有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた
December 5th, 2017
高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S 期から同期的に進めるセルを取得するキーです。
この手順の全体的な目標は、ダブルチミジン同期と高分解能共焦点顕微鏡を使用して、重要な間期機能を持つ可能性のある多機能タンパク質の有糸分裂の役割を研究することです。この方法は、細胞周期と有糸分裂に関与するタンパク質の正常な機能をどのように描写するかという、細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞が正常な生理学的挙動を維持できることと、この方法も非常に簡単に実行できることです。
この手順を実演するのは、この方法の使用の専門家である私の研究室のポスドクであるモハメッド・アミン博士です。有糸分裂細胞の進行を固定細胞イメージングするには、まず、70%エタノールとUV滅菌したカバースリップと2ミリリットルのDMEM培地を含む6ウェルプレートの各ウェルに、5番目のHeLa細胞を約2倍10回播種します。細胞培養インキュベーターで24時間後、ウェルごとに2ミリリットルの新たに希釈したチミジンと新鮮な培地で細胞をブロックし、プレートをさらに18時間インキュベーターに戻します。
翌日、細胞を2ミリリットルのPBSで2回、1回は新鮮な37°Cの培地で洗浄します。細胞をインキュベーターに9時間戻してブロックから細胞を放出し、続いてウェルごとにさらに2ミリリットルのチミジン添加培地を追加します。2回目のブロッキングインキュベーション後、細胞を2ミリリットルのPBSで2回、2ミリリットルの新鮮な37°C培地で1回洗浄し、調製したばかりのsiRNAを100ナノモルの適切なウェルに加えます。
9〜10時間後、上清を吸引し、細胞を4%パラホルムアルデヒドでカバースリップに室温で20分間固定します。PBSで洗浄した後、固定細胞を0.5%界面活性剤で室温で10分間透過処理し、続いてPBSで5分間2回洗浄します。PBS中の1パーセントBSAで細胞を室温で1時間ブロックします。
次に、目的の一次抗体50マイクロリットルで細胞を標識し、摂氏37度で1時間待ちます。インキュベーションの終了時に、細胞をPBSで3回洗浄し、目的の適切な二次抗体50マイクロリットルで標識します。室温で1時間後、細胞をPBSで2回、各洗浄で5分間洗浄し、細胞をDAPIで室温で5分間標識します。
PBSで5分間の洗浄を2回行い、DAPI染色を行った後、適切な封入剤を使用して、個々の透明な顕微鏡スライドにカバースリップをマウントします。次に、適切なカメラを装備した倒立型高分解能共焦点顕微鏡に取り付けた60または100 X 1.4の開口数プランアポクロマートDIC油浸対物レンズを使用して、厚さ0.2μmのZスタック内の免疫染色タンパク質の画像を取得します。有糸分裂細胞の進行をライブセルでイメージングするためには、mCherry H2BとGFP α-tubulinを安定して発現する10〜5番目のHeLa細胞を、1.5ミリリットルのDMEM培地を含む35ミリリットルのガラス底皿に約0.5〜1倍播種します。
細胞培養インキュベーターで24時間細胞を増殖させます。次に、チミジンは、ちょうど示したように細胞を2回ブロックし、今回は2ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄し、1回は各チミジンブロックの最後に1ミリリットルの予熱したDMEM培地で洗浄し、最初のチミジンウォッシュアウト中に最初のブロック後に細胞をsiRNAで処理します。温めた新鮮なLeibovitz培地で細胞を増殖させ、10%FBSと20ミリモルHEPESを8時間補充して、2番目のブロックから細胞を放出します。
次に、最初のプレートを高分解能共焦点顕微鏡の温度制御チャンバーに置き、60倍対物レンズと明視野イメージングを使用して細胞に焦点を合わせます。細胞が見えたら、プレートの位置を選択した領域に手動で調整し、画像取得ソフトウェアを使用してレーザー出力と露光、画像取得パラメータ、および実験期間を設定します。適切なGFPフィルターとmCherryフィルターを選択し、10分ごとに最大16時間、パルス透過光と蛍光画像を取得して、有糸分裂プロセスのタイムラプス画像を取得します。
ダブルチミジンブロックから放出されてから9時間後、1マイクロメートル離れた12個のz面で画像を取得します。次に、個々の有糸分裂細胞を追跡して画像を分析し、適切なソースソフトウェアを使用して対応するムービーを組み立てます。ほとんどの対照細胞とCdt1 siRNA細胞は、ダブルチミジンブロックからの放出後9時間で中期段階にありますが、10時間での固定により、Cdt1 siRNA処理細胞のほとんどが後期中期でまだ停止しているのに対し、対照細胞は後期に入り、予想通り染色体を分離することが明らかになります。
ダブルチミジンブロックからの放出から9時間後の低温処理は、制御された枯渇細胞内の細胞と比較してCdt1枯渇細胞の比較的堅牢性が低い安定した動原体微小管の保持を促進します。G2-M期のCdt1またはコントロール枯渇細胞では、DNA損傷のマーカーであるリン酸化γH2AXの蓄積を誘導することが見出されなかったため、DNA複製起源のライセンシングは、G2-M期に乱されません。しかし、非同期培養物のCdt1 siRNAトランスフェクションは、おそらく不適切なDNA複製ライセンスによって誘発されるDNA損傷のために、リン酸化γH2AX陽性病巣の蓄積を誘導します。
核膜が破壊された後、正常な細胞は有糸分裂に入り、約30〜60分以内に有糸分裂から出るために後期発症します。しかし、強固な動原体微小管の付着形成に必要な重要な動原体タンパク質であるHec1のRNAi媒介ノックダウンは、正常な有糸分裂の進行を遅らせ、無期の開始または有糸分裂からの退出を数時間遅らせます。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば3〜4日で完了することができます。
手順を試みている間、冷凍庫から解凍した後、チミジンを完全に溶解することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、ウェスタンブロッティングなどの他の方法を実行して、有糸分裂中の関心のあるタンパク質の発現パターンは間期と比較してどのようなものか、などの追加の質問に答えることができます。この技術は、その開発後、細胞生物学の分野の研究者がヒト細胞培養モデルでがんの生合成を探求し、高解像度共焦点顕微鏡を使用して関心のあるタンパク質の細胞周期関連機能を特定する道を開きました。
パラホルムアルデヒドやDAPIなどの試薬の取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
このプロトコルは、HeLa細胞の二重チミジン同期の使用と、それに続く高解像度共焦点顕微鏡分析を概説しています。このアプローチは、間期機能も持つ多機能タンパク質の有糸分裂における役割の研究を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 細胞周期制御
- 顕微鏡技術
背景
- 細胞周期を理解することは、細胞機能への洞察を得るために重要です。
- 多機能タンパク質は、間期と有糸分裂の両方で重要な役割を果たします。
- 高解像度イメージング技術は、細胞プロセスを観察するために不可欠です。
- 二重チミジン同期は、同期化された細胞集団を得るための方法です。
研究の目的
- 間期機能を持つタンパク質の有糸分裂における役割を調査すること。
- 細胞周期進行に関与するタンパク質の正常な機能の理解を深めること。
- 細胞周期ダイナミクスを研究するための効果的な方法を示すこと。
使用された方法
- 六ウェルプレートにHeLa細胞を播種すること。
- 細胞周期を同期させるためにチミジンで細胞をブロックすること。
- イメージングに高解像度共焦点顕微鏡を使用すること。
- 手順中の細胞の正常な生理学的挙動を維持すること。
主要な結果
- S相から有糸分裂までのHeLa細胞の成功した同期化。
- 共焦点顕微鏡を用いた有糸分裂プロセスの明確な可視化。
- 細胞分裂中の多機能タンパク質の役割に関する洞察。
- 同期化方法の実行の容易さを実証。
結論
- 二重チミジン同期方法は細胞周期ダイナミクスを研究するのに効果的です。
- このアプローチにより、有糸分裂におけるタンパク質機能の調査が可能になります。
- 高解像度イメージングは細胞プロセスに関する貴重なデータを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to isolate mitotic functions of multifunctional proteins that also regulate interphase processes, reducing target validation ambiguity. By synchronizing cell populations and applying high-resolution confocal microscopy, researchers obtain quantitative, phase-specific data essential for mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by distinguishing mitotic from interphase roles, informing go/no-go decisions in oncology and cell cycle-targeted therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating mitotic roles of proteins with dual interphase/mitotic functions.
- Operational Value: Enables functional target validation through phase-specific perturbation and imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether observed phenotypes stem from mitotic or interphase activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized mitotic cell populations for consistent, reproducible compound or siRNA screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of mitotic progression, chromosome alignment, and segregation defects as assay endpoints.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging platforms for multi-well format adaptation and large sample acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic defects observed in synchronized cells model chromosomal instability relevant to cancer phenotypes.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target validation to preclinical models via conserved mitotic mechanisms.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight to prioritize targets with reduced likelihood of on-target interphase toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mitotic-specific functional data before compound screening or phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling conditional depletion and visualization of protein function in defined mitotic stages.
- Screening: Generates standardized, synchronized mitotic cells suitable for assay-dependent readouts like kinetochore-microtubule stability or anaphase timing.
- Analytics: Delivers quantitative imaging metrics (e.g., metaphase-to-anaphase transition, kinetochore fiber intensity) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mitotic protein function to chromosomal stability phenotypes with relevance to preclinical cancer models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synchronization and imaging workflow applicable across multiple targets in the cell cycle and mitosis space.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by separating mitotic from interphase protein functions.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible cell preparation and imaging compatible with confocal microscopy workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing phase-resolved functional data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying proteins with selective mitotic roles and lower interphase liability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture synchronization, siRNA transfection, and immunofluorescence or live-cell imaging protocols.
- Depends on access to high-resolution confocal microscopy with Z-stack capability and appropriate laser/filter sets for GFP, mCherry, and DAPI.
- Necessitates standardization of thymidine block/release timing and fixation/permeabilization conditions across users and cell lines.
- Adaptation to non-HeLa systems may require optimization of synchronization efficiency and mitotic marker expression.
- Practical limitations include the need for careful toxin handling (paraformaldehyde, DAPI) and potential siRNA off-target effects requiring controls.
