Name: 形態とマウスの下顎頭軟骨細胞解析法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶマウス下顎頭軟骨の形態計測と細胞解析法。圧縮負荷による構造変化と細胞変化を放射線撮影と組織学的分析で評価し、軟骨の力学応答を理解するための実験プロトコルを解説します。

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著者は、博士デビッド ・ ロウ提供いただきありがとうございます親切トランスジェニック マウスと李陳組織の援助をしたいと思います。
この出版物で報告された研究はだった国立歯科頭蓋顔面研究賞を受賞番号 K08DE025914 の下で健康の国民の協会 · スミット ・ ヤーダブに矯正基礎のアメリカ協会でサポートされています。

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<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+functional+loading+causes+differential+effects+in+the+subchondral+bone+and+condylar+cartilage+in+the+temporomandibular+joint+from+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice.</a> Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).</li>
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<li>Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+temporomandibular+joint+changes+in+Twin+Block+and+Bionator+appliance+therapy%3A+a+magnetic+resonance+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Orthod%22%5BJournal%5D)">Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study.</a> Prog Orthod. 15 (57), (2014).</li>
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<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Altered+Loading+on+Mandibular+Condylar+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+Multi-Image+Cryohistology+of+Mineralized+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues.</a> J Vis Exp. , e54468(2016).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
<li>Hayman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+%28TRAP%29+and+the+osteoclast%2Fimmune+cell+dichotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy.</a> Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).</li>
</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

この原稿は、形態計測およびマウス下顎頭および下顎骨の細胞分析のための方法を説明します。撮影形態計測は、実験用小動物から他の骨を分析する使用できます。また、細胞解析 (細胞の定量化と軟骨の距離マッピング) 齧歯動物の下顎に限定されないが多数の組織の組織学的セクションを定量化する使用ことができます。
蛍光レポーターを表現するトランスジェニック マウス モデルは、遺伝子発現の変化を視覚的に理解する優れたツールです。このレポートで使用されるダブル コラーゲン蛍光レポーター マウス モデル (Col2a1XCol10a1) だった MCC の勉強に特に向いている良くは、MCC の prehypertrophic および肥大地域で表されますので、コラーゲンの分布評価でした。研究者に蛍光レポーターを表現するトランスジェニック マウス モデルへのアクセスがあるない場合は、組織タンパク質の発現解析、蛍光抗体法などの他の方法を使用できます。
地形計測のキャビネットのレントゲン画像を撮影する前に重要なステップは分析する骨や下顎骨のすべての軟組織を取...

顎関節は顎顔面領域に位置するユニークな荷重関節で、線維軟骨の形成されます。顎関節の MCC が話すと、咀嚼しながら妨害されていない顎運動を含む関節の機能的な変性疾患、変形性関節症1を含む一般受けます。顎関節 MCC2,3,4、5のコンポーネントの構造および細胞の変更につながる外部刺激や負荷の変化に適応する能力があります。MCC の荷重特性は、水入り、コラーゲン ネットワークやプロテオグリカンが密集、成分間の相互作用によって説明できます。MCC はコラーゲンと非コラーゲン蛋白質の種類を表す 4 つの異なる細胞地帯: 1) 表在性または関節ゾーン;2) 増殖のゾーン、未分化間葉系細胞の構成要求の読み込みに対応します。3) prehypertrophic のゾーン、コラーゲン タイプ 2; を表現する成熟した軟骨細胞から成る・ 4)、肥大ゾーン、コラーゲンを表現する肥大軟骨細胞が死ぬ 10 を入力領域と石灰化を受けます。非鉱化地域は圧縮力6への抵抗を提供するプロテオグリカンが豊富です。
肥大軟骨軟骨から骨への転移が発生する MCC の継続的な鉱化作用がある7下顎頭の軟骨下骨の堅牢なミネラル構造を保証します。Unmineralized と鉱化地域の細胞の変化は、最終的に下顎頭および下顎骨の形態・構造の変化に します。クライアントのすべての携帯電話地域と軟骨部分の鉱化作用の恒常性の維持は、顎関節の健康、荷重容量性に不可欠です。
(前述の Utrejaらによって) 複数のコラーゲン トランスジェニック マウス モデル8は、すべての遺伝子は、MCC で表されるのでコラーゲン発現の変化を理解するを使用する素晴らしいツールです。詳細な病理組織学的評価、マトリックス析出、鉱化作用、細胞増殖、アポトーシス、MCC の異なる細胞層でのタンパク質発現を研究する組織学的汚れが使用されます。
この原稿、病理組織学的および形態計測学的解析はマウスの下顎の MCC と軟骨下骨の細胞および構造の変化を評価する使用されます。さらに、蛍光組織標本画像の分析や顕微鏡スライドをマッピングするためのように、セル定量化の方法を説明します。MCC と軟骨下骨9時細胞と形態学的変化が原因で、メソッドを読み込み、圧縮静的顎関節は、我々 の方法を検証するも示されています。
下顎頭および齧歯動物の下顎の組織変化と形態を決定するため、軟骨内骨化の他の地域とその他の硬組織の形態を分析したり、ここで説明する方法を使用できます。

<table><tbody><tr><td>MX20 X線撮影システム</td><td>Faxitron X-Ray LLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digimizer Imageソフトウェア&nbsp;</td><td>MedCalc ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon クライオマトリックス埋め込み樹脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>手動顕微鏡 Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>yellow fluorescent protein filter&nbsp; - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>シアン蛍光タンパク質フィルター - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>赤色蛍光タンパク質フィルター - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム酢酸ナトリウム無水物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム L-酒石酸二塩基性二水和物&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ELF97 基板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10339&nbsp;</td><td>EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)を含む&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>トルイジン ブルー O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop&nbsp;</td><td>アドビシステムズ社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水錠(PBS)</td><td>リサーチプロダクツインターナショナル</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III ニッケルフリーアーチワイヤー</td><td>オルソオーガナイザーズ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPadプリズム&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc. (英語)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

形態とマウスの下顎頭軟骨細胞解析法

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

顎の関節 (顎関節) は外部からの刺激に適応する能力と顆の位置だけでなく、下顎頭軟骨 (MCC) の構造および細胞のコンポーネントに影響を与えることができます変更を読み込んでいます。本稿では、これらの変更、マウス (すなわち、読み込んで圧縮の静的顎) の顎関節の荷重を変更するためのメソッドを分析するためのメソッドについて説明します。ここで示した構造の評価は Digimizer ソフトウェアを使用して、小さな骨のレントゲン写真で実行される単純な形態計測学的アプローチです。さらに、携帯の解析式コラーゲン、骨、細胞分裂の変化にリードを変更してクライアントにおけるプロテオグリカンの分布を説明しました。使用して肯定的な蛍光ピクセルを数えることでの組織学的セクションでこれらの変更の定量化画像ソフトウェアと測定距離マッピングとすすけるエリア Digimizer - でも実証されています。ここに示すメソッドは、マウスの顎関節に限定されないが、追加骨実験用小動物の軟骨内骨化の他の地域で使用できます。

記述統計を行った地形計測 (下顎長, 顆頭長, 顆頭幅) と組織学的解析の分布を調べる。結果は、読み込まれたグループ (すなわち、 β チタン スプリング圧縮荷重を受けるマウス) および制御グループ (すなわち、任意のプロシージャを受けなかったコントロール マウスと一致する) を比較した.対になっていない t 検定の p 値、平均値の間に統計的有意差を求めた < 0.05 は統計的に有意とみなされました。
形態計測、ステップ 4、図 3で説明したようは、読み込まれているの無顎類と制御グループで行われました。大幅に増加した下顎の長さは、読み込まれたグループ (ロード: 16.62 ± 0.23 mm と制御: 16.21 ± 0.2 mm; p < 0.05) と下顎頭の長さ (ロード: 4.6 mm、SD 制御対 0.08 mm: 4.4 mm;SD 0.0...

この原稿は、形態および齧歯動物の下顎内携帯電話の変更を分析するための方法を示します。

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

本実験の全体的な目的は、放射線透過写真における形態計測および組織学的解析を用いて、マウスの下顎関節結節軟骨における圧縮負荷の影響を観察することです。これらの指標は、げっ歯類の下顎結節内における構造的および細胞的な変化に関する重要な疑問への回答に役立ちます。ここで示す手法の主な利点は、他の小型骨格動物や介入動物の解析にも適用できることです。本プロトコルのために、単離および解剖済みのマウス下顎骨を準備しておきます。下顎骨をシャーレに入れ、X線撮影システムに転送します。次に、26 kilovoltsで5秒間の放射線撮影を行います。次に、解析ソフトウェアで画像を開き、形態計測を行います。まず、ユニットボタンを使用してスケールバーを設定します。次に、マーカー形式2を用いて6つの解剖学的ポイントを選択します。まず、下顎顆の最後方の点を点1として選択します。次に、切痕突起を点2として選択します。その後、シグモイド切痕の最深点を点3として選択します。次に、下顎枝の凹みの最も深い点（点4）を選択し、続いて顆状突起関節面の最前方点（点5）を選択します。次に、顆状突起関節面の最後方点を点6として選択し、長さ測定ツールを用いて長さの測定を行います。続いて、点3から点4に向かう垂線ツールを使用し、点1から点3と点4を結ぶ線への垂線の長さである顆頭長を測定します。次に、点1と点2の間の下顎長を測定します。最後に、点5と点6の間にある顆頭幅を測定します。データを保存するには、画面右側にある測定リストをコピーしてください。固定済みで脱灰していない下顎骨を包埋する前に、PBSで調製した30%ショ糖溶液に一晩浸漬させます。翌日、過剰な軟組織を切り除き、下顎頭を慎重に切り出します。次に、下顎頭の内側面をモールドの底面に合わせ、サンプルが底面と平行になるようにプラスチック製モールドに配置します。次に、それらを包埋樹脂に浸し、ドライアイスを用いて樹脂を冷却します。続いて、モールドにさらに包埋樹脂を満たします。その後、冷凍庫またはドライアイスで冷却した冷たい2-メチルブタンに移動させます。冷却後、切片作成のために、検体を-20°Cまたは-80°Cで保存します。顆頭の正中断面において、MCCにおけるCol10a1の発現を定量化するには、画像解析ソフトウェアパッケージで組織画像を開き、投げ縄ツールを使用して関心領域を選択します。ここでは、MCC領域を選択します。ヒストグラムボックスに表示される、領域内のピクセル数を確認します。次に、カラー範囲を調整して、Col10a1の赤色ピクセルを選択します。スポイトツールを使用して画像から赤色ピクセルを選択し、OKをクリックします。その後、ヒストグラムボックスに表示される領域内の赤色ピクセル数を記録します。領域内の赤色ピクセルの割合は、Col10a1の発現量を示しています。次に、同様の基本手法を用いて、MCCおよび軟骨下骨におけるTRAP活性を定量します。まず、軟骨下骨領域の軟骨を解析領域として選択し、総ピクセル数を記録してください。次に、ELF97基質によって生成された黄色いピクセルを選択します。陽性ピクセルの数を確認し、TRAP陽性ピクセルの割合を算出します。続いて、DAPIで青色にカウンター染されたEDU陽性細胞を定量します。再度、関心領域を選択し、その領域内の青色ピクセル数を定量化します。同様に、この方法を用いて、同じ領域内のEdU陽性ピクセル数を決定します。顎関節に圧縮負荷を与えたマウスの形態計測の結果、負荷によって下顎骨および関節頭の長さが有意に増加したことが示されました。それにもかかわらず、負荷によって顆頭幅に有意な変化は見られませんでした。コラーゲン分布を定量化したところ、負荷を与えた動物の顆頭において、Col10a1の発現とMCCが有意に増加していることが明らかになりました。一方で、Col2a1の発現は対照群と大きな差はありませんでした。顆頭の軟骨下領域および荷重負荷をかけたマウスにおいて、TRAP活性および細胞増殖能の上昇が認められた。EDU染色は増殖細胞数を示す。MCCにおけるプロテオグリカンの分布は、トルイジンブルー染色面積と距離マップを評価することで定量化した。負荷群の顆頭MCCにおける距離マッピングに有意な増加が認められました。しかしながら、プロテオグリカン染色領域については、群間に統計的な差は見られませんでした。このビデオを視聴することで、げっ歯類の下顎顆頭における細胞および構造的変化の解析方法について深く理解できるはずです。

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生物学

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形態とマウスの下顎頭軟骨細胞解析法

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