形態とマウスの下顎頭軟骨細胞解析法

本実験の全体的な目的は、放射線透過写真における形態計測および組織学的解析を用いて、マウスの下顎関節結節軟骨における圧縮負荷の影響を観察することです。これらの指標は、げっ歯類の下顎結節内における構造的および細胞的な変化に関する重要な疑問への回答に役立ちます。ここで示す手法の主な利点は、他の小型骨格動物や介入動物の解析にも適用できることです。

本プロトコルのために、単離および解剖済みのマウス下顎骨を準備しておきます。下顎骨をシャーレに入れ、X線撮影システムに転送します。次に、26 kilovoltsで5秒間の放射線撮影を行います。

次に、解析ソフトウェアで画像を開き、形態計測を行います。まず、ユニットボタンを使用してスケールバーを設定します。次に、マーカー形式2を用いて6つの解剖学的ポイントを選択します。

まず、下顎顆の最後方の点を点1として選択します。次に、切痕突起を点2として選択します。その後、シグモイド切痕の最深点を点3として選択します。

次に、下顎枝の凹みの最も深い点（点4）を選択し、続いて顆状突起関節面の最前方点（点5）を選択します。次に、顆状突起関節面の最後方点を点6として選択し、長さ測定ツールを用いて長さの測定を行います。続いて、点3から点4に向かう垂線ツールを使用し、点1から点3と点4を結ぶ線への垂線の長さである顆頭長を測定します。

次に、点1と点2の間の下顎長を測定します。最後に、点5と点6の間にある顆頭幅を測定します。データを保存するには、画面右側にある測定リストをコピーしてください。

固定済みで脱灰していない下顎骨を包埋する前に、PBSで調製した30%ショ糖溶液に一晩浸漬させます。翌日、過剰な軟組織を切り除き、下顎頭を慎重に切り出します。次に、下顎頭の内側面をモールドの底面に合わせ、サンプルが底面と平行になるようにプラスチック製モールドに配置します。

次に、それらを包埋樹脂に浸し、ドライアイスを用いて樹脂を冷却します。続いて、モールドにさらに包埋樹脂を満たします。その後、冷凍庫またはドライアイスで冷却した冷たい2-メチルブタンに移動させます。

冷却後、切片作成のために、検体を-20°Cまたは-80°Cで保存します。顆頭の正中断面において、MCCにおけるCol10a1の発現を定量化するには、画像解析ソフトウェアパッケージで組織画像を開き、投げ縄ツールを使用して関心領域を選択します。ここでは、MCC領域を選択します。

ヒストグラムボックスに表示される、領域内のピクセル数を確認します。次に、カラー範囲を調整して、Col10a1の赤色ピクセルを選択します。スポイトツールを使用して画像から赤色ピクセルを選択し、OKをクリックします。その後、ヒストグラムボックスに表示される領域内の赤色ピクセル数を記録します。

領域内の赤色ピクセルの割合は、Col10a1の発現量を示しています。次に、同様の基本手法を用いて、MCCおよび軟骨下骨におけるTRAP活性を定量します。まず、軟骨下骨領域の軟骨を解析領域として選択し、総ピクセル数を記録してください。

次に、ELF97基質によって生成された黄色いピクセルを選択します。陽性ピクセルの数を確認し、TRAP陽性ピクセルの割合を算出します。続いて、DAPIで青色にカウンター染されたEDU陽性細胞を定量します。

再度、関心領域を選択し、その領域内の青色ピクセル数を定量化します。同様に、この方法を用いて、同じ領域内のEdU陽性ピクセル数を決定します。顎関節に圧縮負荷を与えたマウスの形態計測の結果、負荷によって下顎骨および関節頭の長さが有意に増加したことが示されました。

それにもかかわらず、負荷によって顆頭幅に有意な変化は見られませんでした。コラーゲン分布を定量化したところ、負荷を与えた動物の顆頭において、Col10a1の発現とMCCが有意に増加していることが明らかになりました。一方で、Col2a1の発現は対照群と大きな差はありませんでした。

顆頭の軟骨下領域および荷重負荷をかけたマウスにおいて、TRAP活性および細胞増殖能の上昇が認められた。EDU染色は増殖細胞数を示す。MCCにおけるプロテオグリカンの分布は、トルイジンブルー染色面積と距離マップを評価することで定量化した。

負荷群の顆頭MCCにおける距離マッピングに有意な増加が認められました。しかしながら、プロテオグリカン染色領域については、群間に統計的な差は見られませんでした。このビデオを視聴することで、げっ歯類の下顎顆頭における細胞および構造的変化の解析方法について深く理解できるはずです。