味覚コーディングを研究する新しい方法

これらの手法の全体的な目的は、味物質の精密にタイミングを制御したパルスを投与・モニタリングしながら、in vivoで複数の受容ニューロンの活動を記録することにより、単純な動物であるmandi-casecstaにおける味覚コーディングを研究することです。これらの手法は、味物質が味覚受容ニューロンの集団によってどのようにコードされるかといった、味覚に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、精密に投与された味刺激の前後および最中に、複数の味覚ニューロンのin vivo記録が可能であることです。

解剖の手順が複雑であるため、この方法に慣れていない方は困難に感じるかもしれません。そのため、本手法の視覚的なデモンストレーションがお役に立てばと考えております。これらの技術は、Sam Writer氏が私の研究室の大学院生だった際にAlejandra氏と共に開発したものであり、今回はKui Sun氏がこれらの手順を実演します。

羽化から3日後、概ね健康な外見をした雌雄いずれかの蛾を選択します。翅が完全に伸展し、口吻および触角が正常に形成され、損傷がない個体を選んでください。ドラフトチャンバー内で、頭部だけが出るまで選択した蛾を拘束チューブに挿入します。

次に、チューブの反対端にティッシュペーパーを挿入して、蛾を固定します。続いて、シリンジから加圧空気を送り、露出した頭部から毛を除去します。その後、チューブをペトリ皿内の粘土台の上に置きます。

頭部の背面を上に向けます。次に、触角と口吻を保護します。まず、200 µL ピペットチップを 0.5 cm 長さに切断し、それぞれの構造のためのカバーを作成します。

口吻を操作するために、針金でフックを作製します。口吻の最も近位の部分が保護されるまで、カバーのいずれかに口吻を伸ばします。バティックワックスをしっかりと使い、チューブを頭被の背面部分に固定します。

次に、触角を慎重に固定し、バティックワックスでチューブを固定します。続いて、バックル圧縮筋を切断して脳を安定させます。解剖顕微鏡下で、マイクロ解剖ツールを用いて、口吻のすぐ下を小さく切開し、頭 capsule を開きます。

筋肉が切断されていることを確認するため、口吻の遠位3分の2にショ糖溶液を与え、5分間、口吻が伸展しないことを確認します。その後、溶かしたバティックワックスの層を用いて頭部カプセルを封止します。脳に生理食塩水を灌流させるために、頭部の腹側にワックス製のカップを作成します。

電動ワクセー（電気ペン）を使用し、頭部の前方から後方に向かってワックスカップを作成します。口吻と触角のチューブはカップの中に保持してください。目の高さに達するまで、外側および上方に向かってカップの作成を続けます。

ピンセットを用いて小顎鬚を取り出し、溶かしたワックスを使用してワックスカップに固定します。次に、二液性エポキシ樹脂を薄く塗り、ワックスカップとチューブの開口部を密封します。エポキシ樹脂は爪楊枝を使って混ぜ合わせてください。

まず、カップの外側と内側の表面を覆います。次に、頭部をよりしっかりと固定するため、ネック周囲の拘束チューブ部分を充填します。20分後、カップに漏れがないか確認してください。

脳外科手術を開始するには、まず唇状触角を切除します。頭部カプセルの腹側を開くため、頭部の背面と前面、および目の周囲に沿って角質層を切開します。次に、頭部の背面を切開し、口器付近の頭部前面に沿ってさらに切開を加えます。

次に、ピンセットでキューティクルのフラップをゆっくりと持ち上げ、脳を露出させます。ここで、最も重要な工程であるSEZおよび上顎神経の露出を行います。脂肪組織と気管を、ゆっくりと慎重に除去してください。

新鮮な生理食塩水で脳を頻繁に洗浄してください。上顎神経を圧迫しやすいため、細心の注意を払ってください。最終的にSEZと上顎神経が見えてきたとき、それらは薄い鞘に覆われています。

このシースを除去するには、余分な生理食塩水を排出し、10% collagenase dispase溶液を適用してシースを弱めます。5分間浸漬した後、生理食塩水で溶液を数回洗い流します。その後、生理食塩水で数回洗浄し、超極細マイクロディセクション鉗子を用いて慎重にシースを取り除きます。

最後に、灌流カップに生理食塩水の点滴ラインを固定します。本セクションでは、味物質投与システムの構築および使用方法について説明します。このシステムは、複数の開口部を持つ試験管で構成されています。

これらの開口部は、動物の口吻、多様な味覚物質、および色彩センサーの進入路となり、また水の流通を可能にします。このシステムを構築するには、まず口吻用の試験管を準備します。はんだごてを使用して、口吻サイズの穴を開けてください。

次に、チューブ内に、口吻を固定するためのスクリーン付きセクションを構築します。穴から5 mm上の位置で切断し、そこにワックスでメッシュを配置して、ワックスとエポキシ樹脂を用いてチューブを再接続します。味物質の投与には、加圧灌流システムを使用してください。

必要な数だけ味質検知チューブをマニホールドに接続します。味質出力チューブを接続するには、メッシュの約1cm上に穴を開け、エポキシ樹脂で出力チューブを固定します。各味質チューブには、カラーセンサーで検出するための人工染料を含めてください。

メッシュから0.5 cm離れた装置の穴にカラーセンサーを取り付け、エポキシ樹脂で固定します。ペリスタルティックポンプを使用し、シリコンチューブ経由で蒸留水をシステム内に供給します。排水は大きな容器で回収します。

空気圧ポンプを使用して、空気のパフと共に味物質を送り出します。次に、チューブに純水をポンプで送り込み、味物質をパルス状に送り出して、カラーセンサーのテストを行います。その後、蛾の口吻の3分の2を試験管に挿入します。

ピンセットを使用して口吻を伸ばし、ゆっくりと穴の中に押し込みます。次に、ソフトデンタルワックスとエポキシ樹脂の層を用いて、口吻を固定して封止します。その後、生理食塩水灌流ラインを接続し、灌流流量を設定します。

次に、ツイストワイヤテトロードの接地電極を生理食塩水浴に浸します。その後、マイクロマニピュレーターを用いて、テトロードを上顎神経の横に配置し、ゆっくりと神経内に挿入します。スパイク信号を検出した後、記録を開始する前に、少なくとも10分間、標本を安定させます。

記述したプロトコルに従い、味物質の投与前、投与中、および投与後に、味覚受容ニューロンからの記録を行った。各味物質の1秒間のパルスの開始と終了は、カラーセンサーでモニターした。味物質によって誘発されたスパイクを、4つのチャネルそれぞれで検出した。

スパイクトレイン内において、個々の活動電位が観察されました。これらのスパイクを個々のニューロンに割り当てるために、スパイクソーティングソフトウェアを使用しました。6種類の味質を順次提示した際の3つの異なる味覚受容ニューロンの応答から、ベースライン活性のレベルおよび味質に対する選択性が異なることが明らかになりました。

また、応答のタイミングは異なっていました。刺激の持続時間に同期するものもあれば、刺激終了後も持続するものもありました。また、従来のシャープガラス電極を用いて、味覚受容細胞の軸索から細胞内記録を行うことができました。

細胞内記録の結果は、上述のテトロード法を用いて観察された反応と非常に類似していましたが、テトロード記録の方が実施しやすく、持続時間が長く、より堅牢でした。このビデオを視聴することで、mandi-casecstaの上顎神経と食道下領域を露出させ、精密な時間制御が可能な味物質供給システムを構築できるようになります。本プロトコルの実施にあたっては、mandi-casecstaが脱落させる微細な粉状の鱗がアレルゲンとなる可能性があるため、実験用安全手袋とフェイスマスクを着用してください。

この手順に習熟すれば、3時間半で完了させることができます。本手順を応用し、複数の脳領域から同時に記録を行うことで、味物質に対する味覚受容ニューロンの応答が、ポストシナプスの標的ニューロンに伝達される際にどのように変換されるかといった、さらなる疑問に対する検証も可能です。