS細胞を播種してください。各6ウェルプレートのカバーに、各ウェルの実験条件を記入します。

例えば、未処理のもの、あるいは異なる薬剤濃度および時間で処理したものです。6ウェルプレートをオーバーナイトでインキュベートし、細胞を接着させます。翌朝、細胞を確認し、コンフルエンシーが50%であることを確認してください。

ウェルから完全培地を除去し、あらかじめ温めておいたFBS不含DMEM-Glutamine培地を1ウェルあたり2 mL加えます。細胞をさらに24時間インキュベートします。ヒドロキシウレアを用いて細胞周期を停止させるには、ウェルから培地を除去し、新鮮に調製した4 µMヒドロキシウレア含有完全培地と交換します。

ヒドロキシ尿素含有培地で細胞を24時間インキュベートする。ヒドロキシ尿素による停止から細胞を解放する前に、細胞が停止していることを確認する。ウェルからヒドロキシ尿素含有培地を除去し、あらかじめ温めておいた1X PBSでウェルを2回洗浄する。

2回目の洗浄後にPBSを除去し、1ウェルあたり2 mLの完全培地を加えます。サンプル回収までプレートをインキュベーター内で保持します。両方の同期プロトコルによるサンプルは、同じ方法で回収し、FACS解析およびRNA抽出に用います。

FACS解析を行うため、各ウェルをあらかじめ温めておいた1X PBS 2 mLで洗浄し、次に、あらかじめ温めておいたTrypsin-EDTA溶液 0.3 mLを加えて細胞を剥離させます。5分後、完全培地 1 mLを加えてTrypsin-EDTAを不活化します。各サンプルを個別の15 mLチューブに回収してください。

室温にて 300 ×g で5分間、細胞を遠心分離します。上清を捨て、1X PBS で洗浄し、再度遠心分離を行います。PBS を除去し、細胞ペレットを回収します。

細胞を固定するために、各細胞ペレットを1 mLの冷却した70% ethanolに再懸濁し、穏やかにボルテックスします。プロピジウムヨード染色およびFACS解析の前に、細胞を氷上で約15分間静置します。RNA抽出の場合は、培地を除去し、各ウェルを2 mLの予熱した1X PBSで洗浄します。

プレートを安全キャビネットに移動させ、ウェルあたり1 mLの適切なRNA抽出試薬を加えます。ピペッティングして細胞を溶解させた後、各細胞溶解液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。室温で5分間インキュベートします。

RNA抽出の手順を開始するため、RNA分離試薬を含むサンプルが入ったマイクロ遠心チューブをフリーザーから取り出し、化学薬品用安全キャビネット内で室温で解凍します。各サンプルに400 µLのクロロホルムを加え、完全に混ざるまでボルテックスせずに激しく振盪します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。

卓上マイクロ遠心機を用いて、チューブを15分間遠心分離します。各サンプルの水層を新しい1.5 milliterマイクロ遠心チューブに移します。混合しながら、水層に1等量の100%ethanolをゆっくりと一滴ずつ加えます。

遠心分離は行わないでください。沈殿物を含む各サンプルを最大 700 µL まで、市販の RNA mini-prep キットに付属する 2 mL コレクションチューブに入ったスピンカラムに移し、蓋を閉めます。15 秒間遠心分離します。

フロースルーを廃棄します。1サンプルあたりの開始量が700 µLを超える場合は、残りのサンプルをスピンカラムに移し、再度遠心分離を行います。製造元の指示に従ってRNAを洗浄した後、各サンプルに30～40 µLのヌクレアーゼフリー水をスピンカラムに分注し、室温で1分間遠心分離して溶出させます。

吸光度測定により、サンプルのRNA濃度および純度を決定します。遺伝子発現解析に使用するまで、RNAサンプルを-80 °Cで保存します。Thymidine-Nocodazoleプロトコルによる処理は、U2OS細胞をM期進入で停止させ、フローサイトメトリー解析で示されるように、G1期を経てS期へと同期的に進行する細胞集団を提供します。

ヒドロキシウレアプロトコルによる処理は、細胞をG1/S境界で停止させます。解除後、細胞はS期およびG2期を同期して移行します。チミジン-ノコダゾールプロトコルは、G1期に発現のピークを持つ遺伝子のmRNAプロファイルを解析するのに最も適しています。

E2F1の発現について示した通りである。対照的に、Hydroxyureaプロトコールは、E2F7の発現で示されているように、S期またはG2期に優先的に発現する遺伝子の解析により適している。細胞周期は通常、抗腫瘍薬によって乱される。ここでは、hydroxyureaで同期化した細胞において、mitomycin Cが恒久的なG2期停止を誘導したことを示している。

細胞周期の同期化を行うことで、抗腫瘍剤に反応する遺伝子と、薬剤によって引き起こされる細胞周期の摂動のみによって影響を受ける遺伝子とを区別することが可能になります。例えば、マイトマイシンC処理後のE2F1 mRNAレベルの低下は、薬剤が細胞周期のダイナミクスに及ぼした間接的な影響である可能性が高いと考えられます。対照的に、マイトマイシンC処理後のp21-Cip1 mRNA発現のピークは、この薬剤によって誘発された転写プログラムの直接的な結果です。この手順に従ってゲノムワイドなトランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析を行うことで、特定の細胞周期期に影響を与える全般的な遺伝子発現変化を明らかにすることができます。

2つの条件、または抗腫瘍治療後のいずれかで行います。このビデオを視聴することで、同期化した細胞培養において遺伝子発現解析を行うために必要な手順を十分に理解できるはずです。プロピジウムヨードやRNA抽出試薬の使用は非常に危険であるため、本手順の実施中は、手袋の着用や化学薬品用安全キャビネットの使用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。