味覚コーディングを研究する新しい方法

これらの方法の全体的な目標は、複数の受容体ニューロンの活性をin vivoで記録することにより、単純な動物のマンディカセクスタで味覚コーディングを研究することです。これらの方法は、味覚受容体ニューロンの集団によってテイスターがどのようにコードされるかなど、味覚に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、正確に送達されたテイスタント刺激の前、最中、および後に、複数の味覚ニューロンのin vivo記録を可能にすることです。

この方法に不慣れな人は、解剖手順が複雑であるため、難しいと感じるかもしれません。このため、この方法の視覚的なデモンストレーションが役立つことを願っています。これらの技術は、Sam Writerが私の研究室の大学院生だったときに開発したもので、Alejandraとともに、Kui Sunがこれらの手順を実演します。

卵閉の3日後、一般的に健康な外観を持つどちらの性別の蛾を選びました。翼は完全に伸ばし、吻と触角は整形され、無傷であるべきです。ヒュームフードで、選択した蛾を頭が露出するまで拘束チューブに挿入します。

次に、チューブのもう一方の端にティッシュペーパーを挿入して蛾を固定します。次に、注射器から供給される加圧空気を使用して、露出した頭から髪の毛を取り除きます。次に、チューブをペトリ皿の粘土プラットフォームに置きます。

頭の背側を上に向けます。次に、アンテナとテングを保護します。まず、200マイクロリットルのピペットチップを半センチメートルの長さにカットして、各構造のカバーを作ります。

テングを操作するには、ワイヤーからフックを準備します。テングの最も近位部分が保護されるまで、テングをカバーの1つに伸ばします。しっかりとしたバティックワックスを使用して、チューブをヘッドカプセルの背側部分に固定します。.

次に、アンテナを慎重にシートし、チューブをバティックワックスで固定します。次に、バックルコンプレッサーの筋肉を切って脳を安定させます。解剖顕微鏡下で、マイクロダイセクションツールを使用して、吻のすぐ下に小さな切り込みを入れてヘッドカプセルを開きます。

筋肉が切断されたことを確認するために、吻の遠位3分の2にショ糖溶液を提供し、5分間、吻が伸びないことを確認します。次に、溶かしたバティックワックスの層を使用してヘッドカプセルを閉じます。生理食塩水で脳を灌流するには、頭の腹側の周りにワックスカップを作ります。

電動ワックスを使用して、頭の前面に沿ってワックスカップを後ろに向かって作り始めます。テングとアンテナチューブをカップの中に入れておきます。目の高さに達するまで、カップを外側と上に向かって構築し続けます。

鉗子を使用して、唇の触手を取り、溶かしたワックスを使用してワックスカップに取り付けます。次に、ワックスカップとチューブの開口部を、バイナリエポキシのモノの層を使用してシールします。つまようじを使ってエポキシを混ぜます。

まず、カップの外面と内面を覆います。次に、首を囲む拘束チューブの部分を満たして、頭がよりしっかりと保持されるようにします。20分後、カップに漏れがないか確認してください。

脳手術を開始するには、まず唇の手触りを切り取ります。頭部包の腹側を開くには、頭の後ろと前、および目の周りのキューティクルをカットします。次に、後頭部に沿って切り込み、吻の近くで頭の前部に沿ってさらに切り込み

次に、鉗子でキューティクルのフラップをそっと持ち上げて脳を露出させます。次に、最も重要なステップを実行し、SEZと上顎神経を露出させます。脂肪組織と気管をゆっくりと慎重に取り除きます。

新鮮な生理食塩水で脳を頻繁にすすいでください。上顎神経をつぶすのは非常に簡単なので、十分に注意してください。SEZと上顎神経がようやく見えるようになったとき、それらは薄い鞘で覆われます。

このシースを取り外すには、余分な生理食塩水を排出し、10%コラゲナーゼディスパーゼ溶液を適用してシースを弱めます。.5分間浸した後、生理食塩水で溶液を数回洗い流します。次に、生理食塩水で数回すすぎた後、超微細マイクロダイセクション鉗子を使用してシースを静かに取り外します。

最後に、生理食塩水の点滴ラインを灌流カップに固定します。このセクションでは、tastants配送システムの構築方法と使用方法について説明します。このシステムは、いくつかの開口部を持つ試験管で構成されています。

開口部は、動物の吻、tastantsマニホールド、カラーセンサーの入り口を提供し、水のフロールスルーを可能にします。このシステムを構築するには、まずテング用の試験管を準備します。はんだごてを使用してテングサイズの穴を開けます。

次に、チューブ内にスクリーニングされたセクションを構築して、テングを所定の位置に保持します。穴の5mm上にカットし、そこにメッシュをワックスで置き、ワックスとエポキシを使用してチューブを再度接続します。加圧灌流システムを使用して、テイスタントを配送します。

必要な数のテイスタントチューブをマニホールドに結合します。テイスタント出力管を接続するには、メッシュから約1センチメートル上に穴を開けてから、出力管をエポキシで固定します。各tastantには、カラーセンサーで検出する人工染料を含む。

メッシュから半センチメートルほどの穴にカラーセンサーを取り付け、エポキシで固定します。ペリスタルティックポンプを使用して、蒸留水をシリコンチューブを介してシステムに供給します。大きな容器で廃水を回収します。

空気圧ポンプを使用して、空気を吸い込んでテイスタントを送ります。次に、チューブにきれいな水を送り込み、テイスタントのパルスを送ってカラーセンサーをテストします。次に、蛾の吻の3分の2を蒸留液を試験管に入れます。

鉗子を使用して、吻を伸ばし、穴にそっと押し込みます。次に、柔らかい歯科用ワックスとエポキシの層でテングを所定の位置に密封します。次に、生理食塩水灌流ラインを接続し、灌流フローを設定します。

次に、四極管撚り線の接地電極を生理食塩水浴に浸します。次に、マイクロマニピュレータを使用して、四極管を上顎神経の隣に配置し、ゆっくりと神経の中に進みます。スパイク信号を検出した後、録音を行う前に、調製物を少なくとも10分間安定させます。

記録は、記載されたプロトコルを使用して、テイスタント送達前、送達中、および送達後に味覚受容体ニューロンから行われた。各テイスタントの1秒パルスの開始とオフセットは、カラーセンサーによって監視されました。テイスタントは、4つのチャネルのそれぞれによって検出されたスパイクを誘発しました。

スパイクトレイン内では、個々の活動電位を観察することができました。スパイクソーティングソフトウェアを使用して、これらのスパイクを一意のニューロンに割り当てました。順番に送達された6つのテイスタントに対する3つの異なる味覚受容体ニューロンの応答は、テイスタントに対するベースライン活性と選択性の異なるレベルを明らかにします。

また、回答のタイミングも異なっていました。刺激の持続時間に固定されているものもあれば、刺激よりも長持ちするものもあります。細胞内記録は、従来の鋭利なガラス電極を使用して味覚受容体軸索からも作成できます。

細胞内記録は、記載された四極管技術を用いて観察された応答と非常に類似していたが、四極管記録は作成が容易で、持続時間が長く、より堅牢であった。このビデオを見た後、mandi-casecstaの上顎神経と食道下ゾーンを露出させることができ、正確な時間制御を備えたテイスタントデリバリーシステムを構築できるはずです。このプロトコルを実行するときは、マンディカセクスタによって微細な粉末状の鱗屑が排出される可能性があるため、実験室の安全手袋とフェイスマスクを着用してください。

一度マスターすれば、この手順は3時間半で完了することができます。この手順に続いて、複数の脳領域からの同時録音も実行して、味覚に対する味覚受容体ニューロンの応答がシナプス後標的ニューロンに伝達されるときにどのように変化するかなどの追加の質問に答えることもできます。