マイクロ レーザーの単一の試験と哺乳類細胞における二重鎖切断修復のためのアプリケーション

この手順の全体的な目標は、共焦点蛍光顕微鏡レーザーを使用して、細胞の核内領域にDNA損傷を誘発することです。この方法は、DNA損傷部位でタンパク質がどのように動員され、保持されるかなど、DNA修復の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、目的のタンパク質をリアルタイムで視覚化できるため、リクルートと保持のプロファイルを構築できることです。

この手順は、目的の細胞を含むチャンバースライドを、摂氏37度と二酸化炭素5%に維持されたステージトップインキュベーターに配置することから始めます。エンコードされた自動顕微鏡ステージを使用して画像フィールドを登録します。ウェル間のバリアなど、培養容器の認識可能な特徴を選択します。

画像を収集し、X-Y 位置を記録します。これにより、サンプル調製後に選択したフィールドのX-Y位置のアライメントとレジストレーションが可能になります。画像レジストレーションが完了したら、マイクロ照射するフィールドを選択し、サンプルにピントを合わせます。

蛍光標識タンパク質を発現する細胞の場合、目的の蛍光チャネルで最大の核断面積を持つ焦点面を選択します。核の最大断面積に焦点を当てることは、焦点が核の中心に配置され、誘発された損傷部位への目的タンパク質の動員を監視するために重要であるため、非常に重要です。核小体のような核内の明確な特徴を選び、この外観の変化を観察しながら焦点面を上下に動かします。

真の焦点面は、明るいものから暗いものへの移行内にあります。サンプルの焦点を合わせるには、選択した特徴のコントラストが最もシャープな焦点面を選択します。次のステップは、関心のあるフィールドの位置を登録することです。

顕微鏡ソフトウェア内で、3 x 3 ピクセルの正方形の関心領域 (ROI) を作成します。このROIを損傷する細胞の核上に配置し、このROIを損傷したROIに設定します。損傷ROIの位置を含む損傷前の画像を収集します。

目的のタンパク質の蛍光チャネルに明視野を含む画像を取得します。これで、細胞はレーザーマイクロ照射の準備が整いました。このデモンストレーションでは、405ナノメートルのレーザーを100%の出力で使用します。

405ナノメートルのレーザー線量は、スキャンレートを変調し、選択した損傷ROIの1スキャンを実行することによって制御されます。この実験では、毎秒8フレームと0.5フレームで405ナノメートルのマイクロ照射を行います。損傷細胞に適切なレーザー出力を選択することは、さまざまなDNA修復経路を分離するために重要です。

損傷後の明視野および蛍光チャネルのタイムラプス画像取得を実行します。タイムラプスの期間と頻度を調整してデータ収集を最適化し、損傷ROIでの蛍光タンパク質の蓄積と実験の時間経過に伴うその解離を理想的に捉えます。タイムコースが完了したら、損傷する細胞の新しいフィールドを選択し、損傷細胞の所望の数に達するまでマイクロ照射とタイムラプスイメージングを続けます。

選択した条件ごとに10〜25個のセルが推奨されます。免疫蛍光分析の全体的な細胞数を増やすには、培養容器内の追加のフィールドを損傷して、損傷後応答のマルチフィールド時間経過を生成します。各フィールドの X-Y 位置と、損傷が発生した時刻を記録します。

細胞は、損傷後すぐに固定することも、固定前に選択した時間増分で修復することもできます。この解析を開始するには、取得した画像をNIS-Elementsなどの画像解析アプリケーションで開きます。測定する各セルについて、まず核を表す参照ROIを生成します。

核を構成するピクセルを含む蛍光信号にしきい値処理アルゴリズムを使用し、この領域を ROI に変換します。次に、6 行 6 列のピクセル ROI を作成し、それをダメージ ROI の上に配置します。この大きなROIが、分析のダメージROIになります。

測定する各セルについて、参照ROIと損傷ROIの平均蛍光強度を記録します。タイム コースの各フレームで、参照 ROI を調整して、核領域が ROI で正確にカバーされるようにし、損傷 ROI を調整して、損傷したスポットがカバーされるようにします。時間経過の各フレームについて、各ROI内の蛍光シグナルの平均蛍光強度を記録します。

各セルについて、タイムラプスの各フレームで、平均損傷 ROI 蛍光強度を対応する参照 ROI 強度に正規化します。ここでは、平均核蛍光強度を基準ROIとして使用し、平均損傷ROI蛍光強度から平均参照ROI蛍光強度を差し引くことによって正規化を行います。損傷したすべてのセルと、損傷していない制御セルを少なくとも 2 つ使用するために、この標準化を繰り返します。

最後に、時間の経過に伴う正規化された強度値をグラフ化して、実験的治療の関数としてのリクルートダイナミクスの変化を示します。XRCC1-GFPを安定的に発現する細胞に照射し、損傷誘導前後でイメージングしました。損傷ROIに対するXRCC1-GFPの動員が観察され、動員のダイナミクスが測定されました。

二本鎖切断の形成は、2つのマーカーを使用して調べられました。どちらのマーカーについても、355ナノメートルでの2秒間の低線量刺激は、5分と20分で反応を引き起こさず、照射後10分で弱く変動する反応を誘発します。355ナノメートルでの10秒間の高線量マイクロ照射は、照射後5分、10分、20分での損傷ROI内で蛍光シグナルの増加を誘導し、40分で減少します。

これらの結果は、DNA二本鎖切断マーカーが355ナノメートルの微小照射で線量依存的に応答することを示しています。対照的に、405ナノメートルのレーザー刺激は、適用された線量に関係なく、損傷ROI内に両方のマーカーの有意な蓄積をもたらしました。この手法を習得すると、適切に実行すれば、10個の細胞に対して約4時間で実行できます。

この手法を実行する際には、監視対象の修復プロセスに合わせてレーザー波長と適用電力を調整することが重要です。この手順に続いて、免疫蛍光法を実施して、追加のタンパク質の動員、リン酸化状態の変化、またはその他の翻訳後修飾に関する質問に答えることができます。この技術により、研究者はDNA修復タンパク質の動的動員を探索し、タンパク質ドメインと突然変異がDNA損傷の認識と応答にどのように影響するかをより正確に判断できます。

このビデオを見れば、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用してDNA損傷を誘発し、DNA修復タンパク質の動員を監視する方法について十分に理解できるはずです。レーザーやホルムアルデヒドなどの化学物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に個人用保護具などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。