Name: ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ網膜におけるタンパク質局在の相関超解像・電子顕微鏡法。Tokuyasu切片と免疫染色を用いて、ミトコンドリアなどの細胞小器官内タンパク質を高精度に可視化し、網膜発生と疾患メカニズムの解明に貢献します。

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資金調達のイオンおよび RGB: Ambizione スコア スイス国立科学財団 PZ00P3 142404/1 と PZ00P3 163979 を与えます。

すべての実験 ARVO ステートメントに従って眼科と視覚に関する研究における動物の使用を行ったし、地元当局によって承認されたします。
 1 シリコンウェハー上超薄切片の作製 <ol><li>サンプル固定 <ol><li>0.1% グルタルアルデヒド、4% のホルムアルデヒド 0.1 M cacodylate バッファーを含む固定液を準備します。 。
		注: 注意!グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、cacodylate バッファーを操作するときに注意を使用して、適切な個人用保護具を着用、発煙のフードで動作します</li>。
		<li>上記 15 (5 dpf) ゼブラフィッシュ幼虫 (エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸、PBS (リン酸バッファー生理食塩水、pH 7) で 0.4 %w/v) tricaine 安楽死させる 5 日後に受精します</li>。
		<li>は、氷の上あらかじめ冷やして固定液に浸漬して幼虫を修正します。ヘッドを外すし、穏やかな揺動 4 ° C で一晩インキュベートします</li>。
		<li>は、1% のアガロース層状の板に冷固定液で微細鉗子と (双眼鏡) の下で顕微解剖メスを使用して目の周りの組織をトリミングすることによって目を解剖します。新鮮な中古冷蔵定着剤を管に目を転送します</li>。
		<li>室温 (RT) で洗うたび PBS (リン酸バッファー生理食塩水、pH 7.4) 5 分で 2 回洗う</li>。
	</ol></li> <li>ゼラチン浸潤およびマウント <ol><li>ウォーム アップ 15 mL 食ブランド ゼラチン 12 %w/v PB (リン酸バッファー, 0.1 M pH 7.4) で 40 ° C、PBS を削除し、目を含むチューブにゼラチン溶液を追加。サンプル ゼラチン浸潤を確認し穏やかな揺れでサーモや水浴の 40 ° C で 10-30 分間インキュベート優しくチューブをタップします</li>。
		<li>を埋める 12 mm × 5 × 3 mm のシリコンやポリエチレン 40 ° C の水浴中温かいゼラチンと金型を埋め込みフラット。ピペットを使用して金型ごと 2 つ目を追加、解剖針を用いた両眼の下でそれらを正しく整列させるし、1 分間室温でクールダウンし、4 ° C、20 分で硬化ゼラチン</li>
		<li>ゼラチン ブロックのかみそりの刃を使用してブロックごとの 1 つの目に合わせて両眼下を再トリムします</li>。
		<li>は、氷の上 PB で 2.3 M ショ糖に埋め込まれたゼラチン目を転送します。4 ° C で一晩インキュベートします</li>。
		<li>新しい 2.3 M ショ糖液と 4 ° C または-20 ° C で保存場所に Exchange この手順の後のサンプルは区分のため準備ができているまたはヶ月に数週間の-20 ° C で保存することができます</li>。
		<li>は再クライオ端子に転送する前にゼラチン ブロック目のほとんどのサイズをトリミングします。液体窒素で低温ウルトラミクロトームに乗り換えで凍結します</li>。
	</ol></li> <li>Cryosectioning <ol><li>カット 110 nm 厚いセクション-120 ° c 低温ウルトラミクロトームでダイヤモンド ナイフを使用します</li>。
		<li>(水) で 2% セルロースと 2.3 M ショ糖液 (1:1) の液滴を含む有線ループ セクションを選ぶ。7 mm × 7 mm シリコン ・ ウエハにセクションを転送します。さらに処理まで 4 ° c のセクションを格納します</li>。
	</ol></li></ol> 2。Immunolabelling <ol><li>4 滴滴に逆さまでウエハを置くことによって 20 分の 0 の ° C で PBS で洗浄ウェーハ。PBS 2 x 2 分間室温で洗って</li>。
	1 分の pbs は、0.15% で 3 回 <li>加温グリシン。1 分の 3 x を洗う/PBS で洗浄します。5 分前 incubate PBG (0.5% ウシ血清アルブミン BSA と 0.2% ゼラチン タイプ B PBS) と</li>
	<li>ウサギ抗 Tom20 と加温 (材料表 参照) PBG の (4 μ g/mL) 室温で 30 分間</li>。
	<li>は、PBG で 6 x 1 分/洗浄を洗浄します。あらかじめ抗家兎 Alexa 647 F(ab&#39;) 2 とした加温で 5 分間 PBG を incubate (材料の表 を参照してください) PBG の (7.5 μ g/mL) 30 分</li>
	<li>は、PBG で 6 x 1 分/洗浄を洗浄します。3 x 2 分を PBS で洗浄します。DAPI を孵化させなさい (4 μ g/mL) 10 の PBS で s 洗浄の PBS で 2 x 2 分</li>。
</ol> 3。超解像顕微鏡 <ol><li>加温簡潔にウェハ (10 s) グリセロール (80%) の 1:1 溶液液滴上に配置し、清掃システム (200 mM リン酸緩衝 10% ブドウ糖、0.5 mg/mL を含む酸素を格納するバッファーを画像でglucoseoxidase、40 μ g/mL カタラーゼ、15 mM ベータ-mercaptoethylamine 塩酸塩 (MEA HCL)、pH 8.0).</li>
	<li>グリセロール (80%) の 1:1 混合物の新鮮なドロップにガラス下部 (厚さ 170 ± 5 μ m) シャーレにウエハース (下向きのセクション) を転送し、(ステップ 3.1) のようにバッファーをイメージングします</li>。
	<li>は、ピペットで、すべての側面からウェハの下に液体のほとんどを削除します。シリコーンのストライプを使用してペトリ皿の底にウェーハを修正します 。
	注: シリコン ストライプ 2 成分シリコーン接着剤 (3 mm × 12 mm) から作られています</li>。
	高い開口数を使用して倒立顕微鏡上の <li>イメージ セクション (例: 160 X/NA 1.43; 材料表 を参照ください) 油浸超解像専用対物レンズ。イメージング、前に横方向と軸のドリフトを最小限に抑える/減らすために顕微鏡の温度に釣り合うサンプルができます</li>。
	<li>センターの関心のある分野、最初広視野落射蛍光画像を取得します。超解像の操作モードに変更します。15 ms にカメラの露光時間を調整し、(EM) 300 の最大利得を掛けて電子を設定します</li>。
	<li>点灯サンプル、642 nm 連続波レーザー落射蛍光モードで最大のレーザー パワー (~2.8 kW/cm 2 に対応)。よく、確率が低い場合の個々 の信号が重なって、レーザー パワーを ~0.7 kW/cm 2 にセットして、単一分子が点滅するとすぐに、各フレームで区切られます。30,000 フレームの最小値を取得することにより、落射蛍光モードで raw 画像を記録します 。
	注: すべてのこれらのパラメーターことができますのによって異なる異なる標本密度をラベリングします</li>。
	<li>Raw データから復興イベント リスト (raw イメージで各単一分子の点滅のローカライゼーション) を生成する] をクリックして 30 光子 (サンプルに応じて調整する必要がある) の検出閾値を使用して &#34; 評価 &#34; で、&#39; t シリーズ解析 &#39; 下 &#39; ツール &#39;.</li>
	<li>ガウシアンフィッティング 16 4 の描画ピクセル サイズを適用することによって超解像画像を視覚化するをクリックして nm &#34; イメージの作成 &#34; の &#39; イベント リスト処理パネル &#39; 下 &#39; ツール &#39; 。
	注: 超解決イメージを生成するため本研究で使用されるシステムの統合ソフトウェア ・ ツールが採用されました。しかし、他の単一分子局在ベース システムで記述されている超解像イメージングを実行でした、雷雨 17 としてオープン ソース ソフトウェア ツールでデータを処理する可能性があります</li>。
</ol> 4。プラチナ シャドーイング <ol><li>シリコン ストライプを削除し、ウェハの縁近くにシャーレからそれを持ち上げるの PBS のドロップを追加します。5 分 2 分の 2 倍を洗う/PBS で洗浄ポストは、PBS で 0.1% グルタルアルデヒドでそれを修正し、ウェハの pbs は、2 x 2 分を洗うです</li>。
	<li>では、5 分/インキュベーション セルロース 2% 氷の上の水の 1 滴のために二度ウェーハを孵化させなさい。遠心管のウェハを挿入し、遠心分離機 14,100 x g で 90 s. マウントそれカーボン セメントの実施と SEM アルミ スタブにします</li>。
	<li>2 から 10 までのレイヤーを追加するプラチナ/電子 8 ° 回転シャド ウイングによる試料の炭素の nm ビーム蒸発デバイス設定: 1.55 kV、55 mA、0.3 nm/秒、8 °、回転レベル 4 の角度</li>。
</ol> 5。走査電子顕微鏡観察 <ol><li>スキャン イメージ セクション電子 m1.5 icroscope kV、2 mm 作業距離し、二次電子検出器のレンズと共にします</li>。
</ol> 6。光および電子顕微鏡画像の配置 フィジー 18 をクリックして画像の <ol><li>両方オープン タイプ &#34; ファイル |オープン &#34;。クリックしてキャンバスのサイズを調整する &#34; 画像 |調整 |キャンバス サイズ &#34; をクリックしてスタックに両方の画像をもたらすと &#34; の画像 |スタック |画像のスタックを &#34;。Tiff ファイル タイプとしてスタックを保存します</li>。
	<li>、フィジーをクリックして新しい TrackEM2 19 インターフェイスを開く &#34; ファイル | 新規 |TrackEM2 (新) &#34;。黒のウィンドウを右クリックしを選択することによって両方の画像とスタックをインポート &#34; インポート スタック &#34;.</li>
	画像をマウスの右クリックを使用して選択しランドマークと手動で電子顕微鏡画像に <li>配置光顕微鏡画像 &#34; 配置 |ランドマークと手動でレイヤーを揃える &#34;。
	ランドマークを追加する <ol><li>ピック選択ツール (黒矢印)。(補足図 1) 両方の画像で同じエッジを選択するのに参照として核の形状を使用します。(最低限 3 つのポイントは選択する必要があります) いくつかのポイントを追加します。クリックすると、選択するマウスの右でアフィン モデルの位置合わせを適用 &#34; 変換を適用する |アフィン モデル &#34;.</li>
	</ol></li> <li>レイヤーの透明度を変更 (補足図 1 を参照)、配置の品質を評価する</li></ol>。

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Fölling, J., Bossi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+photoactivated+localization+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy.</a> PLOS one. 8 (10), e77209(2013).</li>
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<li>Suleiman, H., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+architecture+of+the+kidney+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane.</a> eLife. 2, e01149(2013).</li>
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<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
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<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS one. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Wurm, C. A., Neumann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+distribution+of+mitochondrial+import+receptor+Tom20+is+adjusted+to+cellular+conditions+and+exhibits+an+inner-cellular+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17947990">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).</li>
</ol>

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このメソッドは、蛋白質の細胞小器官内の正確な位置を決定する文脈情報を持つ超解決蛋白質のローカリゼーションを組み合わせたものです。核のような他の細胞器官とミトコンドリアの外膜または幼虫ゼブラフィッシュの網膜の視細胞の外側セグメント単位で Tom20 の発現を可視化する実験の完了を示すここで.
徳安クライオ断面と、手入れが行き届いたセクションを取得するいくつかのトレーニングが必要です。ただし、これは成功を示した21多くの所に採用されている方法です。Si ウェハへのセクションの転送は非常に単純な特別な配慮は必要ありません。画像バッファーでグリセリンの使用はセクションの乾燥を避けるために非常に重要なステップです。超解像イメージング ウェハがペトリ皿のガラス底に近づくと非常に最良の結果が取得されます。シリコーン ストライプこの位置にウェーハを管理するのに役立ちます。特別な注意は、セクションの損傷を防ぐために縞を除去しながらする必要があります。
低温セクション、約 100 の厚さ nm、Z 次元光学解像度より薄くはさらにこの薄い層からのみ超解像顕微鏡の信号が来ているようこの相関法の精度を容易と信号の走査型電子顕微鏡は、サンプルの地形を表示されています。このメソッドは、マルチカラー イメージングとも組み合わせることができます。ただし、特別な注意が必要、同じ条件 (例えば画像バッファー) の下でイメージを作成することができますサンプルとクロストークを防止する必要があります。
メソッドの 1 つの制限は、2 次元のアプローチは、連続切片 (約 3 に 7 ウェハあたり) の限られた数だけを集めることができます。したがって、ボリュームの分析を扱うプロジェクトは理想的ではないでしょう。しかし、組織のあらゆるタイプのサンプルの単純な区分でタンパク質の発現を検出に適用できるメソッドです。ウラニルの酢酸または鉛のクエン酸のような古典的な造影剤を使用しないメソッドを提供します。プラチナ シャドウによってコントラスト非常に有益な地形のコントラストを提供していますがいくつかのケースで膜は解決することは困難。これは、たとえば、小さい小胞蛋白質の発現を決定する必要があるプロジェクトの問題が生じる。
徳安クライオ-セクション、に基づいて、我々 のプロトコルは、標準装備を使って超解像と走査型電子顕微鏡から相関結果を取得します。シリコン基板上のセクションのコレクション、プラチナのコントラスト用試料調製に安定性を提供するために簡単な手順。

タンパク質と細胞の別のコンパートメントの関係の細胞レベル下の局在を決定する方法は、機能や相互作用の可能性を理解するための不可欠なツールです。超解像顕微鏡電子顕微鏡との組み合わせでは、このような情報の1を提供します。個々 の分子のリターン (GSDIM) 地上州枯渇顕微鏡超解像顕微鏡技術の有機性および遺伝的コード化の同時2の広い範囲と互換性があるは、最大 20 の横方向分解能を実現 nm3。 標準的な回折限界の顕微鏡より高い解像度を持つメソッド定款相関4,5,6の精度が向上します。蛋白発現の特定の細胞内コンパートメントの一番良い相関を達成するために、不確実性7同じ超薄切片の光顕および電顕の使用の量を減らすことをお勧めします。セクショニングのさまざまな方法、徳安クライオ セクション プロトコル脱水や樹脂埋め込みを必要としない、さらに、多くの抗原の抗原性を保持し、良い組織の微細構造の8を説明します。いくつかのメソッドは、相関光・電子顕微鏡 (クレム)4,5,9,10セクションのこれらの適用性を実証しています。
ゼブラフィッシュの網膜は、ビジュアル開発と脊椎動物の間でその非常に節約された構造と機能を与えられた人間の病気のメカニズムを検討する貴重なモデルです。膜特定、網膜視細胞表示で基底シナプス、切端基肥細長い核をもつ哺乳類の光受容体として同じアーキテクチャ内部セグメントをより根尖部と外側セグメントにおけるミトコンドリアのクラスタ リング構成最も根尖の位置11ディスク。多様な細胞コンパートメントに蛋白質のローカリゼーションはゼブラフィッシュの節約され、人間、ひと疾患関連タンパク質12,13の生物学的機能の調査を許可します。
ここで網膜サンプル相関超解像光および電子顕微鏡による Tom20 ミトコンドリア外膜タンパク質の局在を解決するゼブラフィッシュ稚魚を準備するためのプロトコルを提案する.シリコン基板上低温セクションを収集に基づくし、プラチナの薄層を適用した後生成される地形的情報によってコントラストを得るします。これらの手順は、使用、再現性、および実験を完了する時間の使いやすさの面で明確な技術的な改善です。我々 は最近、マウス組織14核孔とミトコンドリア蛋白質の検出手法の適用性を実証しました。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde EM Grade</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>フラットエンベデッドモールド</td><td>BEEMフラット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>地元の食品ブランド ゼラチン</td><td>Dr.Oetker</td><td>エクストラゴールド</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>メルク</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma</td> <td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma</td> <td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンB型</td><td>Sigma</td> <td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td> <td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Si-Matシリコン材料</td><td></td><td>タイプ:P /ホウ素;オリエンテーション <111>オン;成長方法:CZ;抵抗率:1-30オーム/ cm;表面:ポリッシュ。7 x7 mmでレーザーカット</td></tr><tr><td>クライオピン</td><td>バルト海の準備</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤードループ「パーフェクトループ」</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンストライプ</td><td>ピコデント</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#G8270</td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#G7141</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>β-メルカプトエチルアミン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td> <td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG Jackson</td><td>Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Switzerland</td><td>#</td>10236276001 <td></td></tr><tr><td>Glycerolソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底ペトリ皿</td><td>イビディ、ドイツ</td><td>u-Dish 35mm、高ガラス底、#81158</td><td></td></tr><tr><td>SEM アルミニウム スタブ</td><td>寒天科学</td> <td>#G301F</td><td></td></tr><tr><td>導電性炭素セメント Leit-C</td><td>Plano、ドイツ</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ(クライオ免疫)</td><td>ジアトーム</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>クライオウルトラミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>ライカEM FCS</td><td></td></tr><tr><td>広視野TIRF顕微鏡 GSD ライカSR GSD 3D</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1.43 TIRF 対物レンズ</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>SEM - ツァイス スープラ 50 VP</td><td>ツァイス</td><td>スープラ 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - ツァイス アウリガ 40</td><td>ツァイ</td>ス <td>アウリガ 40</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

超解像光学顕微鏡を組み合わせると、走査電子顕微鏡幼虫ゼブラフィッシュの網膜の細胞内蛋白質のローカリゼーションを調査する手法を提案します。超解像光顕微鏡のサブ回折限界の解像度機能により、相関データの精度を向上させます。簡単に、110 ナノメートル、分厚い低温部分はシリコン ・ ウエハに転送され、蛍光染色後の超解像光学顕微鏡検査によってされます。その後、セクションは、セルロースとプラチナの走査型電子顕微鏡 (SEM) でのイメージングの前にシャドウに保持されます。これらの 2 つの顕微鏡のモダリティから画像は、組織のランドマークを用いたオープン ソース ソフトウェアを簡単にマージされます。ここで幼虫のゼブラフィッシュの網膜の適応方法をについて説明します。ただし、このメソッドはティッシュおよび有機体の他のタイプに適用も。この相関関係によって得られる補足情報が膜とミトコンドリア蛋白質の発現と細胞の他のコンパートメントとしてもミトコンドリアのクリステを解決することができることを示します。

Tom20 translocase ミトコンドリア外膜複雑な20のサブユニット蛋白の発現はゼブラフィッシュ稚魚網膜の薄い部分で超解像光学顕微鏡検査 (図 1) によって決定された、この情報は同じセクションのプラチナ シャドウ後走査電子顕微鏡観察によって得られた地形の信号を補完します。これらの相関データ ミトコンドリア膜の特定区画との関連付けの蛋白質の局在を確認し、さらにセルの他の細胞器官とタンパク質の関係についての情報を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
図 1: ゼブラフィッシュの網膜にクレム。A.低倍率広視野画像 5 dpf ゼブラフィッシュ網膜セクション、核染色 DAPI (シアン) の。B.は、同じ領域の電子顕微鏡。C. B. 核内のフレームの高倍率広視野画像染色 DAPI (シアン) と Tom20 ミトコンドリア染色が赤で表示されます。D.高倍率で同じセクションの広視野画像。Tom20 式のパターンは、ミトコンドリアのクラスターです。E.式の Tom20 (赤い点) GSDIM 顕微鏡による検出します。核染色 DAPI (水色)。F.電子相関の超解像を組み合わせると、走査電子顕微鏡と同じセクション。Tom20 染色 (赤い点) は、ミトコンドリアの外膜で、ミトコンドリアのクラスター (M) に表示されます。(N) の核の蛍光 DAPI 信号は、SEM 像の地形に対応します。G. f. でフレームの高倍率画像スキャンの電子顕微鏡画像は、GSDIM イメージ (赤い点) にコンテキストを提供します。ミトコンドリアのクリステがはっきり見えると Tom20 の染色は、ミトコンドリア外膜にローカライズします。外側のセグメントの膜光受容体 (OS) は、明確に解決されます。イメージのピクセル サイズは 5 海里にあります。スケール バー: A、B、および c: 10 μ mD: 2 μ m;E と f: 1 μ m と g: 0.2 μ m<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1: 光顕および電顕画像の配置。A. SEM 像と異なる核に沿って番号ランドマーク (黄色) TrackEM2 インタ フェースのスクリーン ショット。B. 蛍光画像と異なる DAPI に沿って番号ランドマーク (イエロー) TrackEM2 インターフェイスからのスクリーン ショットが核を染色します。レイヤーの透明度を変更するには、メニューの左上の部分のスライダーを使用できます。スケール バー: 1 μ m.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。

このプロトコルでは、相関超解像光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡像によるゼブラフィッシュの網膜の細胞内タンパク質局在結果を取得する必要な手順について説明します。

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

この顕微鏡法の全体的な目標は、超解像と走査型電子顕微鏡画像を相関させることにより、ゼブラフィッシュの幼虫網膜のさまざまな細胞内小器官に関連するタンパク質発現を正確に位置させることです。この方法は、変異体におけるタンパク質のミスローカリゼーションの研究など、網膜発生および細胞経路の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、超解像と走査型電子顕微鏡を組み合わせて、サンプルの構造的状況内で高精度のタンパク質局在データを取得できることです。シリコーンウェーハ上のトクヤス切片の収集は、取り扱いを大幅に容易にし、コントラストのために白金シャドーイングを使用することで、サンプルの良好なトポグラフィーを提供します。したがって、この方法は、ゼブラフィッシュの幼虫の網膜研究への洞察を提供することができます。その大きな利点の1つは、マウス組織におけるタンパク質発現の同定など、他の多くの生物学的システムにも適用できることです。テキストプロトコルに従って固定されたゼブラフィッシュの幼生から目を解剖した後、15ミリリットルの12%地元の食品ブランドのゼラチンをPBSで摂氏40度で温めます。次に、目のチューブからPBSを吸引し、ゼラチン溶液を追加します。チューブを軽くたたいてゼラチンがサンプルに浸透することを確認し、穏やかに振とうしながらサーモブロック内で摂氏40度で10〜30分間インキュベートするか、水浴でインキュベートします。摂氏40度の水浴で、12 x 5 x 3ミリメートルのシリコーンまたはポリエチレンの平らな埋め込み型に温かいゼラチンを充填します。次に、ピペットを使用して金型ごとに2つの目を追加し、双眼鏡の下で解剖針を使用してそれらを適切に位置合わせします。ゼラチンを室温で1分間冷ました後、摂氏4度で20分間置いて固めます。双眼鏡の下で、かみそりの刃を使用してゼラチンブロックを再トリミングし、ブロックごとに1つの目に収まるようにします。ゼラチンに埋め込まれた目を氷上のPBS中の2.3モルスクロースに移します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、サンプルを新鮮な2.3モルのスクロース溶液に交換します。そして、ティッシュは摂氏4度、または摂氏マイナス20度で保管し、最大数か月保管します。ゼラチンブロックをクライオピンに移す前に、ほぼ目のサイズまで再トリミングします。次に、ブロックを液体窒素で凍結し、クライオウルトラミクロトームに移します。クライオウルトラミクロトームにダイヤモンドナイフを使用し、厚さ110ナノメートルの切片をマイナス120°Cで切断しました。2%メチルセルロースと2.3モルのスクロース溶液の液滴を含むワイヤードループのあるセクションを選択します。次に、切片を7 x 7 mmのシリコンウェーハに移します。ウェーハを洗浄するには、4滴をピペットで固定し、ウェーハを逆さまにして液滴の上に置きます。液滴上のウェーハを摂氏0度で20分間インキュベートします。次に、ウェーハをPBSで室温で2回、それぞれ2分間洗浄します。サンプルをPBS中の0.15%グリシンでそれぞれ1分間3回インキュベートします。次に、PBSを使用して、1回の洗浄につき1分間、サンプルを3回洗浄します。組織をPBGで5分間事前にインキュベートします。次に、PBGのウサギ抗Tom20をセクションに追加します。そして、ウェーハを室温で30分間インキュベートします。PBGでは、ティッシュペーパーを1回の洗浄につき1分間6回洗浄します。次に、サンプルをPBGと室温で5分間事前にインキュベートします。PBGをPBG中のAlexa 647抗ウサギ二価Fabフラグメントに交換し、30分間インキュベートします。サンプルをPBGで6回、1回の洗浄につき1分間洗浄します。次に、PBSを使用してウェーハを2分間3回洗浄します。ウェーハにDAPIとPBSを添加し、10秒間インキュベートします。次に、PBSを使用してサンプルを2回、それぞれ2分間洗浄します。80%グリセロールの1対1溶液と酸素捕捉システムを含むイメージングバッファーの液滴上にウェーハを置き、短時間インキュベートします。ウェーハをティッシュ面を下にして、ガラス底のペトリ皿に80%グリセロールとイメージングバッファーの1対1の混合物を新たに滴下します。ピペットを四方から使用して、ウェーハの下の液体の大部分を取り除きます。次に、シリコンストライプを使用して、ウェーハをペトリ皿の底に固定します。取り付けられたセクションを、高開口数油浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡に置きます。イメージングの前に、サンプルを顕微鏡の温度に平衡化させて、横方向および軸方向のドリフトを最小化または低減します。対象領域を中央に配置し、広視野落射蛍光参照画像を取得します。超解像動作モードに切り替えます。カメラの露光時間を15ミリ秒に調整し、電子増倍ゲインを最大300に設定します。次に、落射蛍光モードでサンプルを642ナノメートルレーザーで最大のレーザー出力で照らします。各フレームで単一分子の点滅が十分に分離され、個々の信号が重なる確率が低くなったらすぐに、レーザー出力をほぼ1/3に下げます。生の画像を落射蛍光で記録するには、最低 30 、 000 フレームを取得します。生データから、[ツール] で t-Series Analysis は 30 フォトンの検出しきい値を使用します。「評価」をクリックして、ローカリゼーション・イベント・リストを生成します。[ツール] の [イベントリスト処理] パネルで [イメージの作成] をクリックし、4 ナノメートルのレンダリング ピクセル サイズを適用して、ガウス近似によって超解像イメージを視覚化します。シリコンストライプを取り外し、ウェーハの端の近くにPBSを一滴追加して、ペトリ皿から持ち上げます。PBSを使用してウェーハを2回、各2分間洗浄した後、PBS中の0.1%グルタルアルデヒドを使用して5分間後固定します。次に、サンプルをPBSで1回の洗浄につき2分間、再度2回洗浄します。ウェーハを氷上の水に2%メチルセルロース1滴で1滴、インキュベーションごとに5分間インキュベートします。次に、ウェーハを遠心分離チューブに挿入し、14、100倍gで90秒間遠心分離します。スピン後、導電性カーボンセメントを使用してウェーハをSEMアルミニウムスタブに取り付けます。電子線蒸着装置を用いて、試料上に2ナノメートルから10ナノメートルの白金炭素の層を、以下の設定でロータリーシャドーイングにより追加します。1.5キロボルトの走査型電子顕微鏡、2ミリメートルの作動距離、およびレンズ内二次電子検出器を使用した画像セクション。フィジーを使用して、ファイル、開くをクリックして、光学顕微鏡画像と電子顕微鏡画像の両方を開きます。キャンバスサイズを調整するには、[画像]、[調整]、[キャンバスサイズ]の順にクリックします。次に、[イメージ]、[スタック]、[スタックするイメージ]の順にクリックして、両方のイメージをスタックに持ち込みます。フィジーで、[ファイル]、[新規]、[EM2 新規トラック] の順にクリックして、新しいトラック EM2 インターフェイスを開きます。黒いウィンドウを右クリックして[スタックのインポート]を選択し、両方の画像を含むスタックをインポートします。画像を右クリックして[整列]、[画層をランドマークと手動で整列]の順に選択して、光学顕微鏡画像をランドマーク付きの電子顕微鏡画像に手動で位置合わせします。[選択] ツールを選択して、ランドマークを追加します。原子核の形状を基準にして、両方の画像で同じエッジを選択し、複数の点を追加します。アフィン モデルとのアラインメントを適用するには、右クリックして [Apply transform]、[Affine Model] の順に選択します。最後に、レイヤーの透過表示を変更して、配置の品質を評価します。このパネルは、受精後5日間のゼブラフィッシュ網膜切片の低倍率広視野画像を示しています。同じ領域を走査型電子顕微鏡で示します。これらの高倍率の画像は、ミトコンドリアにクラスターを持つTom20が赤く染色されていることを示しています。ここでは、GSDIM顕微鏡で検出されたTom20の発現を示しています。この画像では、同じセクションが相関超解像顕微鏡と走査型電子顕微鏡を組み合わせたものです。Tom20染色は、ミトコンドリアの外膜のミトコンドリアクラスター内に現れます。核内の蛍光DAPIシグナルは、SEM画像のトポグラフィーに対応しています。このSEM画像は、GSDIM画像のTom20染色のコンテキストを提供します。ミトコンドリアクリステははっきりと見え、Tom20染色はミトコンドリアの外膜に局在しています。光受容体の外側セグメントの膜は明確に分離されています。この手順を試行する際は、ラベリングとイメージングのパラメータを可能な限り最適化することを忘れないようにすることが重要です。最適に標識されたサンプルのみが超解像に適しています。ラベリング手順中は、サンプルを乾燥させないでください。この手順は、二重標識免疫蛍光法に拡張することができ、したがって、特定の構造内の2つの異なるタンパク質の局在化を可能にすることができます。より複雑なサンプルの場合は、画像の正確な位置合わせを得るために、基準マーカーの使用をお勧めします。このビデオを見れば、複雑な組織サンプル中の細胞のさまざまなオルガネラに関連するタンパク質の局在化を超解像精度で行うための相関研究を行う方法について、十分に理解できるはずです。

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