2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

このプロトコルの全体的な目標は、細胞周期特異的な方法で遺伝子発現を解析するためのコンテキストを提供することです。この方法は、悪性形質転換や抗がん治療の根底にある細胞周期依存性転写イベントに関連するがん領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、第2の条件と化学療法への曝露後の両方で、細胞周期期特異的な遺伝子発現パターンを正確に確立することです。

この実験にはU2OS細胞を使用し、夕方の午後7時頃に100mmの皿に播種して、その後のステップを勤務時間中に実行できるようにする必要があります。5%CO2の加湿雰囲気で摂氏37度の皿を24時間インキュベートすることにより、細胞を付着させます。

翌日、細胞を調べて、50%のコンフルエント度にあることを確認します。チミジンブロックの場合、調製したばかりの200ミリモルのチミジンストックを各100ミリメートル培養皿に100マイクロリットル加えます。細胞をチミジンと摂氏37度で、5%CO2の加湿雰囲気で20時間インキュベー

翌日、午後3時頃に、チミジンを含む増殖培地を除去することにより、チミジンブロックから細胞を放出します。予め温めた1X PBSで細胞を2回洗浄します。

そして、100ミリ皿ごとに10ミリリットルのミディアムを一皿ずつ加えます。細胞を摂氏37度で5時間インキュベートします。有糸分裂細胞停止のためには、ノコダゾールを50ナノグラム/ミリリットルの最終濃度まで追加します。

細胞をノコダゾールと10〜11時間以内でインキュベートします。翌朝、午前6時から7時の間に、顕微鏡で細胞をチェックし、丸みを帯びた外観で示されるG2-Mで実際にブロックされていることを確認します。

各プレートを振盪し、各100mmプレートから細胞を分離したノコダゾールを含む増殖培地を静かにピペッティングして、有糸分裂細胞を分離します。すべてのディッシュの有糸分裂細胞を50ミリリットルの滅菌チューブに結合します。摂氏4度で5分間、gを300回遠心分離します。

冷やした1X PBSを加えて細胞を2回洗浄し、続いて遠心分離します。2回目の洗浄液からPBSを除去した後、完全培地で有糸分裂細胞を再懸濁します。RNA抽出用に2ミリリットル、ゼロ時間時点のFACS分析用に2ミリリットルを節約します。

残りの有糸分裂細胞を6つのウェルプレートで後続の時点のために再プレートします。この手順を開始するには、6つのウェルプレートでウェルあたり6番目のU2OS細胞に0.25倍の10を播種します。各6ウェルプレートの表紙には、各ウェルの実験条件を記入します。

たとえば、未治療の場合や、薬物の濃度や時点が異なる場合などです。6つのウェルプレートを一晩インキュベートして細胞を付着させます。翌朝、細胞を検査して、細胞が50%のコンフルエント度にあることを確認します。

ウェルから完全な培地を取り出し、ウェルごとに2ミリリットルの予温済みFBSフリーDMEM-Glutamine培地を追加します。細胞をさらに24時間インキュベートします。ヒドロキシ尿素で細胞を停止させるには、ウェルから培地を取り出し、完全な培地を含む新たに調製した4マイクロモルのヒドロキシ尿素と交換します。

ヒドロキシ尿素含有培地で細胞を24時間インキュベートします。ヒドロキシ尿素を介した停止から細胞を解放する前に、細胞をチェックして停止していることを確認してください。.ヒドロキシ尿素を含む培地をウェルから取り出し、予め温めた1X PBSでウェルを2回すすいでください。

2回目の洗浄からPBSを取り除いた後、ウェルごとに2ミリリットルの完全な培地を追加します。サンプルが収集されるまで、プレートをインキュベーターに保管してください。両方の同期プロトコルからのサンプルは、FACS分析とRNA抽出のために同じ方法で収集されます。

FACS分析では、各ウェルを2ミリリットルの予熱済み1X PBSですすぎ、次に0.3ミリリットルの予熱済みトリプシン-EDTA溶液を加えて細胞を剥離します。5分後、1ミリリットルの完全培地を追加してトリプシン-EDTAを不活性化します。.各サンプルを別々の15ミリリットルチューブに集めます。

細胞をGの300倍にして室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、1X PBSで洗浄し、再度回転させます。PBSを取り外し、セルラーペレットを保存します。

細胞を固定するために、各細胞ペレットを1ミリリットルの冷却した70%エタノールに穏やかにボルテックスして再懸濁します。細胞を氷上に約15分間置いてから、ヨウ化プロピジウム染色およびFACS分析を行います。RNA抽出の場合は、培地を取り出し、予め温めた2ミリリットルの1X PBSで各ウェルをすすぎます。

プレートを安全キャビネットに持って行き、ウェルごとに1ミリリットルの適切なRNA単離試薬を追加します。ピペで上下させて細胞をピペットで動かして溶解し、各細胞ライセートを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。室温で5分間インキュベートします。

RNA分離試薬にサンプルが入った微量遠心チューブを冷凍庫から取り出し、薬品用安全キャビネット内で室温で解凍することから、RNA抽出手順を開始します。各サンプルに400マイクロリットルのクロロホルムを加え、完全に混合されるまでボルテックスせずに激しく振とうします。サンプルを室温で5分間インキュベートします。

ベンチトップマイクロ遠心分離機でチューブを15分間遠心分離します。各サンプルの水相を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。100%エタノールの1容量を、混合しながら水相に一滴ずつゆっくりと加えます。

遠心分離しないでください。市販のRNAミニプレップキットが提供する2ミリリットルの収集チューブでスピンカラムに形成された可能性のある沈殿物を含む各サンプルを最大700マイクロリットルに移し、蓋を閉めます。15秒間遠心分離します。

フロースルーを破棄します。サンプルあたり700マイクロリットルを超える場合は、残りのサンプルをスピンカラムに移し、再度遠心分離します。製造元の指示に従ってRNAを洗浄した後、スピンカラムに30〜40マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をピペッティングし、室温で1分間遠心分離することにより、各サンプルを溶出します。

吸光度測定により、サンプルのRNA濃度と純度を測定します。RNAサンプルは、遺伝子発現解析に使用するまでマイナス80°Cで保存します。チミジン-ノコダゾールプロトコルによる治療は、m期突入中のU2OS細胞を停止し、フローサイトメトリー分析で示されるように、G1を介してS期に同期して進行する細胞集団を提供します。

ヒドロキシ尿素プロトコールによる処理は、G1/S境界で細胞を停止します。放出されると、細胞はS期とG2期を同期して移行します。チミジン-ノコダゾールプロトコールは、G1期にピーク発現を示す遺伝子のmRNAプロファイルの分析に最も適しています。

E2F1 式に示すように。対照的に、Hydroxyureaプロトコルは、E2F7の発現に示されているように、SまたはG2で優先的に発現する遺伝子の分析により適しています。細胞周期は通常、抗腫瘍薬によって攪乱され、ヒドロキシ尿素同期細胞におけるマイトマイシンCの永久的なG2期停止が示されています。

細胞同期は、抗腫瘍剤に反応する遺伝子と、薬剤によって課せられる細胞周期の摂動のみに影響を受ける遺伝子を区別するのに役立ちます(例えば、マイトマイシンC治療後のE2F1 mRNAレベルの低下は、細胞周期ダイナミクスに対する薬物の間接的な影響である可能性が高いです。対照的に、マイトマイシンC処理後のp21-Cip1 mRNA発現のピークは、この薬剤によって誘発された転写プログラムの結果です。この手順により、特定の細胞周期の段階に影響を与える全体的な遺伝子発現変化を解明するために、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析およびプロテオミクス解析を行うことができます。

ナンバー2の状態または抗腫瘍治療のいずれか。このビデオを見れば、同期細胞培養で遺伝子発現解析を行うために必要な手順を十分に理解できるはずです。ヨウ化プロピジウムまたはRNA単離試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋や化学薬品の安全キャビネットなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。