ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

このプロトコルでは、相関超解像光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡像によるゼブラフィッシュの網膜の細胞内タンパク質局在結果を取得する必要な手順について説明します。

この顕微鏡法の全体的な目標は、超解像と走査型電子顕微鏡画像を相関させることにより、ゼブラフィッシュの幼虫網膜のさまざまな細胞内小器官に関連するタンパク質発現を正確に位置させることです。この方法は、変異体におけるタンパク質のミスローカリゼーションの研究など、網膜発生および細胞経路の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、超解像と走査型電子顕微鏡を組み合わせて、サンプルの構造的状況内で高精度のタンパク質局在データを取得できることです。

シリコーンウェーハ上のトクヤス切片の収集は、取り扱いを大幅に容易にし、コントラストのために白金シャドーイングを使用することで、サンプルの良好なトポグラフィーを提供します。したがって、この方法は、ゼブラフィッシュの幼虫の網膜研究への洞察を提供することができます。その大きな利点の1つは、マウス組織におけるタンパク質発現の同定など、他の多くの生物学的システムにも適用できることです。

テキストプロトコルに従って固定されたゼブラフィッシュの幼生から目を解剖した後、15ミリリットルの12%地元の食品ブランドのゼラチンをPBSで摂氏40度で温めます。次に、目のチューブからPBSを吸引し、ゼラチン溶液を追加します。チューブを軽くたたいてゼラチンがサンプルに浸透することを確認し、穏やかに振とうしながらサーモブロック内で摂氏40度で10〜30分間インキュベートするか、水浴でインキュベー

摂氏40度の水浴で、12 x 5 x 3ミリメートルのシリコーンまたはポリエチレンの平らな埋め込み型に温かいゼラチンを充填します。次に、ピペットを使用して金型ごとに2つの目を追加し、双眼鏡の下で解剖針を使用してそれらを適切に位置合わせします。ゼラチンを室温で1分間冷ました後、摂氏4度で20分間置いて固めます。

双眼鏡の下で、かみそりの刃を使用してゼラチンブロックを再トリミングし、ブロックごとに1つの目に収まるようにします。ゼラチンに埋め込まれた目を氷上のPBS中の2.3モルスクロースに移します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。

次に、サンプルを新鮮な2.3モルのスクロース溶液に交換します。そして、ティッシュは摂氏4度、または摂氏マイナス20度で保管し、最大数か月保管します。ゼラチンブロックをクライオピンに移す前に、ほぼ目のサイズまで再トリミングします。

次に、ブロックを液体窒素で凍結し、クライオウルトラミクロトームに移します。クライオウルトラミクロトームにダイヤモンドナイフを使用し、厚さ110ナノメートルの切片をマイナス120°Cで切断しました。2%メチルセルロースと2.3モルのスクロース溶液の液滴を含むワイヤードループのあるセクションを選択します。

次に、切片を7 x 7 mmのシリコンウェーハに移します。ウェーハを洗浄するには、4滴をピペットで固定し、ウェーハを逆さまにして液滴の上に置きます。液滴上のウェーハを摂氏0度で20分間インキュベートします。

次に、ウェーハをPBSで室温で2回、それぞれ2分間洗浄します。サンプルをPBS中の0.15%グリシンでそれぞれ1分間3回インキュベートします。次に、PBSを使用して、1回の洗浄につき1分間、サンプルを3回洗浄します。

組織をPBGで5分間事前にインキュベートします。次に、PBGのウサギ抗Tom20をセクションに追加します。そして、ウェーハを室温で30分間インキュベートします。

PBGでは、ティッシュペーパーを1回の洗浄につき1分間6回洗浄します。次に、サンプルをPBGと室温で5分間事前にインキュベートします。PBGをPBG中のAlexa 647抗ウサギ二価Fabフラグメントに交換し、30分間インキュベートします。

サンプルをPBGで6回、1回の洗浄につき1分間洗浄します。次に、PBSを使用してウェーハを2分間3回洗浄します。ウェーハにDAPIとPBSを添加し、10秒間インキュベートします。

次に、PBSを使用してサンプルを2回、それぞれ2分間洗浄します。80%グリセロールの1対1溶液と酸素捕捉システムを含むイメージングバッファーの液滴上にウェーハを置き、短時間インキュベートします。ウェーハをティッシュ面を下にして、ガラス底のペトリ皿に80%グリセロールとイメージングバッファーの1対1の混合物を新たに滴

ピペットを四方から使用して、ウェーハの下の液体の大部分を取り除きます。次に、シリコンストライプを使用して、ウェーハをペトリ皿の底に固定します。取り付けられたセクションを、高開口数油浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡に置きます。

イメージングの前に、サンプルを顕微鏡の温度に平衡化させて、横方向および軸方向のドリフトを最小化または低減します。対象領域を中央に配置し、広視野落射蛍光参照画像を取得します。超解像動作モードに切り替えます。

カメラの露光時間を15ミリ秒に調整し、電子増倍ゲインを最大300に設定します。次に、落射蛍光モードでサンプルを642ナノメートルレーザーで最大のレーザー出力で照らします。各フレームで単一分子の点滅が十分に分離され、個々の信号が重なる確率が低くなったらすぐに、レーザー出力をほぼ1/3に下げます。

生の画像を落射蛍光で記録するには、最低 30 、 000 フレームを取得します。生データから、[ツール] で t-Series Analysis は 30 フォトンの検出しきい値を使用します。「評価」をクリックして、ローカリゼーション・イベント・リストを生成します。

[ツール] の [イベントリスト処理] パネルで [イメージの作成] をクリックし、4 ナノメートルのレンダリング ピクセル サイズを適用して、ガウス近似によって超解像イメージを視覚化します。シリコンストライプを取り外し、ウェーハの端の近くにPBSを一滴追加して、ペトリ皿から持ち上げます。PBSを使用してウェーハを2回、各2分間洗浄した後、PBS中の0.1%グルタルアルデヒドを使用して5分間後固定します。

次に、サンプルをPBSで1回の洗浄につき2分間、再度2回洗浄します。ウェーハを氷上の水に2%メチルセルロース1滴で1滴、インキュベーションごとに5分間インキュベートします。次に、ウェーハを遠心分離チューブに挿入し、14、100倍gで90秒間遠心分離します。

スピン後、導電性カーボンセメントを使用してウェーハをSEMアルミニウムスタブに取り付けます。電子線蒸着装置を用いて、試料上に2ナノメートルから10ナノメートルの白金炭素の層を、以下の設定でロータリーシャドーイングにより追加します。1.5キロボルトの走査型電子顕微鏡、2ミリメートルの作動距離、およびレンズ内二次電子検出器を使用した画像セクション。

フィジーを使用して、ファイル、開くをクリックして、光学顕微鏡画像と電子顕微鏡画像の両方を開きます。キャンバスサイズを調整するには、[画像]、[調整]、[キャンバスサイズ]の順にクリックします。次に、[イメージ]、[スタック]、[スタックするイメージ]の順にクリックして、両方のイメージをスタックに持ち込みます。

フィジーで、[ファイル]、[新規]、[EM2 新規トラック] の順にクリックして、新しいトラック EM2 インターフェイスを開きます。黒いウィンドウを右クリックして[スタックのインポート]を選択し、両方の画像を含むスタックをインポートします。画像を右クリックして[整列]、[画層をランドマークと手動で整列]の順に選択して、光学顕微鏡画像をランドマーク付きの電子顕微鏡画像に手動で位置合わせします。

[選択] ツールを選択して、ランドマークを追加します。原子核の形状を基準にして、両方の画像で同じエッジを選択し、複数の点を追加します。アフィン モデルとのアラインメントを適用するには、右クリックして [Apply transform]、[Affine Model] の順に選択します。

最後に、レイヤーの透過表示を変更して、配置の品質を評価します。このパネルは、受精後5日間のゼブラフィッシュ網膜切片の低倍率広視野画像を示しています。同じ領域を走査型電子顕微鏡で示します。

これらの高倍率の画像は、ミトコンドリアにクラスターを持つTom20が赤く染色されていることを示しています。ここでは、GSDIM顕微鏡で検出されたTom20の発現を示しています。この画像では、同じセクションが相関超解像顕微鏡と走査型電子顕微鏡を組み合わせたものです。

Tom20染色は、ミトコンドリアの外膜のミトコンドリアクラスター内に現れます。核内の蛍光DAPIシグナルは、SEM画像のトポグラフィーに対応しています。このSEM画像は、GSDIM画像のTom20染色のコンテキストを提供します。

ミトコンドリアクリステははっきりと見え、Tom20染色はミトコンドリアの外膜に局在しています。光受容体の外側セグメントの膜は明確に分離されています。この手順を試行する際は、ラベリングとイメージングのパラメータを可能な限り最適化することを忘れないようにすることが重要です。

最適に標識されたサンプルのみが超解像に適しています。ラベリング手順中は、サンプルを乾燥させないでください。この手順は、二重標識免疫蛍光法に拡張することができ、したがって、特定の構造内の2つの異なるタンパク質の局在化を可能にすることができます。

より複雑なサンプルの場合は、画像の正確な位置合わせを得るために、基準マーカーの使用をお勧めします。このビデオを見れば、複雑な組織サンプル中の細胞のさまざまなオルガネラに関連するタンパク質の局在化を超解像精度で行うための相関研究を行う方法について、十分に理解できるはずです。