Name: 卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 学ぶマウス卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウス作製法。CRISPR技術を用いた遺伝子ターゲティングと品質管理、ゲノタイピング戦略を含む詳細なプロトコルで、約6週間で遺伝子改変マウスを効率的に作製できます。

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著者らは、継続的な支援のために動物施設（BRC）のスタッフに感謝しています。この研究は、国家保健医療研究評議会とオーストラリア研究評議会によって資金提供された。

<ol><li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li>
<li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li>
<li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarantz+Henig%2C+R+%22The+Monk+in+the+Garden%22">The Monk in the Garden</a>. , Mariner books. (2000).</li>
<li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li>
<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li>
<li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li>
<li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li>
<li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li>
<li>Ittner, L. M., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>CRISPR DESIGN. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://crispr.mit.edu">http://crispr.mit.edu</a> (2017).</li>
<li>Integrated DNA Technologies. Resuspension Calculator. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017).</li>
<li>BioTools at UMass Medical School. Primer3: WWW primer tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi">http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</a> (2017).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li>
<li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency%2C+aneuploidy+rates%2C+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49(2012).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout%2C+single-amino-acid-substituted%2C+and+floxed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88(2001).</li>
<li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431(2016).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+via+CRISPR%2FCas9+mediated+homology-independent+targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li>
<li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li>
<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Pol%22%5BJournal%5D)">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li>
<li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li>
<li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+culture+medium%3A+making+informed+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li>
<li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="https://www.omicsgroup.org/journals/cloning-transgenesis-abstract.php?abstract_id=50992">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li>
</ol>

著者らは、ニューサウスウェールズ大学のMark Wainwright Analytical Centerを介して、マウスで学術的トランスジェニックサービスを提供しています。

プロトコル内の重要なステップ遺伝子組み換えマウスの作製は技術的に困難であることが知られている。しかし、ここで提示されたプロトコルは、記録的な時間に技術をマスターし、トラブルシューティングを行うことを可能にする、最適化され単純化された方法である。この技法をうまく完了するためには、2つのステップが必要である。第一に、線状DNA鋳型（sgRNAの合成用）の合成は、塩化マグネシウム（MgCl 2 ）なしで達成することができる。しかし、フォワードプライマーの部分的ハイブリダイゼーションは、MgCl 2が存在しない場合にしばしば防止されるので、マスターミックスにMgCl 2を系統的に添加することが強く推奨される。さらに、ターゲティングされたゲノム配列がドナー鋳型のどの部分にも存在しないことが重要である（標的化された組み込みの場合）。そうしないと、Cas9ヌクレアーゼが切断してHDRの発生を防止する。 変更トラブルシューティング遺伝...

脊椎動物および無脊椎動物の両方における動物モデルは、アルツハイマー病1,2などのヒト状態の病態生理学を調べるのに役立っている。彼らはまた、疾患修飾物質を探索し、最終的に治癒のために新しい治療戦略を開発するための貴重なツールです。各モデルには固有の制限がありますが、全身モデルとしての動物の使用は生物医学研究にとって不可欠です。これは、代謝および複雑な生理学的環境を組織培養において完全にシミュレートすることができないためである。 今日まで、マウスは遺伝的操作のために使用される最も一般的な哺乳動物種のままであるが、それはいくつかの利点を有するからである。疾患に関連する生理学的プロセスおよび遺伝子は、マウスとヒトとの間で高度に保存されている。マウスはヒトゲノムの1年前に完全ゲノム配列決定された最初の哺乳動物であった（2002）私（2003）。この豊富な遺伝情報とは別に、マウスは良好な育種能力、迅速な開発サイクル（受精から離乳までの6週間）、および合理的なサイズを有する。これらすべての利点は、異なるコート色（交差戦略に必要）などの生理学的指標と組み合わせて、マウスを遺伝子操作の魅力的なモデルにしました。特に、現代の遺伝学の非常に早い年齢で、グレゴールメンデルは植物に移動する前にマウスで作業を始めました3 。 遺伝子移入技術は、ウイルスの送達を用いて最初に作製された30年前の4年にわたる最初のトランスジェニックマウスの作製をもたらした4 。しかし、研究者はすぐに、マウスの遺伝子導入の主な課題の1つは、外因性DNAの運命を制御することができないことに気付いた。マウス卵母細胞へのトランスジーンのウイルス送達により、ゲノムに無作為に組み込まれた複数のコピーが得られたため、その後のトランスジェニック系統の樹立は限られていた。 このような制限の1つは、Gordon et al。マイクロインジェクション5,6で最初のトランスジェニックマウス系統を作製した。これは組換えDNA技術の時代を迎え、マイクロインジェクションセッションの成果に影響を及ぼすパラメータは広く研究されています7 。マイクロインジェクションは、導入遺伝子の組み込み部位（最終的に各創始マウスの特異的発現レベルをもたらす）の制御を可能にしないが、前核ミクロインジェクションの主な利点は、コンカテマー（ すなわち、トランスジーンの複数のコピーのアレイ、ゲノムインテグレーションの前に直列にリンクされている。この特徴は、関心のある遺伝子を過剰発現する何千ものトランスジェニックマウス系を確立するために長年にわたって用いられてきた。それ以来、遺伝子組み換えは、生物のゲノムの人工改変は、疾患の発生における単一の遺伝子の役割を同定するために広く用いられてきた。 Mario Capecchiが成功裏にマウスの単一の遺伝子を破壊し、遺伝子ターゲティングの時代を切り開いたときに、マウスゲノムを操作する上でのさらなる成果が達成されました8 。しかし、ES細胞の培養、キメラの程度の変化、およびプロセスの長さ（ すなわち、マウスを得るために最小12〜18ヶ月）を含む、ES細胞に基づく遺伝子標的化から急速に大きな欠点が浮かび上がった。 最近、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、および規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復配列（CRISPR / Cas9）のような工学エンドヌクレアーゼのような新技術の進歩が、マイクで遺伝子ターゲティングのプロセスを加速するe 9,10 。これらのエンドヌクレアーゼは、マイクロインジェクションによってマウス卵母細胞に容易に注射することができ、わずか6週間で遺伝子標的マウスを作製することができる。 ゲノム編集11のためのCRISPRの使用に関する最初の報告以来、この細菌適応免疫系は、合成の容易さおよび複数の座を一度に標的とする能力を含む多くの利点のために、ZFNおよびTALENに取って代わられた（「多重化&quot;）。 CRISPRは、マウス12の遺伝子標的化に初めて使用され、以来、植物からヒトへの無数の種に適用されている13,14 。現在までに、CRISPRゲノム編集に耐性のある単一種の報告はない。 トランスジェニックマウスの作製の2つの主要な制限段階は、卵母細胞の注入および再移植これらの卵母細胞を疑似妊娠した雌に分けた。この技術は我々 15およびその他16によって記載されているが、マウス発生学および遺伝子導入技術における最近の技術的改良は、遺伝子組み換えマウスの作製プロセスに革命をもたらした。これらの改良についてはここで説明する。

<table><tbody><tr><td>マイクロピペット 0.1-2.5 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 2 - 20 &mu;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 20 - 200 &mu;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 100 - 1,000 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>分子量マーカー&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>分子量マーカー&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - 1x</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>に希釈 Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR精製キット(Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr>真空<tr><td>システム(マニホールド)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr>ヌ<tr><td>クレアーゼフリーマイクロインジェクションバッファー&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC 微量遠心フィルター&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 mRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR 発現プラスミド (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Quick High Yield RNA kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>RNA精製スピンカラム(NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Donor plasmid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa 胚培養培地</td><td>Zenith Biotech&nbsp;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>ゼニス・バイオテック&nbsp;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 ミディアム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシン B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>マウスピース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製マイクロキャピラリー</td><td>サッター器具</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>アイリスハサミ</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>ベッセルクランプ</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>巻き取りクリップ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>クリップアプライヤー&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>12018-12</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>ハサミ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>焼灼器</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>非吸収性外科用縫合糸 (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 インキュベーター</td><td>MG サイエンティフィック</td><td>ギャラクシー 14S</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ナノドロップ 2000c</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動</td><td>BioRad のセットアップ</td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>立体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x マイクロマニピュレーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>卵子マニピュレーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター (フェムトジェット)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>マウス C57BL/6J</td><td>株 オーストラリア バイオリソース</td><td>C57BL/6JAusb&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

遺伝子改変マウスの使用は、生理学的および病理学的インビボプロセスの両方に関する研究に有意に寄与している 。受精卵母細胞へのDNA発現構築物の前核注入は、過剰発現のためのトランスジェニックマウスを生成するために最も一般的に使用される技術のままである。遺伝子標的化のためのCRISPR技術の導入により、受精した卵母細胞への前核注入は、ノックアウトマウスとノックインマウスの両方に拡大されている。この研究は、注射用DNAの調製と、遺伝子ターゲッティングのためのCRISPRガイドの作成について記述しており、特に品質管理を重視しています。潜在的な創始者の同定に必要な遺伝子型決定手順は重要である。本明細書では、CRISPRの「多重化」能力を利用する革新的な遺伝子型決定戦略を提示する。手術手順も概説されている。一緒に、プロトコルのステップは、世代の生成を可能にする免疫学、神経科学、癌、生理学、発達およびその他を含む多数の研究分野のためのマウスコロニーのその後の確立のために使用される。

以下に、ランダム組込みおよびCRISPR媒介遺伝子標的化の場合のマイクロインジェクションのワークフローを示す（ 図1 ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> 図1：遺伝的に改変されたマウスの典型的なワークフローランダム組み込みのために、精製されたトランスジーンは、卵管がプラグインされた雌の雌に移入される前に、受精卵母細胞の前核に注入される。後代の分析は、迅速なゲノムDNA抽出の後にPCRによって行う。 CRISPR遺伝子標的化のために、ここに記載された非クローニング法を用いてsgRNAを合成し、2つのガイドを受精卵母細胞の細胞質に同時注入する（Cas9 mRNAと共に）。この戦略は、その後のPCRに基づいて子孫を分析するために...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

本プロトコルの総合的な目的は、卵母細胞へのマイクロインジェクションによる遺伝子組換えマウスの作製に必要となる手順を解説することです。本プロトコルは、マウスの作製およびジーンターゲティングに従事する研究者や技術スタッフに役立ちます。この手法の主な利点は、ランダムインテグレーションとジーンターゲティングの両方においてマウス卵母細胞への直接注入を行うため、最短6週間で遺伝子組換えマウスを作製できることです。シングルガイドRNAを調製するために、目的の2つの標的配列を選択し、テキストプロトコルに従ってプライマーを作成した後、PX330プラスミドをヌクレアーゼフリー水で10 nanograms per microliterに希釈して線状DNAテンプレートを合成します。マスターミックスを調製し、最後にポリメラーゼを加えて氷上で保持します。その後、溶液を混合し、8本のPCRチューブに分注します。各チューブにPXR330を1 µL加え、以下のプログラムを実行します。次に、PCR精製キット、マニホールド、および真空源を用いてPCR産物を精製します。PCRサンプル1量に対して5量分の結合バッファーを加え、混合します。シリコンメンブランスピンカラムをマニホールドに設置します。DNAを結合させるため、真空状態で8つのサンプルすべてをカラムに適用します。サンプルを洗浄するには、0.75 millilitersの洗浄バッファーをカラムに加え、吸引します。次に、カラムを12,000 ×gで60秒間遠心分離し、残留エタノールを除去します。カラムを清潔な1.5 mLマイクロ遠心チューブに設置し、DNAを溶出させるために、メンブレンの中央に30 µLのヌクレアーゼフリー水を加えます。カラムを1分間静置した後、12,000 ×gで60秒間遠心分離します。次に、分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。t7 RNA synthesis kitを用いてin vitro転写を行うため、マスターミックスを調製し、サーモサイクラーで37 °Cで3時間インキュベートします。28 µLのヌクレアーゼフリー水と2 µLのDNAse Iを加え、さらに15分間インキュベートします。RNAを精製するために、提供されたスピンカラムに含まれる粉末に650 µLのヌクレアーゼフリー・マイクロインジェクションバッファーを溶解させます。気泡を完全に取り除いた後、チューブにキャップをし、室温で5～15分間静置して溶液を水和させます。底部の青いキャップを取り外し、カラムを2 mLチューブにセットします。次に、チューブを室温で750 ×gで2分間遠心分離します。その後、カラムを新しい1.5 mLチューブに移し、RNA溶液50 µLをカラム壁に触れないように中心に滴下します。最後に、カラムを750 ×gで2分間遠心分離します。テキストプロトコルに従ってRNA濃度を測定し、RNAの品質を評価します。ヌクレアーゼフリーのマイクロインジェクションバッファーを用いて、遺伝子ノックアウト実験用にCas9 mRNAを50 ng/µLに、sgRNAを12.5 ng/µLに希釈します。相同組換え修復に基づくゲノム編集を行う場合は、ドナーテンプレートを200 ng/µLの濃度で添加し、氷上で保持します。アスピレーターのマウスピースを使用し、4滴の新鮮なカゼインアミノ酸で卵母細胞を洗浄します。その後、ミネラルオイルを上層にした最終的なCasome Eight培地の液滴に転移させます。ランダム統合のための前核注入を行うには、実体顕微鏡下でアスピレーターのマウスピースを用い、約50個の卵子を、注入チャンバーとして使用するミネラルオイルを上層にしたM2培地の液滴に移動させます。注入チャンバーを倒立顕微鏡に移動させ、受精卵に注入ミックスを数picoliters注入します。注入が成功すると、前核が膨張します。遺伝子ターゲティングのために細胞質注入を行う場合は、マウスピースを用いて約50個の卵を5 µg/mLのcytochalasin Bを含むcasome Aの液滴に移動させ、37 °C、5% CO2条件下で5分間インキュベートします。卵を注入チャンバーに移し、ごく低い圧力で、注入ミックスを数ピコリットル細胞質に注入します。可能な限り、自動マイクロインジェクターの補正圧を使用してください。注入後、マウスピースを用いて卵母細胞をカソアミノ酸の液滴に戻します。擬妊娠させた雌マウスの卵管に再移植するまで、37 °C、5% 二酸化炭素条件下で保持します。プロトコルに従ってプラグを確認した雌マウスを麻酔し、無菌条件下で再移植を行うため、背側正中線に平行に1 cmの切開をメスで入れ、生殖管を露出させます。その後、ハサミで筋肉を切断し、ピンセットで脂肪組織を把持します。卵巣をゆっくりと引き出し、付着している卵管と子宮がはっきりと見えるようにします。次に、血管鉗子を用いて脂肪体（fat pad）を固定します。実体顕微鏡下で、マイクロシザーを用いて、卵管膨大部の数ミリ上流の卵管壁を切開します。また、実体顕微鏡下で、マウスピースに接続されたガラスキャピラリーに、微量注入済みの卵子25個をロードします。次に、ガラスキャピラリーを卵管に挿入し、卵管膨大部の中に気泡が見えるまで卵子を排出します。再移植が成功したことを確認するためには、卵管膨大部に気泡が存在することを確認する必要があります。これにより、すべての卵子が適切な位置に排出され、ガラスキャピラリー内に残っていないことが保証されます。ガラスキャピラリーを慎重に取り出し、生殖管を腹腔内に戻します。次に、3-0の非吸収性手術用縫合糸を用いて切開部を縫合し、創傷クリップで皮膚を閉じます。低体温症を防ぐため、マウスを保温マットの上に置き、鎮痛剤を皮下に注射します。マウスが完全に回復するまで観察します。最後に、テキストプロトコルに従ってゲノムタイピングおよびシーケンシングを行います。この図は、遺伝子改変マウスを正常に作成するために不可欠な、トランスジェンの精製およびsgRNA合成の品質を示す分析ゲルを示しています。ここに、ランダムインテグレーションのためのマイクロインジェクションセッションにおける典型的な解析結果を示します。ジェノタイピング用プライマーは導入遺伝子上に位置し、200から800 bpの断片を生成するように設計する必要があります。このジーンターゲティングの解析結果では、最終的に2つのガイドRNAによって切除される領域の外側のゲノムDNAにハイブリダイズするようにプライマーが選択されています。この戦略により、ヘテロ接合体およびホモ接合体のノックアウトファウンダーを直接的に特定することが可能になります。ここで説明するように、プロトコルの各ステップを最適化すると、ランダムインテグレーションにおけるトランスジェニック仔マウスの割合は10%から25%に達しますが、これはCRISPRコンポーネントによるマウスゲノム編集能と比較するとやや低い値です。遺伝子ターゲティングにCRISPRを使用した場合、ファウンダーの数は一般的に多くなり、25%から100%の範囲となります。CRISPRを用いて編集を行った場合、得られた全子孫が正常にホモ接合体となることは珍しくありません。本技術の開発により、神経科学や癌などの分野の研究者が、新たなマスクモデルを用いて病理学的メカニズムを解明し、最終的にそれを治療戦略へと展開することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

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