Name: マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶマイクロレーザー照射による哺乳類細胞のDNA二重鎖切断誘導と修復タンパク質の動態解析。共焦点顕微鏡を用いたリアルタイム可視化で、XRCC1-GFPなどの修復因子の動員と保持メカニズムを解明する。

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著者は、博士サミュエル ・ h ・ ウィルソンで、国立環境衛生研究所この作業で使用する細胞のために感謝したいと思います。

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+near+infrared+femtosecond+lasers+as+sub-micron+radiation+microbeam+for+cell+DNA+damage+and+repair+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies.</a> Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Front Genet. 4, 135(2013).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Werner+protein+at+DNA+double-strand+breaks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells.</a> J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).</li>
<li>Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+oxidative+stress-induced+DNA+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">DNA single-strand break repair.</a> Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).</li>
<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
<li>Cooke, M. S., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooke%2C+MS+%22Immunochemical+detection+of+oxidative+DNA+damage.+Vol.+I%22">Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I</a>. , World Scientific. 275-293 (2003).</li>
<li>Rossner, P., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+oxidatively+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).</li>
<li>Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).</li>
<li>Rybak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+phosphorylation+of+histone+H2AX+on+serine+139+%28%CE%B3H2AX%29+is+not+associated+with+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks.</a> Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).</li>
<li>Haince, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+kinetics+of+recruitment+of+MRE11+and+NBS1+proteins+to+multiple+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.</a> J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+break+repair+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-strand break repair and genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).</li>
<li>Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+aspects+of+clustered+DNA+damage+induction+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation.</a> Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).</li>
<li>Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylation+base+damage+is+converted+into+repairable+double-strand+breaks+and+complex+intermediates+in+G2+cells+lacking+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease.</a> PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).</li>
<li>Siddiqi, M. A., Bothe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+double-strand+break+formation+in+DNA+irradiated+in+aqueous+solution%3A+dependence+on+dose+and+OH+radical+scavenger+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration.</a> Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).</li>
<li>Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+laser+inactivation--towards+a+spatiotemporal-functional+analysis+of+proteins%2C+and+the+ablation+of+chromatin%2C+organelle+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.</a> J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biol. 2, 368-376 (2014).</li>
</ol>

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ここで説明されている条件を使用して、UV A または 405 nm のレーザー、または製造元によって統合されたエンド ・ ユーザーによって追加された共焦点顕微鏡することができます細胞の核内の DNA 損傷を誘発して DNA 修復タンパク質のサイトに募集を許可します。監視対象となる DNA 損傷を誘発します。ただし、プロトコルおよび代表的な結果、波長選択でない限り力を適用、すべて修復経路の特定の DNA を研究するためにユーザーが最初に対処しなければならない問題の重要な特性です。また、ユーザーによっても考慮する必要があります実験のデザインでその他の考慮事項があります。
生きているセルの記事でタンパク質の挙動を監視するために, マイクロ照射蛍光に分類された蛋白質を作らなければなりません。スペクトルに分けることができる蛍光蛋白質の広い範囲の可用性では、DNA 損傷の誘発細胞応答を特徴づけるために使用ことができます蛋白質の融合を作成するためのツールを提供しています。興味の蛍光タンパク質のトランスフェクションにより有害な条件や突然変異も阻害剤の迅速なスクリーニングのため固定して transfected セルを提供しながら表現のレベルの詳細に制御、他の生化学は、実行される特徴マイクロ照射の結果を検証します。波長の異なる蛍光蛋白質は蛋白質同じ経路内または異なる経路間の相互作用を監視する同じセルにも利用できます。蛍光タンパク質はまた興味の各蛋白質のための特定の抗体のための必要性を排除し、生細胞は損傷の誘導の後の時間の長い期間のため蛋白質の動作の監視を許可します。
ただし、蛍光タンパク質の使用にも欠点があります。興味の蛋白の欠損遺伝的背景なし蛍光付けられた蛋白質と内因性のタンパク質を競います。蛍光タンパク質の N または C 末端タグの活用がタンパク質の折り畳みを変更、キーの蛋白質蛋白質の相互作用を妨げるまたは転信号をブロック関数の変更および募集のダイナミクスに影響を与える可能性があります。これらの効果は、免疫蛍光染色, 劇的に異なる募集被害サイト28で内因性のタンパク質の保持時間レポートの数で実証されています。トランスフェクションや安定したクローンの使用もタンパク質発現レベルの変動を通して、通常観察応答を変更できます。さらに、単一の実験で複数の蛍光タンパク質の使用可能性がありますものダイナミクスを変更募集、蛋白質のレベルがよく平衡ない場合、または大きな蛍光タグ付きタンパク質の募集ブロック他の蛋白質の募集.最後に、弱い感作性剤、活性酸素種の形成の増加と潜在的 DNA 損傷の混合物誘導46,47を変更として蛍光タンパクを使用できます。これらの欠点にもかかわらず、蛍光蛋白質提供勉強 DNA の明確な利点の数マイクロ照射の修復し、新しい洞察力を提供することができますユーザーは、ここで説明の損傷評価などの適切なコントロールを組み込む場合応答および蛋白質蛋白質の相互作用3を損傷します。
ライブセル イメージングが必要ない場合、蛍光は損傷への応答を監視する使用できます。特定のタイミングでセルを固定することによって損傷誘導と染色抗体タンパク質とタンパク質を構築することができます修理の保持および興味、損傷誘導の静的なスナップショットと募集の病変のために特定を記事します。抗体を使用して利率や翻訳後修飾 DNA 損傷応答による複数のタンパク質の募集を監視することができます。蛍光抗体法の使用は蛍光タンパク質の必要性を排除、調査する内因性のタンパク質の動作できます。ただし、この方法にも欠点があります。特異性の高い抗体が必要で、透過と遮断手順十分な信号強度と募集の検出を実現するように最適化する必要があります。固定プロシージャは瞬時にない、この物理的な制約は、このアプローチの時間分解能を制限します。細胞は染色後再配置することができます損傷誘導サイトのマッピングも重要な課題が生じます。この作業で使用する共焦点顕微鏡でき画像レジストレーションのため前述のように、損傷した細胞を高精度に移動できます。損傷誘導とイメージの募集と固有の遅延と相まって、ステージ登録せず移転細胞が蛍光抗体法をすることができるステージ登録またはエッチング coverglass が利用できない場合、投資に関与します。一部のユーザーに魅力がないです。しかし、最も正確かつ完全なマイクロ照射実験デザインは提案するプロトコルで説明するよう蛍光タンパク質の使用と並行してアプローチのこれらのタイプを組み込む予定します。
ここでは、ライブセル イメージングと蛍光抗体法、マイクロ レーザーの有用性を検証する使用されます。免疫蛍光染色により作成された DNA 損傷の混合物を正確に調べると方ができる各レーザによる蛋白質の募集募集と XRCC1 GFP の保持の観察された変化を解釈します。これらの結果に基づき、405 nm レーザーの使用は BER と SSBR タンパク質の検査のため限られたする必要があります。さらに、最適な実験的なデザインには、目的、使用すると、セルの行ごとに完全混合特性および募集の検証後パワー測定が含まれます、蛍光で観察された保持タグが付いている蛋白質蛍光抗体法。明らかに、設備、時間、およびコストに関する考慮事項不可能になるこれらの最適な実験設計一部のユーザー。これらの各要素の重要性を紹介し、ユーザーする必要がありますこれらの考慮事項場合覚えておいてマイクロ照射実験を開始します。

蛍光顕微鏡は、細胞アーキテクチャを視覚化、タンパク質の局在を調べるし、タンパク質間、タンパク質-DNA 間相互作用をモニターする技術として浮上しています。蛍光顕微鏡を使用してグローバル DNA 損傷物質、紫外線 (UV) などのアプリケーションの後の DNA 損傷応答機構を研究する電離放射線、化学酸化、アルキル化剤や化学療法を提供して新しい洞察開始、伝達と DNA の募集 DNA 損傷1,2のサイトにタンパク質を修復します。ただし、これらのグローバルおよび非同期イベントの損傷を制限するが場合募集注文、協会または解離反応速度論に関する詳細情報とキー DNA 修理蛋白質間の関係が求められています。幸いなことに、レーザ走査型共焦点顕微鏡の進歩によって、損傷を誘発するレーザー波長と過去の 25 年にわたって蛍光タンパク質の改善のより広範な可用性の提供している強化されたツールと研究者を知ることDNA の修復、ターゲット DNA 損傷誘発。
細胞と細胞の機能を研究するためにレーザー マイクロビームを用いた細胞照射は細胞と放射線生物学3の老舗ツールです。この手法の DNA 修復の研究への応用現れたクレーマーと同僚を使用非常に焦点を当てて UV (257 nm) 0.5 μ m のチャイニーズハム スター卵巣 (CHO) のスポットで DNA 損傷を誘導するレーザー マイクロビーム システム4を細胞し、の誘導を設立このシステム5DNA photolesions。その特殊な設定と生成できないのため限られていたシステムを損傷時の採用 UV マイクロビーム方法上の重要な改善を提供しながら、二重鎖切断 (Dsb)6です。様々 な UV-B (290-320 nm) と UV の後の調査-グループの数によって (320-400 nm) 波長 UV 光、酸化基本病変を明らかにした単鎖切断 (SSBs) と Dsb はレーザーの波長に依存して誘導することが、電源には、4、7,8,9,10 (文献3) が適用されます。さらに、これらの UV-B と UV-A 波長ソラレン、ブロモデオキシウリジン (BrdU) ヘキスト染料などのエージェントを感作性との組み合わせも発見された波長、パワー、および露出の期間に依存して DNA 損傷を誘導するために必要な力が誘発するダメージはしばしばこれらエージェント11,12,の13,14,15存在下で引き下げ。これらのメソッドの普及のために対処するまだ技術的なハードルがあったがこれらの進歩, マイクロ照射の利用の拡大。
クレーマーと同僚大幅正確に中心にセルの高いローカライズされた領域に重要な有害なエネルギーを適用する UV マイクロビームによるマイクロ照射のフィールドを高度な。共焦点顕微鏡とレーザ レーザーマイクロダイ セクション システムが高度な鋭く焦点を合わせた光だったより広くアクセスできる;しかし、紫外線源をスコープに結合と彼らはまだによる色収差を扱うほとんどのユーザー3,6,16に重要な課題を提示しました。UV UV 染料増加光学フォーカシング可能、1990 年代を通じて人気キャプチャ紫外励起蛍光16より広く利用可能になった、レーザースキャニングの改善はユーザーを提供して高度を作成する機能に集中セル6,17内励起スポット。しかし、それまでなかった 2000 年代初頭高強度レーザーでしっかりと集束ビームのこの組み合わせの真の影響が感じられた、多数のレポートはデモに増感剤と DNA 鎖切断を誘導することが現れたとき、A-紫外線範囲6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24、 25,26, 488 nm27のようなもはや目に見える波長で、でも。これらの進歩は、多くの商用システムでマイクロ照射技術のより広まった採用を許可します。これらの開発と並行して、2 光子技術も登場した DNA の損傷の正確な誘導を許可これらの進歩はここでは説明しません、これら方法論9,28,29,30を議論するレビュー記事の数があります。
共焦点顕微鏡高集束の紫外光や蛍光タンパク質が DNA 修復タンパク質の実時間追跡を許可に広まった可用性を提供することができる現在のアクセシビリティを指定してマイクロ照射技術に進化しています。DNA 損傷応答と修復経路を検査するための強力なツールです。ただし、ユーザーは、DNA 損傷の生成、レーザー波長とサブ核の領域に適用される力に大きく依存であることを認識する必要があります。UV-C の使用 (〜 260 nm) 波長直接 DNA 励起と UV 光7,8誘導高い選択性を許可します。UV-B と UV-A 波長 DNA 損傷 (基本病変、SSBs、Dsb) の混合物を作り出す、応用力や細胞の背景に依存活用7。内因性光増感剤と標的細胞の抗酸化レベルは、これらの波長によって生成される DNA 損傷の混合物に影響を与えます。また、外因性光増感剤 (BrdU 等) の使用は、DNA 損傷の誘発のために必要なエネルギーの低下で助けるかもしれない。しかし、これらのエージェントは、自分で DNA 損傷を引き起こすことができる、使用ユーザーが考慮する必要があります望ましくない効果が生じるので細胞周期とクロマチン構造を変更可能性があります。したがって、DNA 損傷応答と修復を検討するマイクロ照射を使用する前に、興味、使用可能な波長および作成された DNA 損傷の混合物の DNA 修復経路を慎重に検討が必要です。
2 つの一般的に使用される波長は、355 でレーザー マイクロを実行するここでは、nm、405 nm、これらの波長との修復を調べることで持っているこれらの損傷の混合物の影響によって生じる DNA 損傷の混合物を示すための増感剤なしSSBs と Dsb。 ユーザーはこれらの波長が単一種の鎖または基本病変を作成しないでください注意してくださいする必要があります。DNA 修復経路を区別するためにユーザーする必要があります慎重に核の特定の領域の応用力の制御、複数のストランド ブレーク マーカーや DNA 病変抗体を用いた誘導損傷を特徴付けます。正しく適用し、特徴、マイクロ レーザー ユーザーがいくつかの特異性と、偏向や SSBs 基本病変の修復を評価できるように、DNA の損傷のいくつかの種を豊かにできます。したがって、できるように再現性をもって実行マイクロ レーザー応用レーザー線量による DNA 損傷の混合物を特徴付ける、データ分析を実行する方法を提供しております。

<table><tbody><tr><td>ニコンA1rsiレーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NISエレメントソフトウェア</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355nmレーザー</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>放射線源</td></tr><tr><td>ガルバノメーター 光活性化ミニスキャナー</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフォトダイオード パワーセンサー</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>ファイバーフォトダイオードパワーセンサー</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>デジタルハンドヘルド光パワーおよびエネルギーメーター</td><td>THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>サミュエル・H・ウィルソン博士から、NIEHS</td></tr><tr><td>最小限の必須メディア</td><td>Hyclone</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタの生物学的製剤</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus トランスフェクション</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4 チャンバーカバーガラス</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8 チャンバーカバーグラス</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化ヒストンH2AX&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>反シクロブタン ピリミジン二量体</td><td>Cosmo Bio クローン</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>反 8-オキソ-2 &acute;-deoxyguanosine&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 ヤギ反マウス</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 ヤギ反ウサギ</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>注意 有毒!</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>注意 有毒!</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコンラボ</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>注意有毒!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>フィッシャー</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>アジ化</td>ナトリウム <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>注意 有毒!</td></tr><tr><td>トリス塩酸塩</td><td>アムレスコ</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

非常に調整された DNA 修復経路が存在する検出、消費税し損傷を受けた DNA 塩基の置換および DNA 鎖切断の修復を調整します。分子生物学の技術は、構造、機能、および修復タンパク質の動態を明らかにした、間まだ修理は核内の調整方法を理解する必要があります。レーザー マイクロ DNA 損傷を誘発して、修復タンパク質の募集を監視のための強力なツールを提供しています。レーザー マイクロ照射による DNA 損傷の誘発できる波長の範囲で発生して、ユーザーは確実に一本鎖切断、基本病変と用量の範囲で二重鎖切断を誘導できます。シングルの 2 つの一般的な共焦点レーザー波長は、355 による二重鎖切断修復を調べるためのマイクロ レーザーの使用ここでは、nm、405 nm。レーザー マイクロ照射データ集録および解析をユーザーが再現性をもって実行できるように、特定の損傷の混合物を誘導するため応用レーザー照射量のさらに、適切な特性が記述されています。

DNA 損傷の評価 基本病変および鎖の誘導は選択した核領域に適用されるレーザー照射量に依存して、細胞モデルの細胞の微小環境使用7。蛍光タンパク質融合修復タンパク質 Rad51 Ku70、53BP1 XRCC1 のような便利な 1 つを提供して二重鎖損傷上の ROI 内の蛍光蛋白の蓄積を見るために必要な最小限のエネルギーを確立するためブレーク マーカー、バック グラウンド蛍光9,19,31。応答を引き起こす条件を見つけたら、その特定の波長と線量による損傷の混合物を特徴付けるために重要です。用量と使用する波長で期間の減衰は、複雑な損傷、混合物の形成を最小限に抑えるためにユーザーを許可できます。UV A 範囲内のレーザーの低用量は主に SSBs と基本病変、SSBR および BER の経路10,28を勉強のために適切の少量を生産する実証されています。複雑な底の病変、酸化を作成投与量を増加し、UV 誘発し Dsb7,10のより重要な番号を誘導します。DNA 損傷の単一種の誘導は特定の DNA 修復経路の検討が望ましいが、それはユーザーは SSBs 基本病変や Dsb よりはるかに頻繁にされているような特定の病変を DNA 損傷の混合物を誘導することらしい。これは過酸化水素 (H2O2) またはメチル メタンスルホン酸 (MMS)32のような化学剤によって誘発された DNA 損傷の混合物と同様です。ユーザーは、彼らは混合物に損傷を与える結果が発生することが報告線量および損傷のサイトで病変の慎重な評価が再現性とその結果の比較可能性を確保するため必要なときに知っておく必要があります。
マイクロ照射研究 XRCC1 GFP が基本病変と SSBs9,28の誘導のためのマーカーとしてよく使用されます。XRCC1 は SSB 修理 (SSBR) で重要な役割を果たしている足場蛋白質と基本切除修理 (BER)、ヌクレオチド除去修復 (NER)33,34,35 のような他の修復経路にも関与.数 poly(ADP-ribose) ポリメラーゼ (PARP 1)、1 DNA ポリメラーゼ β を含むキーの蛋白質との相互作用、DNA 修復における重要な調整の役割を果たしている (Pol β)、および DNA リガーゼ III。SSBs と Dsb を生成するために必要なレーザーの用量を決定する XRCC1 GFP 安定 CHO ‐ K1 細胞で発現を利用しました。まず各波長 (図 1)、XRCC1 GFP の観察可能な募集を誘導するために必要な最小線量がわかりました。355 nm の波長に定義された被害 2 秒滞留時間 ROI は終わった背景 (図 1A) 検出可能な DNA 損傷の誘発を示す、ROI 内の高められた蛍光信号を生成されます。405 の nm、スキャン、8 fps のレート投資収益率 (図 1A) 損傷を観察可能な募集を生成する必要があります。投与量が増加し (10 秒 355 nm、405 の 0.5 fps で nm) より強い作成する投資収益率 (図 1A) に損傷を与えます。
損傷のサイトで、XRCC1 GFP の採用と保持しタイムラプス イメージングによって監視されました。DNA 損傷のサイトでタンパク質の保持可能性がありますに DNA 修復、損傷のサイトからタンパク質の解離はしばしば BER や SSBR の完了のためのマーカーと見なされます。ただし、修理が完成するとレーザー照射による DNA 損傷部位から、XRCC1 の解離のリンクの明確な証拠はありませんされて。損傷のサイトに蛋白質の募集を測定するには、全体の核 (図 1B) 測定平均蛍光信号に破損した ROI 内蛍光信号の平均の強さを報告します。興味の蛋白質の細胞分布に応じて他の正規化手法を用いることができるが、正規化のこのタイプはアドレス核の信号強度揺らぎを役立ちます。ここでは、正規化を核面積測定損傷 ROI への信号の再配布、XRCC1 は核コンパートメントでローカライズされます。投資収益率の平均蛍光強度は、タイムラプス、前損傷画像 (図 1C) の時間の関数としてグラフ化などのイメージごとに記録されます。
我々 は、さらに DNA 基本病変の形成を検討する 2 つの選択したレーザー線量による損傷を特徴付けられます。まず、CPD、かさばる紫外線誘起病変の形成は、NER 型病変 (図 2A) のマーカーとして蛍光抗体法によってプローブだった。その後、酸化誘導基本 lesion8-切断・酸化損傷は、BER 型病変 (図 2B) のマーカーとしてプローブだった。両方の波長の低線量の露出で CPD 病変の有意な増加は認められなかった (2 秒 355 nm 405 8 fps で nm) 高線量の両方の波長で治療しながら、(10 秒 355 nm、405 の 0.5 fps で nm) 蛍光灯で大幅な増加を見せた 投資収益率 (図 2A) 損傷の内で観察する信号。CPD の投資収益率の散布は損傷の形成と波長と用量、低用量で CPD 病変の低レベルがありますが、負荷が大きくできない可能性がありますを示すの両方で検出の各損傷細胞ショーの不均質性の強度を意味します。高用量が適用されるまでに検出されました。散布図には、損傷の混合の定量の正確さを制限可能性があります抗体の検出の効率の悪も示唆しています。
これはさらにマーカー 8 切断・酸化損傷 - によって誘導される酸化的 DNA 損傷の検出でハイライトされます。被害内蛍光信号の明確な増加はありません投資収益率ではレーザー波長または使用していません (図 2B) で 8 切断・酸化損傷が観察されました。この作業に使用する抗体は前出版物9,10,36; と一致してただし、抗体37,38と 8 切断・酸化損傷の形成を観察することに制限があることに注意してください。8-オキソグアニン DNA グリコシラーゼ (OGG1) DNA10から 8 切断・酸化損傷を除去するため責任がある酵素の募集のように、2 番目のマーカーによって勧め酸化誘起病変の欠如の確認もします。OGG1 募集当社 DNA 損傷サイトに見られなかったただし、酸化的 DNA 損傷の低レベルの形成支配して完全にできません。
最後に、Dsb の元で、53BP 1、γH2AX 2 つのマーカーを使用して形成を検討しました。蛍光抗体法による d レーザー線量 (図 3 &#38; 4)。ΓH2AX、ストランド ブレーク マーカーとして使用されますが、レポート39,40数の Dsb に対する特異性を疑問視されています。さらに、鎖切断する信号の局在はこの信号の伝達のために制限できるように鎖休憩サイトから伝達されるリン酸化イベントです。したがって、被害の ROI 内 DSB 形成のより正確な評価のため、53BP 1 と γH2AX を組み合わせること。
マイクロ照射への γH2AX と 53BP 1 の応答は、波長と用量依存性の両方です。低用量 (2 s) 刺激 355 nm は 5 〜 20 分と両方のマーカーのための弱いと変数の応答の 10 分間ポスト照射 (図 3A) での反応を引き出します。高用量 (10 s) 355 nm マイクロ照射で 5、10、および 40 分 (図 3B) に低減されます 20 分ポスト照射損傷 ROI 内増加蛍光信号を誘発します。これらの結果を示す、355 nm 線量の滴定修復経路の相互刺激を最小限に抑えるために必要な初期の時点で二重鎖ブレーク マーカー γH2AX の減少の検出によって示されるように注意してください (&#60; 20 分) 低用量で適用されます。
低 (8 fps) と高用量 (0.5 fps) 405 nm レーザ刺激法 (図 4) を使用して同様の実験を行った。この波長で損傷 ROI 内の蛍光強度の重要な蓄積は 53BP 1 の γH2AX これらの用量はほぼ単一および二重鎖切断の複雑な混合物を生成することを示す、適用用量に関係なく認めDNA 損傷 (図 4) の誘導後すぐ。さらに、405 nm を pan 核 γH2AX 染色損傷誘導 (図 4B下) の 10 分以内の増加の高用量を ROI の損傷の検出を困難 53BP 1 蓄積中のレポートは、被害投資収益率に含まれています。
これらの結果は、405 nm マイクロ照射が SSBR や BER、監視するために適切ではないと誘導病変と DNA 修復応答を完全に特徴づけること DNA の複数のマーカーを内転、ストランドの改を採用すべきことを明確に示します。
XRCC1 GFP の採用と保持の用量依存的変化 一度誘発 DNA 損傷が特徴づけられているマイクロ レーザーは DNA 修理蛋白質のダイナミクスを研究するための理想的なプラットフォームをすることができます。XRCC1 GFP の固定・解離動態は各波長によってさまざまな損傷が混合物の誘導は、予期しないが量依存性 (図 1) を示しています。最高の照射線量 (10 s および 0.5 fps) は、20 分時間経過 (図 1C) 低用量を基準にして、XRCC1 GFP の高強度募集と損傷のサイトで、XRCC1 GFP の保存期間の延長を示しています。これは 355、405 nm の高用量で作成された DNA 損傷は、外観と DSB マーカー、γH2AX、53BP 1 の保持と一致している実験の過程で解決されない可能性があることを示します (図 3 &#38; 4).
興味深いことに、低損害用量 (2 s と 8 fps) 表示被害サイトする XRCC1 GFP の迅速な採用と予備照射レベル (図 1C) に実験的な回にわたって XRCC1 GFP の解離。損傷の混合物の完全な特性評価なしこれは SSBs と基本病変が完全に解決されるこれらの有害な条件を使用して結論に導くかもしれない。しかし、γH2AX と 53BP-1 355 の 40 分でのプレゼンス nm と、405 の 5 分で nm がさまざまな解釈につながる可能性があります。355 nm 2 の線量被害混合物可能性があります主に SSBs、40 分で DSB マーカーの外観は、いくつかの未修理病変を Dsb につながるかもしれない、または長い時間のスケールのこのエネルギーによって生成される Dsb が修復されますを示すことがありますので。SSBR と DSB の修復の時間スケールの違いは、以前に報告された28,41,42をされています。同様に、405 nm 低用量 (8 fps) 解離は SSBs の低レベルを示すことがありますまたはマイクロ照射と DNA 損傷物質を損傷のクラスタ リングの偏向に変換される急速に SSBs 高に記載されています、以前43,44,45。
一緒にこれらの結果は、損傷の混合物の評価の重要性を強調、複数の DNA を利用した修復タンパク質と通訳募集と DNA の保存のためのマーカー修復損傷部位でのタンパク質。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
図 1.マイクロ レーザー誘導 XRCC1 GFP の募集です。 (安定 XRCC1 GFP を発現する A) CHO ‐ K1 細胞は照射され、損傷誘導直後をイメージします。マイクロ照射線量の場所を示す矢印とスケール バーは、10 μ m. (B) 募集は損傷の ROI 内平均蛍光強度を決定して全体の核の平均蛍光強度への正規化によって測定されます。(C) 募集のダイナミクスは、タイムラプス イメージごとに測定できます。グラフが SEM を表す誤差範囲を持つ 2 つの独立した実験の代表者 (n = 24)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
図 2.レーザー マイクロは、塩基損傷を誘発します。 CHO ‐ K1 細胞マイクロ レーザーを受ける, 損傷誘導直後後固定.CPD を検出する蛍光を行い 8 切断・酸化損傷の付加します。(A) 上部には、CPD の染色後損傷した細胞を ROI の平均蛍光強度で観察の散布。下、CPD の染色の代表的なイメージ。マイクロ照射の位置を示す矢印とスケール バーは 10 μ m (n = 12)。(8 切断・酸化損傷汚損のため B) 代表的なイメージ。矢印マイクロ照射の位置を示すし、スケール バーは、10 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
図 3.DNA 二重鎖ブレーク マーカーは用量依存的に 355 nm マイクロ照射に応答します。 CHO ‐ K1 細胞マイクロ照射を受ける, 時間ポイント示された後刺激で固定.DSB マーカー γH2AX と 53BP 1 蛍光抗体法を行った。(A) 投資収益率は、破損、損傷した細胞の蛍光強度測定を意味正規化された損傷の散布図。誤差は、SEM の代表者 (n = 12)。(ΓH2AX と 53BP 1 染色 B) 代表的なイメージ。マイクロ照射の位置を示す矢印とスケール バーは、10 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
図 4。DNA 二重鎖ブレーク マーカーは確実 405 nm マイクロ照射に応答します。 CHO ‐ K1 細胞マイクロ照射を受ける, 時間のポイント示されたポストの刺激で固定.DSB マーカー γH2AX と 53BP 1 蛍光抗体法。(A) 投資収益率は、破損、損傷した細胞の蛍光強度測定を意味正規化された損傷の散布図。誤差は、SEM の代表者 (n = 12)。(ΓH2AX と 53BP 1 染色 B) 代表的なイメージ。マイクロ照射の位置を示す矢印とスケール バーは、10 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

DNA 損傷を誘発するおよび選択したサブ核領域の DNA 修理蛋白質の応答を監視するための共焦点レーザー蛍光顕微鏡とレーザ マイクロ照射提供ツールです。この手法は、損傷検知、信号、および募集の知識大幅進んだ。この原稿は、単一および二重鎖切断修復を検討するこれらのテクノロジを示します。

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

この手順の全体的な目的は、共焦点蛍光顕微鏡のレーザーを用いて、細胞内の核内領域にDNA損傷を誘導することです。この手法は、タンパク質がどのようにDNA損傷部位に動員され、保持されるかといった、DNA修復に関する重要な疑問を解明するのに役立ちます。本技術の主な利点は、目的のタンパク質をリアルタイムで可視化できるため、動員と保持のプロファイルを構築できることです。目的の細胞を含むチャンバースライドを、37°C、5%二酸化炭素に維持されたステージトップインキュベーターに設置して、この手順を開始します。エンコードされた自動顕微鏡ステージを用いて、画像視野を登録します。ウェル間の障壁など、培養容器の識別可能な特徴を選択してください。画像を収集し、X-Y座標を記録します。これにより、試料調製後に選択した領域のX-Y座標をアライメントおよびレジストレーションすることが可能になります。画像レジストレーションが完了したら、マイクロ照射を行う領域を選択し、試料に焦点を合わせます。蛍光標識タンパク質を発現している細胞については、目的の蛍光チャネルにおいて、核の断面積が最大となる焦点面を選択します。核の最大断面積に焦点を合わせることは、誘導された損傷部位への目的タンパク質のリクルートメントをモニタリングする際、焦点が核の中心にあることを保証するために極めて重要です。核小体などの核内の明確な構造を選択し、その外観の変化を観察しながら焦点面を上下に移動させてください。真の焦点面は、明部から暗部への移行領域内に位置します。試料に焦点を合わせるには、選択した特徴のコントラストが最も鮮明になる焦点面を選択してください。次のステップは、関心領域の位置を登録することです。顕微鏡ソフト内で、3×3ピクセルの正方形の関心領域（ROI）を作成します。このROIを損傷させる細胞の核上に配置し、「損傷ROI」として設定します。損傷ROIの位置を含む、損傷前の画像を収集します。目的タンパク質の蛍光チャンネルで、明視野を含む画像を取得します。これで細胞のレーザー微小照射の準備が整いました。本デモンストレーションでは、405 nmのレーザーを100%の出力で使用します。405ナノメートルレーザーの照射量は、スキャン速度を調節し、選択した損傷ROIを1回スキャンすることで制御します。本実験では、405ナノメートルのマイクロ照射において、8フレーム/秒および0.5フレーム/秒を使用します。細胞に損傷を与えるための適切なレーザー出力を選択することは、異なるDNA修復経路を区別する上で極めて重要です。損傷後、明視野および蛍光チャネルのタイムラプス画像取得を行います。データ収集を最適化するため、タイムラプスの間隔と頻度を調整し、理想的には損傷ROIにおける蛍光タンパク質の蓄積とその時間経過に伴う解離を捉えるようにします。タイムコースが完了した後、損傷させる新しい細胞視野を選択し、目的の損傷細胞数に達するまでマイクロ照射とタイムラプスイメージングを継続します。選択した条件につき10から25個の細胞を推奨します。免疫蛍光分析のための総細胞数を増やすには、培養容器内の追加の視野に損傷を与え、損傷後反応のマルチフィールドタイムコースを作成してください。各視野のX-Y座標と損傷が発生した時間を記録してください。細胞は損傷後すぐに固定するか、固定前に一定の時間間隔で修復させることができます。この解析を開始するには、NIS-Elementsなどの画像解析アプリケーションで取得した画像を開きます。測定する各細胞について、まず核を表す参照ROIを作成します。核を構成するピクセルを含む蛍光信号に閾値処理アルゴリズムを適用し、この領域をROIに変換します。次に、6×6ピクセルのROIを作成し、それを損傷ROIの上に配置します。この拡大したROIを、解析用の損傷ROIとして使用します。測定する各細胞について、参照ROIおよび損傷ROIの平均蛍光強度を記録します。タイムコースの各フレームにおいて、参照ROIが核領域を正確にカバーしているか確認して調整し、損傷ROIが損傷部位をカバーしているか確認して調整します。タイムコースの各フレームにおける、各ROI内の蛍光信号の平均蛍光強度を記録します。各細胞について、タイムラプス各フレームにおける損傷ROIの平均蛍光強度を、対応する参照ROIの平均強度で正規化します。ここでは、核の平均蛍光強度を参照ROIとして用い、損傷ROIの平均蛍光強度から参照ROIの平均蛍光強度を差し引くことで正規化を行います。この正規化を、すべての損傷細胞および少なくとも2つの非損傷コントロール細胞に対して繰り返します。最後に、正規化した強度値を時間に対してグラフ化し、実験的処理の関数としてリクルートメント動態の変化を示します。XRCC1-GFPを安定発現させた細胞を照射し、損傷誘発の前後でイメージングを行いました。損傷ROIへのXRCC1-GFPのリクルートメントを観察し、そのリクルートメント動態を測定しました。2つのマーカーを用いて、二本鎖切断の形成を検討した。いずれのマーカーにおいても、355 nmでの2回目の低線量刺激では、照射後5分および20分では反応が見られず、10分後には弱く変動的な反応が認められた。一方、355 nmでの10秒間の高線量マイクロ照射では、損傷ROI内において照射後5分、10分、20分で蛍光信号の増加が誘導され、40分後には減少した。これらの結果は、DNA二本鎖切断マーカーが355 nmのマイクロ照射に対して用量依存的に反応することを示しています。対照的に、405 nmのレーザー刺激では、照射量に関わらず、損傷ROI内に両方のマーカーが顕著に蓄積しました。この手法を習得し、適切に実施すれば、10個の細胞に対して約4時間で完了させることができます。この手法を実施する際は、モニタリングする修復プロセスに合わせてレーザー波長と照射出力を調整することが重要です。この手順に続き、免疫蛍光染色を行うことで、追加タンパク質の動員や、リン酸化状態、その他の翻訳後修飾の変化に関する疑問を明らかにすることができます。本手法により、研究者はDNA修復タンパク質の動的な動員を調査し、タンパク質ドメインや変異がDNA損傷の認識および応答にどのように影響するかをより詳細に判断することが可能になります。このビデオを視聴することで、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いてDNA損傷を誘導し、DNA修復タンパク質の集積をモニターする方法を十分に理解できるはずです。レーザーやホルムアルデヒドなどの化学物質を取り扱うことは極めて危険であるため、本手順の実施中は常に個人用保護具などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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マイクロレーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

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