レンチウイルスベクターベースのペリビテリン注射:目的の遺伝子を受精した単一細胞マウス卵子に形質導入する方法

トランスフェクションを実行するには、受精したばかりのマウス卵子を適切な培地の一滴に懸濁した特殊なチャンバーを取ります。この段階では、卵子には父方と母方の両方の前核を含む大きな中央卵母細胞が含まれています。

卵母細胞は糖タンパク質が豊富な透明帯で覆われており、ヒアルロン酸が豊富な細胞外マトリックス内に埋め込まれた卵丘細胞の密接に配置されたクラスターに囲まれています。次に、ヒアルロン酸を消化する酵素ヒアルロニダーゼで卵を処理します。これにより卵丘細胞が解離し、最終的に卵母細胞を取り巻く透明帯が露出します。

処理した単一の卵母細胞を保持ピペットの先端近くに置き、吸引圧力を加えてその位置を抑制します。ウイルスエンベロープ内にカプセル化された導入遺伝子を運ぶ操作されたレンチウイルスベクター懸濁液を含む狭口径マイクロインジェクション針を取ります。これらのレトロウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれる固有の能力を持っています。

次に、透明帯に針を突き刺して卵黄周囲空間(最も外側の透明帯と最も内側の原形質膜の間の空間)に到達します。レンチウイルスベクター懸濁液を卵黄周囲空間に導入し、インキュベートして形質導入(ウイルスを介した遺伝的導入のプロセス)を促進します。

ウイルスベクターは卵母細胞膜と融合し、トランスジェニックRNAを卵母細胞の細胞質に放出し、卵母細胞が二本鎖DNAに逆転写します。最終的に、DNAは宿主ゲノムの特定の遺伝子座に統合され、導入遺伝子の発現が起こります。

調製では、調製したレンチウイルスベクター懸濁液を160 gで2分間遠心分離し、凍結レンチウイルスストックにしばしば存在する破片をペレット化します。クラスII安全キャビネットで、上清を新しい0.5ミリリットルチューブに移します。次に、1マイクロリットルの上清を注入ピペットに投入し、注入ピペットを右側のマイクロマニピュレーターに取り付け、保持ピペットを左側のマイクロマニピュレーターに取り付けます。

次に、くぼみスライドの中央に8マイクロリットルのM2培地を分配し、蒸発を避けるために軽いパラフィンオイルで覆います。次に、泡を作らずにドロップの浅い場所に卵を20個入れます。次に、インジェクションピペットの先端が開いていることを確認します。ない場合は、保持ピペットで注入ピペットを軽くたたいて開き、インジェクターを20秒間の注入に設定します。

次に、保持ピペットと手動圧力を使用して、2つの前核と2つの極体を含む受精卵を吸引します。次に、注射ピペットを使用して、卵子の卵黄周囲空間を注入します。

原形質膜には触れないでください。卵胞周囲の空間が溶液で満たされるように圧力を調整します。圧力は600ヘクトパスカルを超えてはなりません。20個の卵を注入した直後に、バッチを予熱したM16培地の浴に移し、移植する前に少なくとも30分間インキュベートします。