健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

この大規模な電子顕微鏡法またはナノトミー実験の全体的な目標は、高分子レベルから組織レベルへの交代を定義することです。これは、今日のケースでは、退化したゼブラフィッシュの脳における変化を定義することです。ナノトミーは、ライフサイエンスにおける重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、神経変性や1型糖尿病の研究などです。

ナノトミーの主な利点は、高分子、オルガネラ、細胞、組織に至るまで、偏りのない情報が得られることです。これにより、定量と nanotomy.org によるオープンアクセスのデータ共有が可能になります。ナノトミーは、ゼブラフィッシュの神経変性脳における免疫維持とミクログリアに関する洞察を提供しますが、細胞培養、マウス、さらにはヒト組織など、他の疾患モデルにも適用されています。

一般的に、この手法に不慣れな科学者は、データ量が圧倒的であるため、苦労します。これは、従来のEMで得られるものの1000倍にもなります。テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュの幼生を固定した後、オスミウムの浸透を促進するために、幼虫の頭を後脳に向けて吻側に切ります。幼虫を1%四酸化オスミウム、1.5%フェロシアン化カリウム、0.1モルのカコジル酸ナトリウムに入れ、氷上で2時間インキュベートします。

次に、二重蒸留水を使用して、胚を毎回5分間3回すすぎます。包埋する前に、サンプルを一連のエタノールで脱水する必要があります。胚を埋め込むには、テキストプロトコルに従って希釈したエポキシ樹脂で一晩インキュベートした後、希釈した樹脂を取り除き、純粋な樹脂を使用して交換します。

30分間インキュベートした後、2回目に樹脂を交換してさらに30分間インキュベートします。樹脂を3回目にリフレッシュした後、室温で3時間インキュベートします。その後、摂氏58度で15分間インキュベートします。

最後に、室温で低圧で1時間インキュベートします。次に、解剖顕微鏡下で、針またはつまようじを使用して、市販のシリコンフラット埋め込み型でヘッドの向きを合わせます。次に、エポキシ樹脂を摂氏58度で一晩重合します。

試料が完全に硬化したら、カミソリの刃を使用してスタブから余分な樹脂を切り取ります。正しい位置を検出するには、ガラスナイフまたはダイヤモンドヒストナイフをウルトラミクロトームで使用して、トルイジンブルー/塩基性フクシンの半薄幼虫切片を切断します。半薄切片をガラス製のパスツールピペットで持ち上げ、先端を炎で溶かして閉じて、顕微鏡のスライドに移します。

ホットプレートで水がなくなるまで乾かします。次に、サンプルを1%トルイジンブルーに水に浸し、ホットプレート上で切片を10秒間インキュベートして染色します。次に、水を使用して切片をすすぎた後、1%四ホウ酸ナトリウム中の05%塩基性フクシンを使用して、サンプルをさらに10秒間染色します。

通常の光学顕微鏡を10倍から40倍にして、サンプルを検査します。適切な部位または向きに到達したら、嗅孔、目、灰白質境界など、簡単に識別できる解剖学的構造を使用して、極薄切片化中の脳領域を特定し、サンプルを傾けたときの切片化角度を調整します。さらにエポキシ樹脂ブロックをダイヤモンドナイフで切片化し、70ナノメートルの極薄切片を切断します。

各セクションを1つのスロットL2 x 1フォームのバーコード付き銅グリッドに取り付けて、グリッドバーに邪魔されずに取得できるようにします。平方ミリメートルは小さく見えるかもしれません。開口部にちょうど収まります。

このようにして、グリッドバーがサンプルをブロックするのを防ぎます。サンプルに導入されたすべてのアーティファクトは、従来のEMと比較して記録されることを認識してください。テキストプロトコルに従ってサンプルを重金属と対比し、グリッドボックスに保管します。サンプルを走査型電子顕微鏡(SEM)に取り付けるには、トランスファーボックスからグリッドをセクションと一緒にマルチグリッドサンプルホルダーに配置し、SEMのチャンバーに移します。

テキストプロトコルに従って検出器を位置合わせした後、スキャンする領域全体が画像ウィンドウに収まるようにズームアウトしてサンプルに事前に照射します。絞りを120マイクロメートルに変更し、画像の焦点をぼかしたら、縮小領域スキャンオプションを使用して、スキャン領域をできるだけタイトにします。次に、フレームを約1〜2秒でスキャンするようにフレームレートを設定します。

次に、少なくとも100倍ズームインし、小さな領域を10秒間スキャンします。それでもその領域の明るさが変化する場合は、事前照射を続けます。この領域が周囲に比べて明るさが変わらない場合は、事前照射で十分です。

ピントが合っている間に、最も明るい領域または特徴を選択し、詳細が見えるようにスキャン速度を設定します。顕微鏡ソフトウェアでは、ヒストグラムを注意深く観察して明るさとコントラストを調整し、すべてのピクセルをダイナミックレンジに保ちます。最も暗い領域と機能についても同じことを行います。

明るい領域に戻り、ヒストグラムの両側にスペースがあるかもう一度確認してください。ステップ4、6、4、8では、明るさとコントラストの調整を非常に慎重に行い、全領域がダイナミックレンジ内に収まるようにする必要があります。スキャンする領域全体が想像ウィンドウに収まるようにズームアウトし、大領域取得プログラムを開始します。

次に、ウィザードオプションを使用して、画面から領域を選択してモザイクを設定します。必要な詳細に応じて2〜5ナノメートルのピクセルサイズを使用し、走査型透過型電子顕微鏡(STEM)の滞留時間を3マイクロ秒に設定します。optimize(最適化)を押して顕微鏡の設定を確認すると、所要時間が表示されます。

次に、外部スキャンジェネレータを再度オンにして、[続行]を押します。STEMデータを分析するには、大規模なEMファイルビューアプログラムを開き、モザイク情報と呼ばれるファイルを開くと、タイル化されたtifファイルが開きます。「モザイク全体を自動ステッチする」オプションを選択し、次のパラメータを選択します:オーバーラップモードは半分、ステッチしきい値は0.90、ノイズリダクションは自動です。

ステッチ条件が満たされない場合は、ズームインしてタイルを所定の位置に手動で配置し、[そのまま続行]をクリックします。データをHTMLファイルまたは単一のtifとしてエクスポートします。最終的なピクセルサイズとファイル名を含めて、後で測定を有効にし、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。ここに示すように、制御脳切片のナノトミーは、嗅線維束、ニューロン核、シナプスを含むニューロンサブコンパートメントを含む吻側前脳の神経組織の典型的な超微細構造的特徴を明らかにします。

ここで、細胞内構造には、ゴルジ装置、小胞体、ミトコンドリア、シナプス小胞、シナプス後密度など、さまざまな細胞タイプやオルガネラのさまざまな核形態と病巣が含まれます。意外なことに、心室の内側を覆う細胞の核は、脳内でより横方向に分散している他の細胞と比較して、非常に電子密度が高いです。ミクログリアでは、核は脳内の他の細胞には存在しない暗い病巣、おそらくヘテロクロマチンも示します。

この画像は、ニューロンアブレーションを受けているゼブラフィッシュの幼生の冠状切片の大規模なEMから得られたもので、食作用性ミクログリアが明らかになりました。哺乳類細胞のミクログリアに特徴的な特徴は、著名なゴルジ装置やリソソームなどの多数の封入体を含むこれらの細胞にも見られました。一度習得すれば、従来のEMでは少なくとも1週間かかるところを、習得は1日で完了します。

この手順を試みる際には、顕微鏡のオペレーターが高品質の画像を取得するために重要な役割を果たすことが重要です。これは、単にボタンを押すだけのテクニックではありません。私たちは現在、ナノトミーをゼブラフィッシュの神経変性のモデルに適用しただけでなく、細胞の免疫標識やハエの組織、ヒト組織などの研究にも使用しています。

この手法は、あらゆる分野の研究者に道を開きます。nanotomy.org でデータセットをオンラインで再確認することができます。その後、ナノメートルからミリメートルスケールまでの推定上の変化と、研究されたすべてのモデルを調べることができます。

このビデオを見た後、ナノトミーを研究課題に適用する方法と、調査している細胞または組織系について十分に理解しているはずです。忘れてはいけないのは、有毒な試薬と倫理的な配慮のためにサンプル調製を行うのは専門家だけですが、誰でもウェブサイトのナノトミーを試すことができます。自宅で組織。