出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析
2025年9月26日
このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S. cerevisiaeの細胞周期依存性プロセスを研究するための蛍光顕微鏡の使用について詳しく説明します。
私たちは、分裂する細胞が有糸分裂中に染色体を忠実に伝達する方法を研究し、正確な染色体分離を保証する分子機械やメカニズムに焦点を当てています。細胞を同期させて、細胞周期に伴う分子プロセスの研究を行います。これらの方法がなければ、重要な変化は同期していない細胞集団の中で隠れてしまいます。
他の同期法と比較して、BAR1変異体におけるアルファクター停止はよりクリーンで可逆的なG1停止を提供し、酵母培養全体が周期を同期的に進行している様子を追跡することを可能にします。私たちの研究は、細胞周期を通じて動的なタンパク質の局在化と活性変化を明らかにし、染色体分離やスピンドル維持といった主要な有糸分裂過程に光を当てています。まず、酵母を25ミリリットルのYPAD培地に接種し、一晩培養して600ナノメートルの0.5から2.0の光学密度に到達させます。
酵母細胞を600ナノメートルの0.5の光学密度に希釈します。培養液にアルファクターを加え、最終濃度は1ミリリットルあたり1マイクログラムにします。α因子加成後2.5〜3.5時間後に顕微鏡で出芽していないシュムー細胞の割合を数え、細胞停止を評価します。
その後、3,000gの遠心分離機で23度の水温で3〜5分間、培養液をスピンダウンします。アルファ因子を除去するために上清液を慎重に注ぎます。細胞ペレットを1%ジメチルスルホキシドを含むYPAD25ミリリットルに再懸浮させて洗浄します。
細胞ペレットを新しいチューブに移し、残留アルファファクターを除去するために合計3回洗浄を繰り返します。次に、洗浄した細胞にYPADを加えて最終体積を25ミリリットルにし、懸濁液を新しいフラスコに移してさらなる培養または使用を行います。放出直後にゼロ分の時刻点サンプルを採取し、サンプルを固定します。
放出後60分後、細胞集団の同期を光学顕微鏡で評価します。必要に応じて、放出後60分後に再度アルファクターを1マイクログラム/ミリリットルの濃度に加え、次の細胞周期への進行を阻止します。15分ごとから180分ごと、または必要な期間、タイムポイントサンプルの採取を続けてください。
酵母細胞を固定するには、最大速度で1ミリリットルの培養物を1分間遠心分離します。上清液を完全に吸引します。その後、ペレットを500マイクロリットルの固定液に再懸浮させ、23度Cで2〜15分間培養します。
固定細胞を遠心分離した後、上清液を吸引し、pH6.4の0.1モルリン酸カリウムバッファー500マイクロリットルに再懸浮させます。画像撮影前に、固定セルを23度の温度で最大速度で1分間遠心分離します。上清液を吸引したら、トリトン、DAPI、ソルビトール溶液を10〜100マイクロリットルに再懸浮させます。
染色セル懸濁液を約0.8マイクロリットルをクリーンなカバースリップの中心に直接ピペットで抽出します。ピペットの先端を使って、液滴を約1平方センチメートルの円形の領域に優しく広げます。カバースリップを顕微鏡スライドに置きます。
キムワイプを使ってカバースリップの縁を優しく押してサンプルを均等に広げます。その後、カバースリップの端をネイルポリッシュで封印し、サンプルを固定します。用意したスライドを、60倍倍、1.42の数倍絞りオイル浸漬対物レンズ、赤・緑・青・遠赤のレーザーとフィルターセットを備えた顕微鏡に持っていきましょう。
顕微鏡をカバースリップに付着した酵母細胞に焦点を合わせてください。ピントが合ったら、各蛍光チャンネルの露光設定を調整し、信号対雑音比を少なくとも3対1にします。取得設定を調整し、各スライスを0.2マイクロメートル間隔で14〜20枚のzスタック画像を収集し、合計2〜4マイクロメートルのz深度をカバーします。
ポストプロセッシングモジュールを搭載した顕微鏡では、各Zスタック画像に対してデコンボリューションとクイックプロジェクションのオプションを選択します。サンプルのzスタックを取得し、各実験条件や時刻ごとに約100〜200個の酵母細胞を記録できるだけの画像を撮影します。解析のために、ImageJソフトウェアで投影画像を開きます。
各蛍光チャネルの明るさとコントラストを調整して視認性を高めます。細胞周期の進行を分析するには、各時間点に100個の細胞を数え、それらを1つまたは2つの核を含むものに分類します。Stu2-GFPの点を示すセルの割合を計算するには、すべての画像で緑チャンネルの明るさ設定を標準化してください。
Stu2-GFP点と共局在するStu2-GFP点を示すカウント細胞。Cherry脈点はキネトコア局在が陽性であること。次に、タンパク質の点の強度を定量化するために、フリーハンド選択ツールを使って信号の周囲の関心領域を定義します。選択はTキーキーまたはROIマネージャーメニューから選択することで、興味地域マネージャーに追加してください。
ROIマネージャーで「測定」をクリックして、句点強度を計算します。時間経過の変化を可視化するために、各時点の平均強度を95%信頼区間でプロットします。各疾患ごとに約100個の細胞を数えます。
G1抑制細胞では、Stu2-GFPは単一の紡錘極近位点に局在し、細胞質微小管に沿ってさらに分散信号が送られました。放出から60分後、Stu2-GFPはSpc110-mCherryでマークされた重複されたスピンドルポールに隣接する2つのポイントとして局在化しました。90分後期の終相期で、Stu2-GFPは紡錘極付近と単一軸にわたる微小管沿いの両方に現れました。
有糸分裂の終了後、120分にStu2-GFPは細胞質のアストラル微小管に再出現しました。定量化により、紡錘体極付近のStu2-GFP強度は初期有糸分裂中に増加し、後期期前にピークを迎えた後に低下することが明らかになりました。二核細胞の割合は約90分でピークを迎え、同時期に後期に入ったことを示しています。
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概要
この研究は、同期化された細胞周期を利用して細胞のダイナミクスを観察し、酵母（S. cerevisiae）細胞が分裂時に染色体分離をどのように管理するかを調査します。BAR1変異体でアルファ因子の阻害を用いることで、研究者は細胞周期全体を通じてタンパク質の局在と活性の変化を監視するための精密なG1期阻害を達成できます。
主要な研究構成要素
研究分野
- 細胞周期制御
- 染色体分離
- 顕微鏡技術
背景
- 同期化された細胞周期は、非同期化された集団では隠れている分子プロセスを明らかにします。
- 細胞周期全体を通じたタンパク質の局在の変化は、分裂を理解する上で重要です。
- アルファ因子による阻害は、代替案よりもきれいな同期化方法を提供します。
使用した方法
- タンパク質の局在をイメージングするための蛍光顕微鏡
- 生物学的モデルとしてのSaccharomyces cerevisiae
- G1期同期化とその後の解放技術のためのアルファ因子処理
主要な結果
- タンパク質の局在の動的な変化が観察されました。特に、分裂時のStu2-GFPが挙げられます。
- 解放後約90分で二核細胞のピークが確認され、これはアナフェーズへの同期化された進行を示しています。
- タンパク質の点状の強度を定量化することで、異なる細胞周期段階と相関する重要な変化が明らかになりました。
結論
- この研究は、分裂過程を調査するために酵母の細胞周期を同期化する正確な方法を効果的に示しています。
- この研究は、細胞分裂と染色体の挙動に関するより広範な生物学的理解に影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell cycle synchronization in budding yeast enables precise interrogation of dynamic molecular processes critical for chromosome segregation and mitotic fidelity. These methods provide high-resolution temporal control, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. Robust synchronization and quantitative imaging outputs facilitate risk-adjusted portfolio decisions in cell cycle-targeted R&D programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous testing of cell cycle-dependent hypotheses by isolating specific cell cycle phases.
- Supports mechanistic de-risking through direct observation of protein localization and activity changes.
- Facilitates functional validation of mitotic regulators and pathway components.
- Provides quantitative benchmarks for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers synchronized cell populations for reproducible assay development and compound screening.
- Standardizes biological context, reducing variability in phenotypic readouts.
- Enables quantitative measurement of protein dynamics and cell cycle progression.
- Supports scalability and platform reuse for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast model outputs with conserved eukaryotic cell cycle machinery for translational relevance.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of mitotic targets.
- Enables risk-adjusted advancement of cell cycle-modulating agents based on mechanistic insights.
- Supports biomarker identification through quantitative imaging of cell cycle transitions.
Pipeline & Workflow Integration
Cell cycle synchronization and quantitative imaging position this method at the interface of early discovery, lead identification, and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling phase-specific molecular interrogation.
- Screening: Provides reproducible, synchronized populations for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of protein localization, abundance, and cell cycle progression for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges yeast model findings to higher eukaryotes via conserved cell cycle mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse cell cycle-dependent analyses across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell cycle-targeted research.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of cell-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mitotic and cell cycle-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, cell culture, and quantitative fluorescence microscopy.
- Demands access to high-resolution imaging platforms and analytical software (e.g., ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of synchronization protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various strain backgrounds and compatible with live or fixed cell analyses.
- Potential limitations include model-specific differences and the need for careful control of synchronization efficiency.
