Name: 2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ 2つの相補的細胞同期プロトコルを用いた細胞周期特異的遺伝子発現解析法。U2OS細胞を使用し、チミジン・ノコダゾール法とヒドロキシ尿素法でG1期およびS/G2期の発現パターンを正確に解析できます。

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私たちはZubiagaとAltmeyer研究所のメンバーに、有益な議論や技術サポートに感謝します。この作業は、スペイン国務省（SAF2015-67562-R、MINECO / FEDER、UE）、バスク政府（IT634-13およびKK-2015/89）、およびバスク国UPV / EHU大学のグラントUFI11 / 20）。

細胞周期の進行の細胞同期化、放出およびモニタリング<ol><li> 有糸分裂からのU2OS細胞のチミジンおよびノコダゾールに基づく（Thy-Noc）同期および放出 <ol><li>必要な細胞培養液を調製する。 U2OS細胞は、10％（vol / vol）FBS（オプション：1％ペニシリン/ストレプトマイシン）で補完したDMEM-グルタミン培地で日常的に増殖させる。滅菌条件下ですべての培地の調製および操作を行い、補完培地（以後「完全培地」と呼ぶ）を使用前に37℃に暖める。 </li><li> 10mLの完全培地中、100mmディッシュあたり2×10 6個の U2OS細胞をシードする。必要な皿の数を計算するために、各100mmディッシュが、典型的には、6ウェルプレートの約5ウェル（0.2〜0.25×10 6細胞/ウェル）を再プレートするのに十分な有糸分裂細胞を提供することを考慮する1B ）。選択した時点ごとに2つのウェルが必要です（RNA抽出のための1ウェルおよび細胞周期モニタリングのための1ウェル）。さらに、タンパク質分析のために、第3のウェルを時間点ごとに収集することができる。 注：夕方（午後7時頃）に細胞を播種して、翌日の作業時間中に次のステップを行うことができます。 FACS分析補正設定を定義するために、非同期に増殖する細胞の2つのウェルを追加します。 </li><li>細胞を、100％ディッシュを5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートすることによって付着させる。 </li><li>チミジンブロックについては、145.2mgのチミジン粉末を3mLのH 2 O（または同等の量）に溶解し、0.2μmの孔径のフィルターを通してろ過することによって溶液を滅菌することによって、200mMのチミジン原液を調製する。わずかな加温はチミジンを溶解するのに役立つかもしれない。各100mm培養皿（最終濃度2mM）に新たに調製した200mMストック100μLを加える。細胞を37℃で20時間、チミジンとインキュベートする。76℃; 5％CO 2を含む加湿雰囲気中でのC。 注：午後（午後7時頃）に細胞を処理し、チミジン放出とノコダゾールの両方を翌日にブロックする時間を有するようにする。 </li><li>チミジンブロックから遊離するには、翌日の午後3時にチミジン含有増殖培地を除去する（午後3時）。あらかじめ温めた1×PBSで細胞を2回洗浄し、各100mmディッシュに10mLの完全培地を加える。 37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下で5時間細胞をインキュベートする。 </li><li>有糸分裂細胞停止のために、50ng / mL（8pm）の最終濃度にノコダゾールを添加する。 DMSO（ 例えば、 5mg / mL）にノコダゾール粉末を溶解してストック溶液を調製し、-20℃で保存する。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中で、37℃で10〜11時間以内にノコダゾールと細胞をインキュベートする。 </li><li>早期M期（有糸分裂泡消失）におけるノコダゾール媒介性停止およびいくつかの時点での試料の回収からの放出nts（午前6時から午前7時まで）。 <ol><li>各プレートを振とうし、ノコダゾール含有増殖培地を静かにピペッティングすることにより丸い（有糸分裂）細胞を分離する。各100mmプレートから分離した細胞を含む培地を50mLの滅菌チューブに入れ、遠心分離（300xg、5分間、室温（RT））し、1xPBSを加えて遠心分離して細胞を2回洗浄する。有糸分裂のスリップを避けるために、冷PBSまたはPBSとノコダゾールの併用が推奨されます（ディスカッションセクションを参照）。 </li><li> 10mLの完全培地中の各100mmプレートから集めた有糸分裂細胞を再懸濁する。 0時間の時点（1試料あたり約0.2〜0.25×10 6細胞）について、RNA抽出のために2mLおよびFACS分析のために2mLを保存する。 </li><li> 6ウェルプレート（2mL /ウェル; 0.2-0.25×10 6細胞/ウェル）中のその後の時点について、有糸分裂細胞を再プレートする。 注記：選択した時点（RNAについては1、FACS分析については1）あたり2ウェルが必要であることに注意してください。 </li></ol></li><li>セルでサンプルを収集する時間点を指定します。細胞周期の進行の適切なプロファイルを得るためには、1.5〜3時間ごとを推奨する。 <ol><li> RNA抽出のために、培地を除去し、2mLの予め温めた1×PBSで十分にすすぎ、井戸中に適切なRNA単離試薬（ 例えば、 TRIzol）1mLを加える（化学物質の安全キャビネットにおけるこの最後の工程を実施する）。ピペットを上下に動かして細胞を分離・溶解し、細胞溶解液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、RTで5分間インキュベートし、さらに使用するまで-80°Cでチューブを保存します。 </li><li> FACS分析のために、2mLの予め温めた1×PBSで十分にすすぎ、予め温めたトリプシン-EDTA溶液（0.3mL /ウェル）を加えて細胞を分離し、1mLの完全培地を添加してTrypsin-EDTAをブロックし、 15mLチューブ。 <ol><li>細胞を遠心分離（300xg、5分、RT）し、細胞ペレットを保存し、上清を捨てる。細胞を固定するために、チューブを静かにボルテックスして1×PBS中の冷やした70％（v / v）エタノール1mLに細胞を再懸濁し、氷上に置いてアプリケー4℃で保存する約15分前、またはFACSによるさらなる分析のための染色（1.4〜1.5工程に記載）。 </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> G1 / S境界からのHUベースの同期化およびU2OS細胞の放出 <ol><li>ステップ1.1で説明したように完全な細胞培養液を調製する。 </li><li> 6ウェルプレート（1ウェルあたり2mLの完全培養培地）中に1ウェルあたり0.25×10 6個の U2OS細胞を播種する。実験に必要なウェルの数を計算するために、選択された時点（RNA抽出には1ウェル、細胞周期モニタリングには1ウェル）あたり2ウェルが必要であり、非同期的に増殖する細胞の2ウェルは、 FACS分析補償設定を定義する必要がありました。 </li><li> 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で一晩（O / N）6ウェルプレートをインキュベートすることによって細胞を付着させる。 </li><li>翌朝ウェルから完全培地を除去し、2mLウェル当たり予め加温したFBSを含まないDMEM-グルタミン培地。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃でさらに24時間細胞をインキュベートする。 注記：このステップは2（FACS設定を定義するために保存されたもの）以外のすべてのウェルで実行してください。セルをHUと単にインキュベートすることによって効率的な同期が達成される場合、血清回収ステップは省略することができる。 </li><li> HUでのG1 / S細胞周期停止。 <ol><li>各使用の前に新鮮なHUストック溶液（500mM）を調製する。 76.06mgのHU粉末に2mLのH 2 Oを加え、完全に溶解するまで混合する。孔径0.2μmのフィルターで濾過して溶液を滅菌する。 50mLの完全培地を400μLのフィルター滅菌したHUストック溶液と混合し、4mMの最終HU濃度にする。 </li><li> FACS設定を定義するために必要な2つのウェル以外の全てのウェルから培地を除去し、新たに調製した4mM HU含有完全培地（2mL /ウェル）と交換する。 </li><li>細胞を24時間インキュベートする。HU含有培地中、5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で培養した。 </li></ol></li><li> HU媒介性逮捕からの細胞の放出。ウェルからHU含有培地を除去し、予め温めた1×PBS（毎回2mL）でウェルを2回リンスする。 1ウェルあたり2mLの完全培地を加える。 FACS設定のために保存された2つのサンプルと同様に、0時間の時点（RNA抽出のための1つと、FACSによる細胞周期停止確認のための1つ）について2つのサンプルを収集する。インキュベーターに残りの井戸を置きます。 </li><li>細胞周期の進行の適切な分布を得るために1.5〜3時間毎に試料を採取する。各時点で、1.1.8.1-1.1.8.2に記載されているように、サンプル処理（RNA抽出およびFACS分析用）を行う。 </li></ol></li><li> DNA損傷剤による治療 注：細胞周期事象における化合物（ 例えば、 DNA損傷因子）の効果を解明することが目的である場合は、前述のいずれかの同期方法は、遺伝毒性物質による細胞の処理と組み合わされる。同期方法を選択するためには、分析したい細胞周期の位相を考慮することが重要です。一般に、Thy-Noc手順は、G1期またはS期エントリーにおける化合物の効果を研究するのに適しているが、HU媒介性の同期化は、S期からG2期または有糸分裂への侵入における影響を研究するためにより適している。 <ol><li> G1期またはS期における遺伝毒性物質の影響の分析<ol><li> 1.1.2で説明したようにセルを同期させます。 1.1.6まで。 </li><li>ノコダゾールから細胞を放出し、1.1.7に記載されているようにそれらを再プレートする。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で3時間インキュベートし、添加前に結合させる（必要なインキュベーション時間は細胞株によって異なる）。 </li><li>エージェントを追加し、1.1.8で説明したようにサンプルを収集します。 </li></ol></li><li> SGにおける遺伝毒性物質の影響の分析2段階またはM項目<ol><li> 1.2.2で説明したようにセルを同期させます。 1.2.5。 </li><li> 1.2.6で説明されているように、HUから細胞を解放する。直ちにエージェントを追加してください。 </li><li> 1.8で前に説明したようにサンプルを採取する。 </li></ol></li></ol></li><li> ヨウ化プロピジウム（PI）染色およびFACS分析による細胞周期および細胞同期の進行のモニタリング 注記：FACS設定を定義するために必要なものとともに、すべての時点で収集されたサンプルは、（1.1.8.2項に記載されているように）一度固定されると4℃で保存することができます。 PI溶液で染色を行った後、実験のすべてのサンプルを同時にFACS分析する。 PIは、600nm付近のブロードな発光ピークを伴って535nmで励起されると、高度に蛍光性のシグナルを生成する二本鎖DNAの主溝にインターカレートする。 PIは二本鎖RNAにも結合することができるので、最適なDNA分解能のために細胞をRNaseで処理する必要があります。 <ol><li>新鮮なPI染色溶液を調製する。 PIストック溶液は、PIパウダーをPBS（ 例えば、 5mg / mL）に溶解することによって調製することができる。原液を4°C（暗所）で保存する。染色溶液は、PI（140μM）、クエン酸ナトリウム（38mM）およびTriton X-100（0.01％v / v）からなる。 </li><li>適切な表面（ 例えば、オーブン）を37°Cに温める。 </li><li>固定された細胞（450×g、5分、RT）、デカント上清（エタノール）を遠心分離し、1×PBSで1回洗浄する。 </li><li>再度細胞を遠心分離し、PBSを除去し、1検体あたり300μLのPI染色液を加える（FACSセッティングのためのサンプルの1つを除く;代わりにこのサンプルにPBSを加える）。 </li><li>細胞をFACSチューブ（5mL丸底ポリスチレンチューブ）に移す。 </li><li>各サンプルに1μLのRNase Aを添加し、サンプルを混合し、暗所で30分間37℃でインキュベートします。サンプルは4℃で最大2〜3日間光から保護することができます。 </li><li>フローによるサンプル中のDNA含有量の分析サイトメトリー。 PI染色された非同期サンプルを用いてFACS解析補償設定を定義する。ブランクサンプル（PI染色溶液なし）を使用して、自己蛍光をチェックします。フローサイトメトリーによるDNA含量のPI染色媒介分析の基礎は、以前に記載されている9 。 </li></ol></li><li> 二重リン酸化-H3（Ser10）/ PI染色による有糸分裂指数の測定 注：有糸分裂を受ける細胞は、セリン10（pH3）中のホスホ - ヒストンH3に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって容易に検出することができる。付随するPI染色は、細胞集団のDNA含量に基づく分布を決定するために有用である。 FACS設定の最適な構成（ブランク、PIのみ、pH3のみ、二次抗体のみ、二重染色）には5つのサンプルが必要です。 <ol><li>固定細胞（450 xg、5分、4℃）を遠心分離し、上清を捨てる。以下のステップは、15mLチューブ中で染色を行うために記載されている。 </li><li> 1を加えて細胞を洗浄する。ペレットおよび遠心分離（450xg、5分、4℃）にPBS-T（PBS + 0.05％Tween-20）を加えた。上清を除去する。 </li><li> 100-200μLのPBS-T + 3％BSAに希釈した抗pH3抗体（1：500）を添加し、RTで2時間振盪しながらインキュベートする（または4℃でO / N）。 </li><li> 2mLのPBS-T（PBS + 0.05％Tween-20）および遠心分離（450xg、5分、4℃）を加える。上清を除去する。 </li><li>ペレットに2mLのPBS-Tを加えてもう一度洗浄し、遠心分離して上清を捨てる。 </li><li> 100-200μLのPBS-T + 3％BSAで希釈した（1：500）二次抗体（選択したpH3抗体の場合は抗ウサギAlexaFluor488）を添加し、RTで1時間振盪しながらインキュベートする（またはO / N 4℃で）。サンプルを光から保護する。 </li><li> 1.5.4に記載されているように遠心分離によりPBS-T（2mL）で2回洗浄する。 </li><li>前述のようにPI染色を行います（1.4.1〜1.4.6）。 </li></ol></li></ol>遺伝子発現解析のためのサンプル収集とプロセッシング<ol><li>取る1.5 mLのマイクロ遠心分離機を冷凍庫のRNA分離試薬に入れ、室温で化学薬品の安全キャビネット内で解凍させます。 </li><li>各サンプルに400μLのクロロホルムを加え、完全に混合するまで激しく振とうします（しかし、ボルテックスしないでください）。サンプルを室温で5分間インキュベートする。 </li><li>ベンチトップマイクロ遠心分離機でチューブを15分間（≧8,000 xg、4℃）遠心する。 </li><li>水性（上）相を新しい1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、移した容積を登録する（操作の簡素化のために、実験のすべてのサンプルにおいて等しい容量を採取することが推奨される）。 </li><li>混合しながら1容量の100％エタノールをゆっくりと水相に添加する（滴下する）。遠心分離しないでください。 </li><li>市販のRNAミニプレップキットで次のステップを実行してください。形成した可能性のある沈殿物を含めて、各サンプル700μLを2 mLのコレクションチューブ（メーカー提供）のスピンカラムにピペットで移す。 </li><li>それを閉めて蓋および遠心分離機（≧8,000 g、RT）で15秒間洗浄する。フロースルーを捨てる。残りのサンプルがある場合は、前の手順を繰り返します。 </li><li> RNA洗浄および溶出（次のステップのために適切なRNA濃度を達成するために、各サンプルを30〜40μlのヌクレアーゼフリーH 2 Oで溶出する）についての製造業者の指示に従う。 </li><li>吸光度測定（2.0〜2.1のA 260/280比はRNAサンプルの良好な純度を示す）によってサンプルのRNA濃度および純度を決定する。 RT-qPCR分析に使用するまで-80℃でRNAサンプルを保存する。 </li><li> cDNAへのRNA変換およびそれに続く定量的PCRのために、サンプルあたり1μgのRNAを取り、製造業者の指示に従ってレトロトランスクリプラーゼ反応を調製する。得られたcDNAサンプルは、4℃（数日間）または-20℃（長時間）で保存することができます。 注：サンプル調製、プライマー設計、およびリアルタイムPCRのためのその他の考慮事項は、文献22,23に緊密に記載されている。 </li></ol>

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<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246 (4930), 629-634 (1989).</li>
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<li>Min, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD51C-deficient+cancer+cells+are+highly+sensitive+to+the+PARP+inhibitor+olaparib%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib.</a> Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

細胞周期における一過性および特異的役割に関与する微調整された遺伝子の分析は、均一な細胞集団を必要とする。多くの研究者は、これらの目的のために長年確立された腫瘍細胞株を日常的に使用しており、定義された細胞周期段階において可能な限り多くの細胞を蓄積する目的で、同期（または部分的に同期した）細胞集団を得るための様々な方法が開発されている。さらに、確立された同期アプローチを改善し、最適化するために、強力な努力が払われてきた。それにもかかわらず、全ての同期プロトコールは、細胞培養の異質性、同期手順の最適以下の効率、または化学的シンクロナイザーが細胞機能において有する副次的効果に起因し得る欠点を有する。セル同期プロトコルを適用する場合は、これらの制限を考慮する必要があります。研究者は、その仕様に最も適した同期方法を特定する必要がありますic細胞のタイプまたは実験。まったく同じ方法で異なる細胞株を栽培しても、その結果の同期率はいくつかの理由により異なる場合があります。一方で、細胞周期の長さは、選択された細胞株に依存して変化し得る。一方、同じインヒビターは、各細胞株25の特定の特性のために異なる細胞株に対...

細胞周期の全ての段階を経る移行は、厳密に調節された遺伝子発現プログラムに結合される。この細胞周期を通しての遺伝子転写の「オン・オフ」調整は複雑な転写調節系の制御下にあると考えられ、タイミングだけでなく遺伝子発現のレベルも調節する。重要な細胞周期成分の調節解除は、いくつかの疾患の発症に寄与していることが知られており、腫瘍形成の確立された特徴である1,2 。酵母および哺乳動物細胞で実施されたゲノムワイド転写物解析は、細胞周期中の周期的な遺伝子発現パターンを示し、細胞周期中の転写変動が所定の遺伝子産物の時間的要求を反映していることを示唆している正確なフェーズ3,4 、 </sup&gt; 5 。 細胞周期制御遺伝子発現の研究​​における主要な課題は、細胞の特定の細胞周期段階への同期化である。細胞の同期化は、特定の細胞周期相転移に対する遺伝子発現パターンの関連を解釈するのに役立ち、多数の遺伝子の調節および機能のより良い理解をもたらしている。化学療法剤は遺伝子発現だけでなく細胞周期動態にも影響することが知られているので、細胞の同期は抗癌剤の作用メカニズムを研究する上で重要である6,7 。それにもかかわらず、これらの薬剤による治療から生じる遺伝子発現の差異が治療に対する直接的な応答であるのか、または単に細胞周期プロファイルの変化の結果であるのかを決定することはしばしば困難である。これらの可能性を区別するために、遺伝子発現は、化学療法薬の添加に先立ってニンクロナイズした。 新たに単離されたリンパ球様細胞（G08に同調した均質な細胞集団を構成する）のようないくつかの初代細胞を除いて、 インビトロで確立された細胞株は培養において非同期的に増殖する。通常の増殖条件下では、これらの非同期循環細胞は、細胞周期の全ての段階において、しかしG1 9において優先的に見出される。したがって、この文脈は、特定の細胞周期段階（ 例えば、 G1、Sなど）における機能的または遺伝子発現分析のための最適なシナリオを提供しない。非形質転換不死化細胞株（ 例えば、線維芽細胞）は​​、いわゆる生理的方法10と同期させることができる。これらの方法は、サイクリングを続けるために、細胞接触阻害および増殖因子依存などの非形質転換細胞の保持された一次細胞の特徴に基づく。除去G0 / G1で停止した非形質転換細胞をもたらす。しかし、同期した細胞周期の進入および進行には、しばしば継代培養が必要であり、これには細胞の人工的分離および再メッキも含まれる。最も重要なことに、この方法は、形質転換細胞株（現在使用されている確立された細胞株の大部分）の同期には適しておらず、細胞接触媒介性増殖阻害または成長因子離脱に対する応答が欠如していることが特徴である。従って、細胞周期の特定の段階における効率的な細胞同期のために代替の方法が必要であることは明らかである。一般に、最も頻繁に使用される同期方法は、細胞周期の1つの定義された点、典型的にはDNA合成または有糸分裂紡錘体形成の一時的な化学的または薬理学的阻害に基づく。 DNA合成の阻害は、G1後期または初期のS期に細胞を停止させることによって細胞を同期させる。これはアーチかもしれないミオシン、ヌクレオチド生合成阻害剤11,12 、アフィジコリン、DNAポリメラーゼの阻害剤13,14 、ヒドロキシ尿素、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤15,16または過剰量のチミジン17,18 などの化合物を添加することによって得られる。他方、コルヒチンまたはノコダゾールのような微小管重合の阻害剤は、初期M期の細胞同期につながる有糸分裂紡錘体形成をブロックすることができる19,20,21。 この研究では、mRNAにおける細胞周期調節遺伝子の発現を研究するための一過性化学阻害に基づく2つの相補的同期プロトコールを含む方法を記載するレベル。この方法は、特定の細胞周期プロセスにおける細胞周期遺伝子の役割を定義するための基本である。さらに、薬物応答性遺伝子を正確に検出し、これらの薬物によって生じる細胞周期進行の摂動から生じる誤解を最小限に抑えるために、抗癌治療の影響を研究するための一般的なフレームを提供する。

<table><tbody><tr><td>DMEM、高グルコース、GutaMAX サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61965-059</td><td></td></tr><tr><td>FBS、認定済み、EU 承認、南米原産</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA (1x)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>チミジン</td><td>SIGMA</td><td>T1895-5G</td><td>作りたて。わずかな温暖化はチミジンを溶かすのに役立つかもしれません。</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>SIGMA</td><td>M-1404</td><td>DMSOのストック溶液は-20 & ordmで保存されています。小さなアリコート中のC</td></tr><tr><td>Hydroxyurea</td><td>SIGMA</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces caespitosus</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>1.5 mMMストック溶液を滅菌H2Oに入れ、光から保護し、4&ordmで保存。C</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>SIGMA</td><td>P4170</td><td>滅菌 PBS 中のストック溶液 5 mg/mL、4 & ordm で保存。Cは光から保護します。</td></tr><tr><td>PBS pH 7.6</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>PANREAC</td><td>A3678,2500</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>SIGMA</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>PANREAC</td><td>131655</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>トリゾール試薬</td><td>LifeTechnologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>大容量 cDNA 逆転写キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>抗サイクリン E1 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4129</td><td>1:1000 5% 牛乳、o/n、4 &C</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin B1 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4135</td><td>1:1000 希釈液 5% 牛乳、o/n、4 &C</td></tr><tr><td>抗β;-actin</td><td>SIGMA</td><td>A-5441</td><td>1:3000 希釈 5% 牛乳、1 時間、RT</td></tr><tr><td>抗 pH3 (Ser 10) antiboty</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>プロトコルで指定</td></tr><tr><td>二次抗ウサギ AlexaFluor 488 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>R37116</td><td>プロトコルで指定</td></tr><tr><td>二次抗マウス HRP 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3697</td><td>5 % 牛乳で 1:3000 希釈、1 時間、RT</td></tr><tr><td>Forward E2F1 抗体 (ヒト)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;TGACATCACCAACGTCCTTGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>逆E2F1抗体 (ヒト)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;CTGTGCGAGGTCCTGGGTC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward E2F7 antibody (human)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;GGAAAGGCAACAGCAAACTCT</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse E2F7 antibody (human)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward p21Cip1 antibody (human)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse p21Cip1 antibody (human)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward TBP antibody (human) reference gene&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>は、PrimerQuestツール(https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>逆TBP抗体(ヒト)でデザインされています&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td>は<td>、PrimerQuestツールによって設計されています(https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward Oxa1L抗体(ヒト)参照遺伝子&nbsp;&nbsp;CACTTGCCAGAGATCCAGAAG&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>がPrimerQuestツールによってデザインされました（https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse Oxa1L &nbsp;抗体(ヒト)&nbsp;&nbsp;&nbsp;CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Power SYBRGreen PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368702</td><td></td></tr><tr><td>FACS Tubes&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>551578</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学式 96ウェル反応プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC処理培養皿</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costar 細胞培養プレート 6ウェル</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵ベンチトップ微量遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵ベンチトップ遠心分離機 Jouan CR3.12</td><td>Jouan</td><td>743205604</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A28567</td><td></td></tr></tbody></table>

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

細胞周期の遺伝子発現プログラムは、細胞周期依存性プロセスおよび癌などの疾患におけるそれらの役割を理解するための重要なステップである。細胞周期調節遺伝子発現分析は、特定の段階への細胞の同期化に依存する。ここでは、細胞周期中の遺伝子発現の周期的変動を研究するために一般的に使用される2つの相補的な同期プロトコールを利用する方法を説明する。両方の手順は、定義された1つの点で細胞周期を一時的にブロックすることに基づいています。ヒドロキシ尿素（HU）処理による同期プロトコールは、G1 /初期S期後期に細胞停止をもたらし、HU媒介停止からの放出は、SおよびG2 / Mを介して一様に進行する細胞集団を提供する。チミジンおよびノコダゾール（Thy-Noc）処理による同期プロトコルは、初期有糸分裂において細胞をブロックし、Thy-Noc媒介停止からの放出は、G1期およびS期に適した同調細胞集団を提供する研究を試してみてください。両方の手順を適用するには、典型的には細胞のヨウ化プロピジウム（PI）染色およびフローサイトメトリーによるDNA含量分析の後に行われる細胞周期分布プロファイルのモニタリングが必要である。我々は、2つの同期プロトコルの併用は、細胞周期（ すなわち、 E2F1およびE2F7）において差次的に調節される遺伝子の転写プロファイルを明確に決定し、その結果、細胞周期におけるそれらの役割のより良い理解を有するプロセス。さらに、このアプローチは、遺伝毒性物質に応答する遺伝子を、細胞周期摂動のみによって影響を受ける遺伝子と区別することを可能にするため、薬物療法（ すなわち、抗癌剤）の基礎を成すメカニズムの研究に有用であることを示す。エージェントによって課される。

細胞同期のためのThy-NocおよびHUベースのプロトコルの概略図。 図1は、細胞周期の進行を確認し、遺伝子発現解析を行うために、U2OS細胞の同期化およびその後の試料採取に必要なステップをまとめたものです。 Phospho-H3およびPI染色は、同期方法を選択するための良好な評価パラメータである。 細胞同期手順は、培養細胞の固有の異質性のために、各細胞株について評価し、最適化しなければならない。有糸分裂における同期化はThy-Nocプロトコールで達成され、ノコダゾール処理後の有糸分裂細胞の濃縮は、典型的な有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストンH3（pH3）に特異的な抗体で評価することが...

我々は、細胞周期の特定の段階に関連する事象を研究するための状況を提供する2つの細胞同期プロトコールを報告する。我々は、このアプローチが、摂動のない細胞周期または細胞周期に影響を及ぼす薬剤への暴露で特定の遺伝子の調節を分析するのに有用であることを示す。

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

このプロトコルの総合的な目的は、細胞周期特異的な様式で遺伝子発現を解析するためのコンテクストを提供することです。この手法は、悪性転換および抗がん剤治療の根底にある細胞周期依存的な転写イベントに関連する、がん分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本プロトコルの主な利点は、2つの条件下および化学療法への曝露後における細胞周期相特異的な遺伝子発現パターンを正確に確立できることです。本実験ではU2OS細胞を使用します。後続の工程を勤務時間内に行えるよう、午後7時頃に100 mmディッシュに播種してください。その後、5% CO2を含む湿潤環境下、37 °Cで24時間インキュベートし、細胞を接着させます。翌日、細胞を観察し、コンフルエンシーが50%であることを確認します。チミジンブロックを行うため、100mm培養皿それぞれに、調製したばかりの200mMチミジンストック溶液を100μL添加します。チミジンを加えた細胞を、5% CO2濃度の加湿条件下、37℃で20時間インキュベートします。翌日の午後3時頃、チミジン含有増殖培地を除去し、チミジンブロックから細胞を解放します。あらかじめ温めておいた1X PBSで細胞を2回洗浄します。次に、各100 mmディッシュに完全培地10 mLを加えます。細胞を37 °Cで5時間インキュベートします。有糸分裂細胞周期停止させるには、最終濃度が50 ng/mLになるようにノコダゾールを添加します。細胞をノコダゾールで10〜11時間以内でインキュベートします。翌朝の午前6時から7時の間に、顕微鏡下で細胞を確認し、細胞が丸くなっていることで、実際にG2-M期で停止していることを確認します。各プレートを振盪させて有糸分裂細胞を剥離させ、剥離した細胞を含むノコダゾール含有増殖培地を100 mmプレートから穏やかにピペッティングして回収します。すべてのディッシュから回収した有糸分裂細胞を50 mL滅菌チューブにまとめます。4 °Cで5分間、300 ×gで遠心分離します。冷たい1X PBSを加えて細胞を2回洗浄し、続いて遠心分離を行います。2回目の洗浄後のPBSを除去した後、有糸分裂期の細胞を完全培地に再懸濁します。0時間目のタイムポイントとして、RNA抽出用に2 mL、およびFACS解析用に2 mLを保存します。後続のタイムポイントに向けて、残りの有糸分裂細胞を6ウェルプレートに再播種します。この手順を開始するには、6ウェルプレートの1ウェルあたり0.25 × 10⁶個のU2OS細胞を播種してください。各6ウェルプレートのカバーに、各ウェルの実験条件を記入します。例えば、未処理のもの、あるいは異なる薬剤濃度および時間で処理したものです。6ウェルプレートをオーバーナイトでインキュベートし、細胞を接着させます。翌朝、細胞を確認し、コンフルエンシーが50%であることを確認してください。ウェルから完全培地を除去し、あらかじめ温めておいたFBS不含DMEM-Glutamine培地を1ウェルあたり2 mL加えます。細胞をさらに24時間インキュベートします。ヒドロキシウレアを用いて細胞周期を停止させるには、ウェルから培地を除去し、新鮮に調製した4 µMヒドロキシウレア含有完全培地と交換します。ヒドロキシ尿素含有培地で細胞を24時間インキュベートする。ヒドロキシ尿素による停止から細胞を解放する前に、細胞が停止していることを確認する。ウェルからヒドロキシ尿素含有培地を除去し、あらかじめ温めておいた1X PBSでウェルを2回洗浄する。2回目の洗浄後にPBSを除去し、1ウェルあたり2 mLの完全培地を加えます。サンプル回収までプレートをインキュベーター内で保持します。両方の同期プロトコルによるサンプルは、同じ方法で回収し、FACS解析およびRNA抽出に用います。FACS解析を行うため、各ウェルをあらかじめ温めておいた1X PBS 2 mLで洗浄し、次に、あらかじめ温めておいたTrypsin-EDTA溶液 0.3 mLを加えて細胞を剥離させます。5分後、完全培地 1 mLを加えてTrypsin-EDTAを不活化します。各サンプルを個別の15 mLチューブに回収してください。室温にて 300 ×g で5分間、細胞を遠心分離します。上清を捨て、1X PBS で洗浄し、再度遠心分離を行います。PBS を除去し、細胞ペレットを回収します。細胞を固定するために、各細胞ペレットを1 mLの冷却した70% ethanolに再懸濁し、穏やかにボルテックスします。プロピジウムヨード染色およびFACS解析の前に、細胞を氷上で約15分間静置します。RNA抽出の場合は、培地を除去し、各ウェルを2 mLの予熱した1X PBSで洗浄します。プレートを安全キャビネットに移動させ、ウェルあたり1 mLの適切なRNA抽出試薬を加えます。ピペッティングして細胞を溶解させた後、各細胞溶解液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。室温で5分間インキュベートします。RNA抽出の手順を開始するため、RNA分離試薬を含むサンプルが入ったマイクロ遠心チューブをフリーザーから取り出し、化学薬品用安全キャビネット内で室温で解凍します。各サンプルに400 µLのクロロホルムを加え、完全に混ざるまでボルテックスせずに激しく振盪します。サンプルを室温で5分間インキュベートします。卓上マイクロ遠心機を用いて、チューブを15分間遠心分離します。各サンプルの水層を新しい1.5 milliterマイクロ遠心チューブに移します。混合しながら、水層に1等量の100%ethanolをゆっくりと一滴ずつ加えます。遠心分離は行わないでください。沈殿物を含む各サンプルを最大 700 µL まで、市販の RNA mini-prep キットに付属する 2 mL コレクションチューブに入ったスピンカラムに移し、蓋を閉めます。15 秒間遠心分離します。フロースルーを廃棄します。1サンプルあたりの開始量が700 µLを超える場合は、残りのサンプルをスピンカラムに移し、再度遠心分離を行います。製造元の指示に従ってRNAを洗浄した後、各サンプルに30～40 µLのヌクレアーゼフリー水をスピンカラムに分注し、室温で1分間遠心分離して溶出させます。吸光度測定により、サンプルのRNA濃度および純度を決定します。遺伝子発現解析に使用するまで、RNAサンプルを-80 °Cで保存します。Thymidine-Nocodazoleプロトコルによる処理は、U2OS細胞をM期進入で停止させ、フローサイトメトリー解析で示されるように、G1期を経てS期へと同期的に進行する細胞集団を提供します。ヒドロキシウレアプロトコルによる処理は、細胞をG1/S境界で停止させます。解除後、細胞はS期およびG2期を同期して移行します。チミジン-ノコダゾールプロトコルは、G1期に発現のピークを持つ遺伝子のmRNAプロファイルを解析するのに最も適しています。E2F1の発現について示した通りである。対照的に、Hydroxyureaプロトコールは、E2F7の発現で示されているように、S期またはG2期に優先的に発現する遺伝子の解析により適している。細胞周期は通常、抗腫瘍薬によって乱される。ここでは、hydroxyureaで同期化した細胞において、mitomycin Cが恒久的なG2期停止を誘導したことを示している。細胞周期の同期化を行うことで、抗腫瘍剤に反応する遺伝子と、薬剤によって引き起こされる細胞周期の摂動のみによって影響を受ける遺伝子とを区別することが可能になります。例えば、マイトマイシンC処理後のE2F1 mRNAレベルの低下は、薬剤が細胞周期のダイナミクスに及ぼした間接的な影響である可能性が高いと考えられます。対照的に、マイトマイシンC処理後のp21-Cip1 mRNA発現のピークは、この薬剤によって誘発された転写プログラムの直接的な結果です。この手順に従ってゲノムワイドなトランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析を行うことで、特定の細胞周期期に影響を与える全般的な遺伝子発現変化を明らかにすることができます。2つの条件、または抗腫瘍治療後のいずれかで行います。このビデオを視聴することで、同期化した細胞培養において遺伝子発現解析を行うために必要な手順を十分に理解できるはずです。プロピジウムヨードやRNA抽出試薬の使用は非常に危険であるため、本手順の実施中は、手袋の着用や化学薬品用安全キャビネットの使用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。...

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

細菌細胞の同期は、細菌の細胞周期と発生の研究に不可欠です。 Caulobacter crescentusは、密度遠心分離によって同期可能であり、細菌細胞周期の研究に迅速かつ強力なツールを提供します。...

の同期<em&gt;カウロバクターCrescentus</em&gt;細菌細胞周期の調査のため

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。...

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S...

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

このプロトコルは、レーザーマイクロ照射によるDNA修復タンパク質の採用測定など、下流顕微鏡研究のためのS相細胞を効率的に同定するための非侵襲的な方法を記述する。...

S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射

同期時系列実験を分析する際の課題の1つは、実験によって同期からの回復の長さと細胞周期期間が異なることが多いことです。したがって、異なる実験からの測定値をまとめて分析したり、容易に比較したりすることはできません。ここでは、フェーズ固有の比較を可能にするために実験を調整する方法について説明します。...

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

次のプロトコルはRPA2 immunofluorescent stainingに先行している細胞周期の同期を利用して細胞周期のG1段階のsingle-stranded...

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S.

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

ここでは、ヒト膵島細胞と初代筋管の概日生物発光と分泌活性を並行して監視するための設定について説明します。このために、ルシフェラーゼコアクロックレポーターのレンチウイルス遺伝子導入を採用し、続いてin...

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

学ぶ 2つの相補的細胞同期プロトコルを用いた細胞周期特異的遺伝子発現解析法。U2OS細胞を使用し、チミジン・ノコダゾール法とヒドロキシ尿素法でG1期およびS/G2期の発現パターンを正確に解析できます。

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

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