Name: 味覚コーディングを研究する新しい方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶManduca sextaを用いた味覚コーディング研究法。生体内で複数の味覚受容ニューロンを記録し、精密な味刺激の送達とモニタリングを行う技術を解説。神経科学と行動生物学の研究者に有用です。

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著者は何も開示することはない。

本明細書に記載の方法は、比較的単純な動物Manduca sextaからのインビボでの記録が、長期間にわたって（2時間以上）、味覚送達の前、最中および後に複数の無作為に選択されたGRNの活性を特徴付けることを可能にする。これらの方法はまた、正確な時間制御を有する複数の味覚刺激の迅速で連続的な送達を可能にし、味覚表現の基礎となる神経機構を研究するのに有用である。このプロトコルは、シナプス後の標的ニューロン（ 例えば、 SEZ）に伝達されたときにGRNを単シナプスで接続された介在ニューロンと同時にモニタリングすることによって、GRNの味物質への応答がどのように変化するかを研究するために用いられているさらに、これらの方法は、実験者のニーズに適合させることができ、複雑なパラダイムの実行が味覚コーディングの基本的な側面を研究することを可能にする。 beginnin私たちの研究では、トラブルシューティングが必要な技術的な問題の1つは、四極線で上顎神経からのスパイク信号を検出できないことでした。この解剖プロトコールは困難であり、良好な準備を得るためにはいくつかのプラクティスが必要であるため、これに対する考えられる原因は多様である。第1に、蛾の解剖の間、上顎神経は、特に神経組織を取り囲むシースの除去中に損傷することが容易である。第2に、シースが完全に除去されない場合、四極線は神経にアクセスできない可能性がある。どちらの場合も、新しい準備を開始することは、これらの問題を解決する最も簡単な方法です。第三に、四極ワイヤに問題があるかもしれない。これは、1kHzで〜270kΩになるはずのワイヤのインピーダンスを測定することによって確認できます。インピーダンス値が〜300kΩを超える場合は、ワイヤを金で電気めっきして、所望のインピーダンスにします（参考文献30を参照）。第4に、機器が誤って接続されている可能性がありますまたは誤動作。 別の考えられる問題は、スパイク信号が記録されるがニューロンは味物質に応答しないように見えることである。これは、記録されたニューロンが、送達された味覚物質のセットに対して感受性がないためであり得る。また、GRNの軸索に加えて、上顎神経もまた、機械感覚線維を運ぶことを覚えておくことが重要である。したがって、GRNの代わりに、またはGRNに加えて、機械感覚ニューロンから記録することが可能である。しかしながら、味のある送達システムは実験を通じて一定の機械的入力を提供するように設計されているため、味物質に対する応答は送達の機械的構成要素に対する応答によって混乱することはない。いくつかの他の味覚物質に反応するニューロン、または異なる味物質に異なる方法で応答するニューロンは、GRNとして明白に分類することができる。化合物の分解または蒸発による味物質濃度または組成の変動を避けるために、新たに希釈した味物質を使用することを推奨しますの溶媒を含む。また、チューブの汚れや詰まりを避けるため、システムを定期的に清掃することをお勧めします。 別の可能な技術的問題は、不利な信号対雑音比である。この問題は、しばしば、浴の接地電極の位置を再塩素化または調整することによって解決することができる。他の解決策では、装置内の各電気的接続の長さを遮蔽し最小限に抑える必要があるかもしれない。 最後に、テトロード記録を使用して得られたデータの正確な分析には注意深いスパイクソートが必要であることに注意することが重要です。我々は、完全自動化された方法は一般的に不十分であることを発見した。四極データ10,29,31,32,33を分析する前に、スパイクソートの文献に精通することをお勧めします。 私たちの解剖プロの代替トコールを使用することができます。ここでは、蛾の頭の腹側部分を切開し、上顎神経およびSEZへのアクセスを提供するが、背側を通ってこれらの構造にアクセスすることも可能である。私たちは背側の準備が深い場所のためにこれらの味覚構造から録音するのに最適ではないことを発見しましたが、この準備はマッシュルーム本体のような高次構造からの録音を可能にする利点を提供します感覚統合、連合学習、記憶処理34 。我々は、上顎神経から記録するために四極電極の使用に焦点を当ててきたが、図示のように、標準的な細胞内の鋭い電極もこの目的のために使用することができる。さらに、両方の技術を組み合わせて、複数の脳領域10からの同時記録を行うことができる。神経科学文献には、昆虫と脊椎動物の両方35,36,37,38,39 に適用される、嗅覚コーディングのような感覚処理の基本原理を明らかにするための強力なツールであることが証明された無脊椎動物モデル。私たちのメソッドが味覚コーディングについての基本的な新しい洞察につながることを願っています。

味覚システムと嗅覚システムは、環境中の化学物質の内部表現を生成し、それぞれ味覚と臭気の認識を生じさせる。これらの化学感覚は、仲間や食事の発見から捕食者や毒素の回避に至るまで、生物の生存に不可欠な多くの行動を引き出すために不可欠です。プロセスは、環境化学物質が感覚受容細胞の原形質膜に位置する受容体と相互作用するときに始まる。これらの細胞は、直接またはニューロンとの相互作用を介して、化学物質の同一性および濃度に関する情報を電気信号に変換する。これらの信号は、高次のニューロンや他の脳構造に伝達されます。これらのステップが進むにつれて、元の信号は、感覚情報を検出し、識別し、分類し、比較し記憶し、適切な行動を選択する生物の能力を促進する変化を常に受け​​る。ブラジャーの仕組みを理解する環境化学物質に関する情報を変換することで、さまざまな作業を最善に実行することが、神経科学の基本的な問題です。 味覚コーディングは、比較的単純であると考えられている。味を引き出すすべての化学分子（「味覚」）は、約5またはそれ以下の基本味質（ すなわち、甘味、苦味、酸味）塩味、うま味） 1 。この「基本的な味」の観点では、味覚システムの仕事は、これらの基本的な嗜好のどれが存在するかを判断することです。さらに、神経系における基本的な味覚表現の根底にある神経機構は不明であり、「標識された線」2,3,4,5,6または「繊維横断パターン」 7によって支配されると考えられている</sup&gt; 、 8コード。標識されたラインコードでは、各感覚細胞およびその神経フォロアーの各々は、単一の味質に反応し、一緒にその味に特化した中枢神経系のより高い処理中心への直接かつ独立した経路を形成する。対照的に、横繊維パターンコードでは、各感覚細胞は複数の味覚特性に応答して、味覚物質に関する情報が感覚ニューロンの集団全体の応答によって表される。味覚情報が基本的な嗜好であるかどうかにかかわらず、ラベルされた線を介して、または他の何らかのメカニズムによって、不明瞭であり、最近の調査の焦点である3,8,9,10,11,12。私たちの最近の研究は、味覚システムが時空間集団コードを使って基本的な味のカテゴリーではなく個々の味の表現10 。 ここでは、味覚コーディングの研究を支援する3つの新しいツールを提供します。まず、味覚の電気生理学的研究に適した比較的単純なモデル生物としてのハクモス・マンジュカ・セクスタの使用を示唆し、解剖処置を記述する。次に、個々のGRNの活動を記録するために細胞外の「四極管」を使用することを提案します。第3に、我々は動物に正確に時間を合わせた鼓動を届けるための新しい装置を提案する。これらのツールは、私たちの研究室や他の研究者が嗅覚システムを研究するために使用した技術から適応されました。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）、イナゴミツバチ （ Mist Manduca sexta）などの昆虫は、何十年もの間、ナルについての基本原則を理解するための強力な資源を提供してきた感覚コーディング（ 例えば、嗅覚13 ）を含む大脳系。哺乳動物において、味覚受容体は、複雑なセカンドメッセンジャー経路を介してニューロンと通信する特殊細胞である。昆虫ではより簡単です。味覚受容体はニューロンです。さらに、周辺の哺乳類の味覚経路は、比較的複雑であり、複数の平行な神経経路を特徴とし、重要な構成要素は、小さな骨構造15に含まれるアクセスするのが難しい。昆虫の味の経路はより単純に見える。昆虫では、GRNは、アンテナ、口、翼および脚16,17に位置する、感覚器として知られる特殊な構造に含まれている。 GRNは、副食道ゾーン（SEZ）に直接投影され、その役割は主に味覚17と考えられており、2次味覚ニューロン10 。そこから情報が身体に届いて反射神経を駆動し、より高い脳領域に統合され、記憶され、最終的に行動選択肢を駆動する16 。 味覚情報がどのように伝播され、神経系全体にわたってポイントからポイントに変換されるのかを理解するために、末梢味覚応答を特徴付けることが必要である。昆虫におけるGRNの神経活動を直接的にモニターする最も一般的に使用される方法は、先端記録技術である12,18,19,20,21,22,23である。これは、感知器の上に電極を直接配置することを含み、その多くはアクセスが比較的容易である。味物質は電極内に含まれており、活性化および延長が可能であるsensillumにおけるGRNsのニューロン応答を測定する。しかし、味物質が電極に含まれているので、味物質が送達される前または除去された後にGRN活性を測定すること、または電極20を交換することなく味物質を交換することは不可能である。別の方法である「サイドウォール」記録技術も、GRNの活動を記録するために使用されている。ここでは、味覚センサ24の基部に記録電極を挿入し、味覚センサの先端にある別のガラスキャピラリを介して味物質を供給している。両方の技術は、GRNから特定の感覚器への記録を制限する。ここでは、新しいテクニックを提案します：異なる感覚器からの無作為に選択されたGRN軸索からの記録、別々に嗅覚器に一連の味覚物質を送達すること。軸索記録は、軸索を運ぶ神経に鋭利なガラス電極または細胞外電極束（四極管）を配置することによって達成されるSEZ 10への鼻腔内のGRN。 Manducaでは、これらの軸索は純粋に求心性であることが知られている上顎神経を横断し、感覚反応の明瞭な記録を可能にする25 。軸索から記録するこの方法は、一連の味わいのあるプレゼンテーションの前、中および後に、2時間以上にわたって、GRN応答の安定した測定を可能にする。 ここでは、SEZと一緒に上顎神経を曝露するための解剖手順を説明します。これにより、SEZ 10内の複数のGRNおよびニューロンの応答を同時に記録することができます。また、スパイクソート法と組み合わせると複数のGRNを同時に解析することができるカスタムメイドの4チャネルツイストワイヤーテトロードを使用したGRNの細胞外記録の使用についても説明します。我々はさらに、テトロドで作製した記録を、鋭い細胞内で作製した記録と比較する電極。最後に、味覚刺激を提供する新しい装置について説明する。多くの研究者が嗅覚研究で匂い物質を送達するために長い間使用されてきた装置から適応されたこの新しい装置は、咀嚼研究の利点を提供します：Stürckowらが開発した従来のマルチチャンネル送達システム（参考文献26,27参照）このタイミングの電圧読み出しを提供しながら、味のある供給のタイミングを制御する。それは複数の味覚刺激10の迅速で連続的な送達を可能にする。装置は、一定の流量の清浄な水の中に鼻腔を浸し、制御された耳の鼓動を送達することができる。それぞれの鼓動は頸部を通過して洗い流されます。味は味のない食べ物の着色を少量含んでおり、正確なタイミングで味わいのあるov鼻腔があります。

<table><tbody><tr><td>解剖および検体調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ、15 mL Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>針、ショートベベル、19 G x 1 - 1/2"&nbsp;</td><td>&nbsp;モノジェット</td><td>888200144</td><td>蛾の毛を取り除くために空気を当てます。</td></tr><tr><td>モデリングクレイ・ヴァン・アーケン・プラスタリナ&nbsp;</td><td>DickBlick</td><td>33268</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ-100 x 15 mm&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>89000-304</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットチップ(1 - 200 & micro;L)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Techni Edge</td><td>TE05-071</td><td></td></tr><tr><td>22 AWG 標準フックアップ ワイヤー</td><td>AlphaWire</td><td>1551</td><td>ピペットチップにテングを挿入します。</td></tr><tr><td>バティックワックス</td><td>ジャカード</td><td>7946000</td><td></td></tr><tr><td>電動ワックス剤</td><td>アルモアインターナショナル</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>ステレオミスクロスコープ</td><td>ライカ</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#1鉗子(粗い)&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>500335</td><td>脂肪や非神経組織の除去に。</td></tr><tr><td>デュモン #5 チタン鉗子(細)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14096</td><td>脂肪や非神経組織の除去に。</td></tr><tr><td>デュモン #5SF 鉗子(超極細)</td><td>ワールド精密機器</td><td>500085</td><td>神経組織の脱皮に。</td></tr><tr><td>バンナスはさみ(細)</td><td>ワールド精密機器</td><td>500086</td><td>キューティクルの除去に。</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ディスパーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>生理食塩水灌流システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レートフローレギュレーター付きエクステンションセット</td><td>&nbsp;Bブラウンメディカル株式会社</td><td>V5200</td><td></td></tr><tr><td>IV投与セットとY注入部位</td><td>&nbsp;Bブラウンメディカル株式会社</td><td>V1402</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Tastant Delivery System</></td><td></td><td></td><td></td>White</tr>半<tr><td>透明ナイロンチューブOD 1/4", ID 1/8"</td> <td>Small Parts Inc.</td><td>B001JJT4SA</td><td>システムの4つの主要要素を接続する硬質チューブ。</td></tr><tr><td>はんだごて</td><td>回路スペシャリスト</td><td>ZD200BK</td><td></td></tr><tr><td>回転工具-ドレメル</td><td>・ドレメル</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンメッシュ、穴サイズ(穴サイズ0.1 x 0.13 cm)&nbsp;</td><td>工業用ネット</td><td>XN5170</td><td>異なる動物のプロボシスが同じ場所に配置されていることを確認するため。</td></tr><tr><td>加圧16チャンネル灌流システム&nbsp;</td><td>バイオサイエンスツール</td><td>PS-16H</td><td>試飲配送用。このシステムには、ピンチバルブ、チューブ、マニホールド、ソリューションシリンダー、バルブコントローラー、フィッティングアクセサリーが含まれます。</td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ、ID 0.034 "、ID 0.050 "</td><td>ベクトン、ディキンソン&Co</td><td>427421</td><td>灌流システムからの出力チューブ。</td></tr><tr><td>ニューマチックPicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>灌流システムの出力チャンネル制御用&nbsp;</td></tr><tr><td>データ集録ソフトウェアシステム、LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQカード</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>試飲用のピコポンプを制御し、カラーセンサーからの信号を記録します。</td></tr><tr><td>Compulab 3 マノスタット蠕動ポンプ</td><td>シグマ</td><td>P1366</td><td>水を汲み上げるため。</td></tr><tr><td>シリコーンチューブ、ID 1/16 "OD 1/8"</td> <td>Cole-Parmer</td><td>WU-95802-02</td><td>水源を蠕動ポンプチューブに接続し、ポンプの出口チューブをデリバリーシステムの硬質チューブに接続します。</td></tr><tr><td>カラーセンサー-デジタル光ファイバーセンサー</td><td>キーエンス</td><td>&nbsp;FS-V31M</td><td>テイスタント配送監視用&nbsp;</td></tr><tr><td>カラーセンサー反射ファイバーユニット</td><td>キーエンス</td><td>FU35-FZ</td><td>カラーセンサーデバイスを接続します。</td></tr><tr><td>歯科用末梢ワックス</td><td>ヘンリー・シャイン歯科</td><td>用6652151</td><td>テングを硬質チューブに固定します。</td></tr><tr><td>2つの3.7リットル容器</td><td></td><td></td><td>システムに水を供給し、水廃棄物を再回収します。</td></tr><tr><td>ファストグリーンFCF&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>ドレッシング鉗子25.5cmWPI</td><td></td><td>500364</td><td>硬質チューブの吻穴に蛾の吻を導入するため。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>電気生理学機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCアンプ</td><td>Brown-Lee</td><td>440</td><td></td></tr>ランプショットショット<tr><td></td><td></td><td>フォステック光源DCR 2</td><td></td></tr><tr><td>手動マイクロマニピュレーター</td><td>ライカ</td><td>マイクロマニピュレーター</td><td>四極管を動物の脳に正確に挿入します。マニピュレータは、x、y、z軸の細かい動きと粗い動きを許可する必要があります。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>除振台 (MICRO-g ラボテーブル)</td><td>TMC</td><td>63-541</td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>テクトロニクス&nbsp;</td><td></td><td></td>TDS2014</tr><tr><td>16チャンネルプリアンプ&アンプ</td><td>16chMA-800アンプシステム&nbsp;</td><td>B.E.S 2013</td><td></td></tr><tr><td>コンピューター</td><td>Dell</td><td>optiplex 780</td><td>以下は、推奨される最小要件です。メモリ:3.32 GHz、3GB。プロセッサー: Intel Core&nbsp;2デュオ。グラフィックカード:統合Intel GMA X4500。&nbsp;</td></tr><tr><td>データ集録ソフトウェアシステム、LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQカード</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW 2011</td><td>試飲用のピコポンプを制御し、カラーセンサーと電極からの信号を記録します。</td></tr><tr><td>名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Tastants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5708</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73575</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr></tbody></table>

味覚コーディングを研究する新しい方法

New Methods to Study Gustatory Coding 

味覚は動物が環境中の化学物質を検出することを可能にし、生存に不可欠な行動を引き起こします。味覚受容器ニューロン（GRN）が味覚分子を検出すると、脳内のフォロワーニューロンに伝播する電気活動のパターンとして、味覚物質の同一性および濃度に関する情報をコード化する。これらのパターンは味物質の内部表現を構成し、動物が行動を選択して記憶を形成することを可能にする。比較的単純な動物モデルの使用は、感覚コーディングにおける基本原則を研究するための強力なツールであった。ここでは、moth Manduca sextaを用いて練習コーディングを研究する3つの新しい方法を提案する。まず、軸索からのGRNの活性を記録することを可能にする、上顎神経および食道下領域（SEZ）を暴露するための解剖処置を提示する。第2に、細胞外電極を使用して、複数のGRNの活性を記録することを記載する上顎神経に直接ワイヤを通す。第3に、我々は、高い時間精度で異なる味物質のパルスを送達および監視するための新しいシステムを提示する。これらの方法は、味物質が送達される前、中および後で、GRNからのインビボでのニューロン応答の特性決定を直接的に可能にする。複数のGRNから記録された電圧トレースの例を示し、個々のニューロンの応答を特定するためにスパイクソート手法をデータにどのように適用できるかの例を示します。最後に、本発明者らの記録方法を検証するために、GRNから得られた細胞外記録をテトロドと比較し、シャープなガラス電極で得られた細胞内記録と比較する。

GRNの活性は、味覚送達の前、間および後に細胞外四極電極を用いて記録することができる（ 図6Aおよび6C ）。 図6A （中および下のパネル）は、上顎神経に配置された4本のワイヤーのそれぞれによって記録されたフィルターされた（300-6,000Hz）電圧トレースを示し、活動電位（矢印）を反映する異なる振幅の信号が観測される。試験開始後2秒後に味物質（1 Mショ糖）の1秒パルスを送達した。刺激の開始およびオフセットを、カラーセンサ（ 図6A 、上部パネル）によってモニターした。 4つのチャネルのそれぞれにおいて観察され得る味覚誘発スパイク（ 図6A 、中央パネル）。 GRNは、いくつかの味物質に応答する場合、メカノセンサー（ここに示されていない）と識別され、区別され得る tetrode記録から単一のニューロン応答を同定し単離するために、我々は、Pouzat 31およびKleinfeldの32,33方法（これらの方法はこれらの引用文献に記載されている：10,29）に基づく一連のカスタム関数を用いてオフラインスパイクソーティングを行った。 図6Bは、 図6Aに示すデータに適用されたスパイクソーティングの例を示し、3つの孤立したユニットが見出された。 図6Cのラスタプロットは、 図6Bの 3つの単離されたユニットの応答を、6つの異なる味物質（1Mショ糖、マルトースおよびNaCl; 100mMカフェインおよび10mMベルベリンおよびロブライン）s / tastantが示されている）。 図6Cに示すように、記録されたGRNは、サイレント（GRN 1）から低または中程度（GRN 2および3）の範囲で異なるベースライン活動レベルを有する。劇的な発症後、GRNは多様な活性パターンを示し、味物質に対して異なる選択性を示す。例えば、GRN1はスクロースにのみ応答し、一方、GRN2はマルトースおよびNaClにスパイクのバーストを伴って応答し、刺激の開始時にのみスパイクを伴うロブラインに応答した。さらに、いくつかの応答は、刺激の持続時間（ 例えば 、ショ糖に対するGRN1応答）に固定され、他の応答は刺激の持続時間より長く（ 例えば 、ベルベリンに対するGRN3応答）、または興奮性および阻害性成分GRN 2はNaClおよびスクロースに応答する）。 GRNの多様な感受性および活性パターンの詳細については、参考文献10を参照のこと。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt;上顎神経からGRNを記録するための四極およびスパイクソート技術の使用を検証するために、他の動物のGRN軸索からの細胞内記録を、従来の鋭利なガラス電極（80-120MΩの抵抗）を用いて行った。我々は、細胞内記録を使用することによって得られた活性パターンが、テトロデ技術を用いて観察された応答と類似していることを見出した（ 図7 ）。パネルAの緑色ボックス内の電圧トレースは、ショ糖提示の5回の連続した試験中にGRN1から細胞内に記録され、同じ反応はパネルBのラスタプロットとして示されている（このタイプの応答は四極および図6Cに示される）。鋭い細胞内電極で記録されたGRN2は、より広い応答パターンを示す。 <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2.jpg"/&gt; 図6： 細胞外Tetrodesを伴う上顎神経記録からの代表的な結果。 （ A ）上顎神経の4本のワイヤの各々によって記録されたフィルタリングされた（300-6,000Hz）電圧トレースが示されている（中央パネル）。中央のパネルに赤色の陰影が付いている期間中、味覚物質の1秒パルスを印加した。刺激の開始およびオフセットは、上部パネル上の赤色電圧トレースによって示されるように、カラーセンサによってモニタされ、赤色陰影領域によって中間パネルに示されている。点線の水平線は、+ 50（上）、0（中）および-50（下）μVを示す。縦の点線内の領域に対応する生の電圧トレースの拡大が示されている（下のパネル）。スパイクの例は矢印で示されています。 （ B ）パネルAに示されたデータに適用されたスパイクソーティングの一例.4つの細胞外ワイヤー（1-4）の各々に記録された波形eは、記録された信号に寄与する3つの異なるGRN（ユニット1〜3）で識別される。 3つのユニットの個々のイベント（細い線）と平均（太い黒い線）が示されています。スパイクソート法（参考文献10,29参照）を用いて、独立したユニットを確実に識別するためには、いくつかの統計的基準を考慮する必要があります。 （ C ）3つの孤立したユニットの反応を6つの異なる味物質（4つの試験/味覚物質が示されている）に示すラスタプロット。味覚送達の期間（1秒）は、赤色の陰影を付けた領域によって示される。味物質の濃度は、1M（スクロース、マルトース、NaCl）、100mM（カフェイン）および10mM（ベルベリンおよびロブライン）のいずれかであった。 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55868/55868fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図7" c<html> lass = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg&quot; /&gt; 図7 ：GRN軸索からの細胞内記録。 （ A 、緑色ボックスパネル）1Mのスクロース（Suc）で5回連続して刺激することにより誘発された、鋭いガラス細胞内電極（抵抗80〜120MΩ）を有するGRNから記録された電圧トレース。 （ B ）シャープなガラス細胞内電極を用いて記録した2つの異なる味物質（100mMの灰色のフォント色; 1Mの黒色）にパネルA（緑色のボックスパネル）で示された応答を含む2つのGRNの応答のラスタプロット上顎神経に配置された（7回の試行/味覚および3回の試行/水が示されている）。味わい深い納品時間は、両方のパネルの赤い陰影のある領域によって示される。刺激の開始およびオフセットは、各パネルの下部に赤色の電圧トレースによって示されるように、カラーセンサによって監視された。es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本発明者らは、味覚コーディングを研究する3つの新しい方法を提示する。単純な動物、 Manduca sexta（ Manduca ）を用いて、解剖プロトコール、複数の味覚受容体ニューロンの活動を記録するための細胞外テロドールの使用、および味物質の正確なタイミングパルスの送達および監視のためのシステムを記載する。

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

これらの手法の全体的な目的は、味物質の精密にタイミングを制御したパルスを投与・モニタリングしながら、in vivoで複数の受容ニューロンの活動を記録することにより、単純な動物であるmandi-casecstaにおける味覚コーディングを研究することです。これらの手法は、味物質が味覚受容ニューロンの集団によってどのようにコードされるかといった、味覚に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、精密に投与された味刺激の前後および最中に、複数の味覚ニューロンのin vivo記録が可能であることです。解剖の手順が複雑であるため、この方法に慣れていない方は困難に感じるかもしれません。そのため、本手法の視覚的なデモンストレーションがお役に立てばと考えております。これらの技術は、Sam Writer氏が私の研究室の大学院生だった際にAlejandra氏と共に開発したものであり、今回はKui Sun氏がこれらの手順を実演します。羽化から3日後、概ね健康な外見をした雌雄いずれかの蛾を選択します。翅が完全に伸展し、口吻および触角が正常に形成され、損傷がない個体を選んでください。ドラフトチャンバー内で、頭部だけが出るまで選択した蛾を拘束チューブに挿入します。次に、チューブの反対端にティッシュペーパーを挿入して、蛾を固定します。続いて、シリンジから加圧空気を送り、露出した頭部から毛を除去します。その後、チューブをペトリ皿内の粘土台の上に置きます。頭部の背面を上に向けます。次に、触角と口吻を保護します。まず、200 µL ピペットチップを 0.5 cm 長さに切断し、それぞれの構造のためのカバーを作成します。口吻を操作するために、針金でフックを作製します。口吻の最も近位の部分が保護されるまで、カバーのいずれかに口吻を伸ばします。バティックワックスをしっかりと使い、チューブを頭被の背面部分に固定します。次に、触角を慎重に固定し、バティックワックスでチューブを固定します。続いて、バックル圧縮筋を切断して脳を安定させます。解剖顕微鏡下で、マイクロ解剖ツールを用いて、口吻のすぐ下を小さく切開し、頭 capsule を開きます。筋肉が切断されていることを確認するため、口吻の遠位3分の2にショ糖溶液を与え、5分間、口吻が伸展しないことを確認します。その後、溶かしたバティックワックスの層を用いて頭部カプセルを封止します。脳に生理食塩水を灌流させるために、頭部の腹側にワックス製のカップを作成します。電動ワクセー（電気ペン）を使用し、頭部の前方から後方に向かってワックスカップを作成します。口吻と触角のチューブはカップの中に保持してください。目の高さに達するまで、外側および上方に向かってカップの作成を続けます。ピンセットを用いて小顎鬚を取り出し、溶かしたワックスを使用してワックスカップに固定します。次に、二液性エポキシ樹脂を薄く塗り、ワックスカップとチューブの開口部を密封します。エポキシ樹脂は爪楊枝を使って混ぜ合わせてください。まず、カップの外側と内側の表面を覆います。次に、頭部をよりしっかりと固定するため、ネック周囲の拘束チューブ部分を充填します。20分後、カップに漏れがないか確認してください。脳外科手術を開始するには、まず唇状触角を切除します。頭部カプセルの腹側を開くため、頭部の背面と前面、および目の周囲に沿って角質層を切開します。次に、頭部の背面を切開し、口器付近の頭部前面に沿ってさらに切開を加えます。次に、ピンセットでキューティクルのフラップをゆっくりと持ち上げ、脳を露出させます。ここで、最も重要な工程であるSEZおよび上顎神経の露出を行います。脂肪組織と気管を、ゆっくりと慎重に除去してください。新鮮な生理食塩水で脳を頻繁に洗浄してください。上顎神経を圧迫しやすいため、細心の注意を払ってください。最終的にSEZと上顎神経が見えてきたとき、それらは薄い鞘に覆われています。このシースを除去するには、余分な生理食塩水を排出し、10% collagenase dispase溶液を適用してシースを弱めます。5分間浸漬した後、生理食塩水で溶液を数回洗い流します。その後、生理食塩水で数回洗浄し、超極細マイクロディセクション鉗子を用いて慎重にシースを取り除きます。最後に、灌流カップに生理食塩水の点滴ラインを固定します。本セクションでは、味物質投与システムの構築および使用方法について説明します。このシステムは、複数の開口部を持つ試験管で構成されています。これらの開口部は、動物の口吻、多様な味覚物質、および色彩センサーの進入路となり、また水の流通を可能にします。このシステムを構築するには、まず口吻用の試験管を準備します。はんだごてを使用して、口吻サイズの穴を開けてください。次に、チューブ内に、口吻を固定するためのスクリーン付きセクションを構築します。穴から5 mm上の位置で切断し、そこにワックスでメッシュを配置して、ワックスとエポキシ樹脂を用いてチューブを再接続します。味物質の投与には、加圧灌流システムを使用してください。必要な数だけ味質検知チューブをマニホールドに接続します。味質出力チューブを接続するには、メッシュの約1cm上に穴を開け、エポキシ樹脂で出力チューブを固定します。各味質チューブには、カラーセンサーで検出するための人工染料を含めてください。メッシュから0.5 cm離れた装置の穴にカラーセンサーを取り付け、エポキシ樹脂で固定します。ペリスタルティックポンプを使用し、シリコンチューブ経由で蒸留水をシステム内に供給します。排水は大きな容器で回収します。空気圧ポンプを使用して、空気のパフと共に味物質を送り出します。次に、チューブに純水をポンプで送り込み、味物質をパルス状に送り出して、カラーセンサーのテストを行います。その後、蛾の口吻の3分の2を試験管に挿入します。ピンセットを使用して口吻を伸ばし、ゆっくりと穴の中に押し込みます。次に、ソフトデンタルワックスとエポキシ樹脂の層を用いて、口吻を固定して封止します。その後、生理食塩水灌流ラインを接続し、灌流流量を設定します。次に、ツイストワイヤテトロードの接地電極を生理食塩水浴に浸します。その後、マイクロマニピュレーターを用いて、テトロードを上顎神経の横に配置し、ゆっくりと神経内に挿入します。スパイク信号を検出した後、記録を開始する前に、少なくとも10分間、標本を安定させます。記述したプロトコルに従い、味物質の投与前、投与中、および投与後に、味覚受容ニューロンからの記録を行った。各味物質の1秒間のパルスの開始と終了は、カラーセンサーでモニターした。味物質によって誘発されたスパイクを、4つのチャネルそれぞれで検出した。スパイクトレイン内において、個々の活動電位が観察されました。これらのスパイクを個々のニューロンに割り当てるために、スパイクソーティングソフトウェアを使用しました。6種類の味質を順次提示した際の3つの異なる味覚受容ニューロンの応答から、ベースライン活性のレベルおよび味質に対する選択性が異なることが明らかになりました。また、応答のタイミングは異なっていました。刺激の持続時間に同期するものもあれば、刺激終了後も持続するものもありました。また、従来のシャープガラス電極を用いて、味覚受容細胞の軸索から細胞内記録を行うことができました。細胞内記録の結果は、上述のテトロード法を用いて観察された反応と非常に類似していましたが、テトロード記録の方が実施しやすく、持続時間が長く、より堅牢でした。このビデオを視聴することで、mandi-casecstaの上顎神経と食道下領域を露出させ、精密な時間制御が可能な味物質供給システムを構築できるようになります。本プロトコルの実施にあたっては、mandi-casecstaが脱落させる微細な粉状の鱗がアレルゲンとなる可能性があるため、実験用安全手袋とフェイスマスクを着用してください。この手順に習熟すれば、3時間半で完了させることができます。本手順を応用し、複数の脳領域から同時に記録を行うことで、味物質に対する味覚受容ニューロンの応答が、ポストシナプスの標的ニューロンに伝達される際にどのように変換されるかといった、さらなる疑問に対する検証も可能です。

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JoVE Journal

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神経科学

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ショウジョウバエの前脚と吻には、味覚感覚ニューロンの豊富なレパートリーが含まれています。ここでは、カルシウムイメージングを使用して、味覚フェロモンの外因性の適用による生きたハエの前脚と吻の感覚ニューロンからの生理学的応答を測定する方法を紹介します。...

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味覚は、有益な物質への引き寄せと有毒物質の回避を促進する重要な感覚プロセスです。...

大人のための味の好みアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、人間の味覚応答を測定し、簡単な解剖学的評価、短い味テスト、およびサブジェクトの報告された感覚と味覚受容体遺伝子を使用して、検証メソッドが含まれています。...

味試験: 検証して簡単なテスト

本論文では、全体および無傷の味覚芽(それらを内面化する神経線維を含む)を一貫して生み出し、味覚芽内の構造と周囲の乳頭の構造間の関係を維持する全真菌形態、周回、口蓋味覚芽の組織調製、染色、分析の方法について説明する。...

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。...

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

本稿では、舌上の生体内イメージングウィンドウにマイクロ流体を統合することにより 、生体内で...

μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

電気生理学的記録のめったに使用されない方法である塩基記録は、従来の記録方法では調べることができなかった味覚コーディングの特徴を分析することができます。塩基記録により、従来の電気生理学的手法では研究できない疎水性刺激に対する味覚応答の分析も可能になります。...

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

カルシウムイメージングアプローチにより、覚醒しているハエの脳内で味覚誘発反応を記録し、ラベルに溶液を塗布することができます。 Drosophila melanogaster...

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

学ぶManduca sextaを用いた味覚コーディング研究法。生体内で複数の味覚受容ニューロンを記録し、精密な味刺激の送達とモニタリングを行う技術を解説。神経科学と行動生物学の研究者に有用です。

味覚コーディングを研究する新しい方法

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