卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製
June 15th, 2017
マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。
このプロトコルの全体的な目標は、卵子のマイクロインジェクションによる遺伝子組み換えマウスの作製を成功させるために必要な手順を説明することです。このプロトコールは、マウスの創生の分野だけでなく、遺伝子の標的化にも関与する研究者や技術スタッフに役立ちます。この技術の主な利点は、ランダムインテグレーションだけでなく、遺伝子ターゲティングのためにマウス卵子の直接注入に依存していることであり、わずか6週間で遺伝子組み換えマウスを作製できます。
単一のガイドRNAを調製するには、所望の2つの標的配列を選択し、テキストプロトコールに従ってプライマーを作製した後、PX330プラスミドをヌクレアーゼフリー水で1マイクロリットルあたり10ナノグラムに希釈することにより、線状DNAテンプレートを合成します。マスターミックスを調製し、最後にポリメラーゼを加え、氷の上に保ちます。次に、溶液を混合して8本のPCRチューブに分割します。
チューブごとに1マイクロリットルのPXR330を追加し、次のプログラムを実行します。次に、PCR精製キット、マニホールド、真空源を使用してPCR産物を精製します。PCRサンプルの1容量に5容量の結合バッファーを加えて混合します。
シリコンメンブレンスピンカラムをマニホールドに載せます。DNAを結合するには、8つのサンプルすべてを真空中でカラムに適用します。サンプルを洗浄するには、0.75ミリリットルの洗浄バッファーをカラムと真空剤に加えます。
次に、カラムを12, 000倍Gで60秒間遠心分離し、残留エタノールを除去します。カラムを清潔な 1.5 mL のマイクロ遠心チューブに入れ、DNA を溶出するために、メンブレンの中心に 30 μL のヌクレアーゼフリー水を加えます。カラムを1分間放置し、Gを12,000回60秒間遠心分離します。
次に、分光光度計を使用してDNA濃度を測定します。t7 RNA合成キットを使用してin vitro転写を行うには、マスターミックスを調製し、反応を摂氏37度のサーモサイクラーで3時間インキュベートします。28マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水と2マイクロリットルのDNAse oneを加え、さらに15分間反応をインキュベートします。
RNAを精製するには、付属のスピンカラムに含まれる粉末と650マイクロリットルのヌクレアーゼフリーマイクロインジェクションバッファーを溶解します。すべての気泡を慎重に取り除き、チューブにキャップをし、溶液を室温で5〜15分間水和させます。下部の青いキャップを取り外し、カラムを2ミリリットルのチューブに入れます。
次に、チューブをGの750倍で室温で2分間遠心分離します。次に、カラムを新しい1.5ミリリットルのチューブに入れ、カラム壁に触れずに、50マイクロリットルのRNA溶液を中心に向かって慎重に塗布します。その後、カラムをGの750倍で2分間回転させます。
RNA濃度を測定し、テキストプロトコルに従ってRNAの品質を評価します。ヌクレアーゼフリーマイクロインジェクションバッファーを使用して、ケース9 mRNAを50ナノグラム/マイクロリットルに希釈し、sgRNAを1マイクロリットルあたり12.5ナノグラムに希釈して遺伝子ノックアウト実験を行います。ホモロジー直接修復に基づくゲノム編集のために、マイクロリットルあたり200ナノグラムの濃度でドナーテンプレートを添加し、氷上に保ちます。
吸引器のマウスピースを使用して、卵母細胞を4滴の新鮮なカゼインアミノ酸で洗います。そして、それらを鉱油で覆った最後の一滴のcasome eight mediumに移します。ランダム統合のためのプロ核注入を実行するには、実体顕微鏡下で、吸引器のマウスピースを使用して、約50個の卵をm2培地の滴に変換し、注入チャンバーとして使用される鉱油で覆います。
注入チャンバーを倒立顕微鏡に移し、受精卵子に数ピコリットルの注射混合物を注入します。注射が成功すると、前核が腫れます。遺伝子ターゲティングのための細胞質注射を行い、マウスピースを使用して約50個の卵を1ミリリットルあたり5マイクログラムのサイトカラシンBを含むカソームAの滴に移し、卵を摂氏37度および二酸化炭素5%で5分間インキュベートします。
卵子を注入チャンバーに移し、次に非常に低い圧力で、数ピコリットルの注入混合物を細胞質に注入します。可能な場合は、自動マイクロインジェクターの補償圧力を使用します。注射後、マウスピースを使用して卵子をカソメアミノ酸の滴に戻します。
疑似妊娠中の女性の卵管に再移植するためにロードされるまで、摂氏37度と二酸化炭素5%に保ちます。テキストプロトコルに従って詰まった雌マウスに麻酔をかけた後、無菌条件下で再移植を行うには、背側正中線に平行な長さ1センチメートルの切開部にメスを使用して生殖管を露出させます。次に、はさみで筋肉を切り、鉗子を使用して脂肪パッドをつかみます。
卵巣をそっと引き出し、付着した卵管と子宮がはっきりと見えるまで引き出します。次に、ベッセルクランプを使用してファットパッドを固定します。実体顕微鏡下で、マイクロハサミを使用して、膨大部の数ミリメートル上流にある卵管の壁に切開を行います。
また、実体顕微鏡下で、マウスピースに接続されたガラスキャピラリーに25個のマイクロ注入卵をロードします。次に、ガラスキャピラリーを卵管に挿入し、膨大部の内側に気泡が見えるまで卵子を排出します。再着床が成功したことを確認するには、膨大部に気泡が存在するかどうかを確認する必要があります。これにより、すべての卵子が正しい場所に排出され、ガラスキャピラリーに何も残っていないことが保証されます。
ガラスキャピラリーをそっと取り外し、生殖管を腹部に戻します。次に、3つのゼロの非吸収性の外科用縫合糸を使用して切開部を縫合し、次に創傷クリップを使用して皮膚を閉じます。低体温を避けるためにマウスを暖かいマットの上に置き、鎮痛剤を皮下に注射します。
完全に回復するまでマウスを監視します。最後に、テキストプロトコルに従ってゲノムタイピングとシーケンシングを行います。この図は、遺伝子改変マウスの作製に重要な導入遺伝子精製とsgRNA合成の品質を示す分析ゲルを示しています。
ここに示されているのは、ランダム積分のためのマイクロインジェクションセッションの一般的な読み出しです。ジェノタイピングプライマーは導入遺伝子上に位置し、200〜800塩基対のフラグメントを生成するように設計する必要があります。この遺伝子ターゲティングの読み出しでは、最終的に2人によって切除された領域外のゲノムDNAとハイブリダイズするために選択されたプライマー
。この戦略により、ヘテロ接合型およびホモ接合型のノックアウト創始者を直接同定することができます。ここに示すように、プロトコルの各ステップが最適化されると、トランスジェニック仔の割合はランダム統合で10%から25%に達するはずですが、これはCRISPRコンポーネントがマウスゲノムを編集する能力と比較してやや低いです。遺伝子ターゲティングにCRISPRを使用すると、創始者の数は一般的に25%から100%の範囲であり、CRISPRを使用して編集するとホモ接合性に成功した子孫全体が得られることは珍しくありません。
この技術の開発後、この技術により、神経科学やがんなどの分野の研究者は、新しいマスクモデルを使用して病理学的メカニズムを発見し、最終的にはこれを治療戦略に変換することができます。
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概要
このプロトコルは、卵母細胞のマイクロインジェクションを通じて遺伝子組み換えマウスを生成する手順を概説しています。古典的なトランスジェネシスとCRISPRを用いた遺伝子標的化の両方において、品質管理とジェノタイピング戦略の重要性を強調しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 遺伝学
- トランスジェネシス
- 遺伝子標的化
背景
- マイクロインジェクションは遺伝子組み換え生物を作り出すための重要な技術です。
- ランダムなトランスジェンの組み込みと標的遺伝子編集の両方を可能にします。
- 品質管理は遺伝子組み換えの成功に不可欠です。
- CRISPR技術は遺伝子標的化の精度を高めます。
研究目的
- マウスの卵母細胞へのマイクロインジェクションの詳細なプロトコルを提供すること。
- 研究者が効率的に遺伝子組み換えマウスを生成することを支援すること。
- マイクロインジェクション技術の最新の進歩を強調すること。
使用された方法
- 選択した標的配列を使用した単一ガイドRNAの調製。
- PX330プラスミドからのリニアDNAテンプレートの合成。
- PCR増幅用のマスターミックスの作成。
- 遺伝子改変のための卵母細胞への直接マイクロインジェクション。
主な結果
- 約6週間で遺伝子組み換えマウスの成功的な生成。
- 効果的な品質管理措置の実証。
- 改変の確認のためのジェノタイピング戦略の検証。
- マイクロインジェクション技術の理解の向上。
結論
- マイクロインジェクションは遺伝子組み換えマウスを作成するための信頼性の高い方法です。
- 品質管理とジェノタイピングは成功した結果に不可欠です。
- このプロトコルは遺伝学の研究者にとって貴重なリソースとなります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Genetically modified mouse models generated via oocyte microinjection are foundational for validating disease mechanisms and interrogating therapeutic hypotheses in preclinical research. The integration of CRISPR-based gene targeting with rigorous genotyping and quality control enables rapid, reproducible creation of knockout and knockin models, directly impacting target validation and translational continuity. This capability supports risk-adjusted portfolio decisions and accelerates early discovery to preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional interrogation of gene targets in vivo for mechanistic de-risking.
- Supports generation of both overexpression and loss-of-function models for pathway clarification.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target confidence assessment in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Provides validated genetic backgrounds for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Ensures reproducibility and standardization through robust genotyping and quality control.
- Enables scalable colony establishment for high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic models with disease mechanisms for translational biomarker development.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation using precise genome editing.
- Reduces biological risk by enabling predictive in vivo studies prior to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection-based workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical model generation, supporting seamless progression from hypothesis to in vivo validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and mechanistic de-risking via rapid generation of genetically defined models.
- Screening: Delivers reproducible, quality-controlled models for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative genotyping and sequencing outputs for robust founder identification and model characterization.
- Translational Research: Enables alignment of genetic modifications with disease-relevant endpoints for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for ongoing model generation across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility through rigorous quality control and genotyping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, CRISPR guide design, and genotyping analysis.
- Demands access to specialized instrumentation for oocyte handling and microinjection.
- Necessitates cross-team standardization of quality control and genotyping protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic backgrounds or disease models.
- Efficiency and founder rates depend on optimization of each procedural step.
