Name: ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学ぶ γH2AX・53BP1免疫蛍光顕微鏡法によるDNA二重鎖切断の形成と修復解析。腫瘍細胞の遺伝的不安定性を可視化し、がん研究におけるDNA損傷応答メカニズムの理解に貢献します。

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プロジェクトは、ドイツのホセ ・ カレーラス白血病財団 (DJCLS 14 R/2017) によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、ハイデルベルク大学医療学部マンハイムの倫理委員会 II によって承認されています。インフォームド コンセントを得たすべての個人から書き込まれます。
 1。 材料準備 <ol><li>抗凝固剤原液: 0.9% 塩化ナトリウムの mL あたり 200 i. u. ヘパリンの抗凝固薬の原液を準備。コレクション チューブのそれぞれを入力 (ボリュームを描く 9 mL) 血液または骨髄のサンプルの撤退前に抗凝固剤の原液 2 mL と</li>。
	<li>赤い細胞の換散ソリューション: 準備、10 x 82.91 g 塩化アンモニウム、重炭酸アンモニウム 7.91 g、8.0 でエージェントを溶解して pH を 0.5 M エチレンジアミン四酢酸溶液 2 mL と赤血球の溶解液1 の容量の二重蒸留水・ l ・</li>
	<li>固定の解決: マイクロタイター チューブで 360 mg パラホルムアルデヒド (PFA) に 1 M 水酸化カリウム溶液を追加 8.3 μ L。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) チューブと熱 36 %pfa 溶液の 1 mL を取得する 95 ° C で加熱ブロック管内の 1 mL マークで管を埋めます。容量は 15 mL チューブに 1 mL 36 %pfa ソリューションを転送します。8 mL の PBS を 4 %pfa ストック液 9 mL を得るために 1 mL 36 %pfa のソリューションに追加します。細胞の固定用 4 %pfa 原液と-18 ° c までストア因数 。
	注意: 1) 水酸化カリウム水溶液腐食性です。目と皮膚の保護の注意してください。2) PFA は、発がん性があります。皮膚への接触や吸入を避けます。フードの下の固定の解決の準備します</li>。
	<li>透過ソリューション: およそ 0.1% のソリューションを取得する追加 50 μ L Octoxinol 50 に 9 mL PBS Octoxinol 9.</li>
	<li>ソリューションをブロック: 5% と 2 %6 で PBS とストアを持つ蛋白質のブロッキング剤を混合することによって解決を妨げる準備 &#8211; 8 ° C</li>
</ol> 2。サンプルの準備 <ol><li>細胞培養線維芽細胞: の加湿 5% の細胞株培養線維芽細胞を養う CO 2 雰囲気 4 mM 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 培地で 37 ° C でグルタミン、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン。
	<ol><li>付着と顕微鏡のスライドの準備線維芽細胞 <ol><li>は、フラスコ (75 cm 2 成長分野) 指数関数的に成長の培養線維芽細胞からメディアを削除します。フラスコに 10 mL の PBS を追加します。手動で 1 分のフラスコを振ることによって付着線維芽細胞を優しく洗って</li>
			<li>は、PBS を削除し、フラスコに 1 mL のトリプシンを追加します。すべての付着性細胞がトリプシンによって覆われているように優しくフラスコを振る。フラスコからトリプシンを削除します。37 で 5 分のためのインキュベーターにフラスコを入れ ° C</li>
			<li>は、インキュベーター外フラスコを取るし、フラスコに 10 mL RPMI 1640 媒体を追加します。ピペットの繊維芽細胞を分散させるために数回上下中です</li>。
			<li>は、顕微鏡スライドの 2 つのフィールドのそれぞれに分散した線維芽細胞の 0.3 mL のピペットし、24 h のためのインキュベーター内にスライドを置き、繊維芽細胞がスライドに従います。ΓH2AX と線維芽細胞の核 53BP1 の是非、ステップ 3.1 に移動します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>患者サンプル <ol><li>血液サンプル: 抗凝固剤原液 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用し、チューブに 7 mL の血液を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します</li>。
		<li>骨髄サンプル: 抗凝固剤の原液 (ステップ 1.1) の 2 mL で満ちていたコレクション チューブを使用して、チューブに 7 mL の骨髄を追加。一晩室温 (すなわち 18-20 ° C) で試料を保存します。次の日は、密度勾配遠心法 (ステップ 2.2.3) による単核細胞を休んで G0/G1 相を分離します。CD34 のマイクロ ビーズを使用し、CD34 陽性細胞を分離するための分離カラムのセルします</li>。
		<li>密度勾配遠心法による単核細胞の分離 
		メモ: 単核細胞は密度勾配遠心法 17 , 18 , 19 血液、骨髄サンプルから分離されます。
		<ol><li>Dilute PBS で 1:1 の比率でヘパリン加血液サンプルおよび PBS で 1:3 の比率でヘパリン骨髄サンプル。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を優しく中断します</li>。
			<li>は、新鮮なチューブに密度勾配媒体のボリュームを追加します。優しくレイヤーの希釈血液または骨髄密度勾配媒体の上に。2 つのレイヤーを混在させるように注意してください</li>。
			<li>は、室温で 30 分間チューブを遠心分離機し、400 x g. ピペットの上部のプラズマ層を引き。密度勾配媒体上の層の単核細胞を慎重に収穫後は。新鮮なチューブに単核細胞を転送します</li>。
			<li>は、チューブの単核の細胞に PBS の少なくとも 3 つのボリュームを追加します。ピペットのうち 2 回、それらを描画することによって細胞を優しく中断します。部屋の温度と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心</li>
			<li>スピン後上澄みを除去し、4 ° C、1 x 赤い細胞の溶解液 10 mL を加えます。優しくピペットのうち 2 回、それらを描画することによって、細胞を再懸濁します、5 分間氷の上管を配置します。4 ° C で 30 mL の PBS を追加し、室温と 400 x g で 10 分間のチューブを遠心</li>
		</ol></li> <li>、Cytospins の準備 <ol><li>患者サンプル (すなわち、1 つ cytospin γH2AX 蛍光染色、γH2AX、53BP1 の 1 つ cytospin の単核の細胞との 2 つの cytospins の準備免疫蛍光染色の組み合わせ) を (300 × g, 10 分) 遠心 ( 図 3 および 4) のそれぞれの準備のための 10 の 5 セル × 1.0</li>。
		</ol></li></ol></li></ol> 3。 γH2AX 53BP1 免疫蛍光染色と <ol><li>固定・透過: 4% の 200 μ l でセルを修復する PFA 10 分。固定後、3 回ラボ シェーカーで各 5 分の 30 mL の PBS のセルを優しく洗います。その後、セルを permeabilize 0.1% の 200 μ L で 10 分間 Octoxinol 9 セルを洗浄して優しくラボ シェーカーで各 5 分 5% ブロッキング溶液 30 mL を 3 回。30 mL の新鮮な 5 %1 h. の解決を妨げるに細胞をブロック</li>
	<li>抗体の孵化 <ol><li>インキュベート マウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) の細胞の 1 つ準備およびマウス モノクローナル抗 γH2AX 抗体 (1: 500) と細胞の他の準備とアンチ 53BP1 ポリクローナルウサギ (1: 500) 一晩で 4 ° C</li>
		<li>インキュベーション洗浄セル軽くラボ シェーカー各 5 分の 2% ブロッキング溶液 30 mL に 3 回後</li>。
		<li>ブロックのソリューションを削除し、Alexa488 共役ヤギ抗マウス二次抗体 (1: 500) とセルの最初の準備と、Alexa488 共役ヤギ抗マウス抗体 (セルの 2 番目の準備を孵化させなさい1: 500)、常温で 1 h の Alexa555 共役ロバ抗家兎二次抗体 (1: 500).</li>
	</ol></li> <li>メディアをマウント: 細胞とスライドをボウルに入れ、セルを洗浄して優しくラボ シェーカー各 5 分の 30 ml の PBS の 3 回。PBS を削除し、セルを 4, 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントをマウントします。気泡がないように慎重にメディアをマウントの上に coverslip を置く埋め込まれています。蛍光顕微鏡による細胞を分析する前にメディアをマウントの強化のため、少なくとも 3 時間待機します</li>。
</ol> 4。ΓH2AX、53BP1 の解析巣 <ol><li>蛍光顕微鏡: 100 X 目的で画像の中に、DAPI、アレクサ 488 Cy3 フィルターを搭載した蛍光顕微鏡で細胞核内 γH2AX、53BP1 の巣を分析倍率。カメラで画像を記録し、適切な画像処理ソフトウェアで画像を処理します</li>。
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ΓH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡は、形成と幅広い分野で DSB の修復の分析に有用な方法です。実験の結果に影響を与える重要なパラメーターは、細胞周期、固定と透過の細胞、抗体、およびハードウェアの選択、蛍光顕微鏡のソフトウェアに使用されるエージェントの段階です。
正常線維芽細胞細胞株培養を指数関数的に成長することにより細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響を示した。G0/G1 の異なる蛍光ドットとして登場した γH2AX 巣と S 期 (図 5) で分散したパン核 γH2AX 斑点と比べて G2 段階。G0/G1 の異なる γH2AX 巣相し、G2 段階一過性および/または構成で指定された DNA の損傷セル繰り返し通路中に取得しました。逆に、S 相に分散した斑点のみ一過性が発生し、レプリケーション ・ プロセスとおそらく関連していた。パン核 γH2AX 斑点を妨げる可能性があります分析から S 期細胞の排除、本物 γH2AX 病巣の解析を推奨します、S 相の特定 γH2AX パターンによ...

DNA が継続的に内因性によって破損している (例えば、複製ストレス、活性酸素種、DNA の固有不安定性) と外因性 (例えば、化学ラジカル、照射) ソース (図 1)1,2 ,3,4。DNA 損傷の間で DNA 二重鎖切断 (DSB) は特に深刻な病変、細胞死やがんを引き起こす可能性があります。細胞と細胞周期5あたり約 50 DSB が生じることがあります。哺乳類細胞における相同組換え (HR) と非相同性末端結合 (NHEJ) は、DSB (図 2) の修理のための主要な経路として開発。HR 遅い S/G2 段階で発生し、そのまま妹を使用する可能性のあるエラー無料修理のためのテンプレートとして染色分け体。比較では、NHEJ は細胞周期の中でアクティブおよび潜在的変異原性塩基対を追加または壊れた端部の手術時に切除したことがあります。さらに、代替末端結合 NHEJ 欠乏6、7の場合遅い変異原性バックアップ修理メカニズムとして従事するかもしれない。
DSB は、各 DSB の周りいくつかの megabase ペアの領域でセリン 139 でヒストン H2AX のリン酸化を誘導します。形成の核の巣 γH2AX 巣の名前は、蛍光顕微鏡8で検出。ΓH2AX はさらに DSB 応答性タンパク質の採用を促進し、クロマチン DNA 修復、信号伝達9に関与しています。各 γH2AX フォーカスは、単一の DSB を表すと考えられている、蛍光顕微鏡による DSB の定量化が可能であれば、癌細胞および患者検体10、11,が示されています12,13,14. 53BP1 (p53 結合タンパク質 1) DSB 修復を媒介に別の主要蛋白質であります。DSB 応答性タンパク質、チェックポイントシグナ リング、DSB 端15のシナプスの募集に取り組んでいます。さらに、53BP1 は DSB 修復経路選択に重要な役割を果たしています。HR は防がれた16NHEJ に向かって DSB の修復がトリガーされます。ΓH2AX と DSB 修復 53BP1 の本物の機能を考慮した γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の同時分析形成と DSB の修復の正確な分析のための有用な方法があります。
この原稿は、細胞核の γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡を実行するためのステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞株培養、CD34 陽性急性骨髄性白血病の患者の細胞、健康な人の x 線照射によるリンパ球の正常線維芽細胞に応用されました。方法の詳細は、発表された結果のコンテキストで指摘されます。

<table><tbody><tr><td>RPMI培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>細胞培養用培地</td></tr><tr><td>ヘパリン ナトリウム</td><td>レシオファーム</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp;ヘパリン 5,000 I.U. / mL</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム溶液 0.9%</td><td>B. ブラウン</td><td>PZN 1957154</td><td>抗凝固剤ストック溶液の成分</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>単核細胞の単離用培地</td></tr><tr><td>トリプシン溶液 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>細胞培養における線維芽細胞の解離用酵素</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-046-702</td><td>CD34+骨髄系前駆細胞の単離</td></tr> 診断<tr><td>用顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp;卓上遠心分離機&nbsp;</td></tr><tr><td>サイトスピンデバイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リッド</td><td>ヘレウス</td><td>76003422</td><td>マイクロチューブレス作業用リッド</td></tr><tr><td>サイト容器 ヘ</td><td>レウス</td><td>75003416</td><td>円錐形2つの穴を持つサイト容器</td></tr><tr><td>クリップキャリア</td><td>ヘレウス</td><td>75003414</td><td>キャリア サイト容器とスライドを保持するための</td></tr><tr><td>キャリア サポートインサート</td><td>ヘレウス</td><td>75003417</td><td>サポートインサートクリップキャリアを保持している</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>細胞膜の透過化用洗剤</td></tr><tr><td>水酸化カリウム溶液 1M</td><td>メルクミリポア</td><td>109107</td><td>パラホルムアルデヒド溶液の調製に必要</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>平衡塩溶液</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>ブロッキング剤</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗 -&� ガンマ;H2AX 抗体 (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>&γ;H2AX</td></tr><tr><td>ポリクローナルウサギ 抗53BP1抗体 (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Vectashield 封入剤</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200</td><td>DNA染色用DAPIを含む</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ツァイス</td><td>490035</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>クールキューブ 1 CCDカメラ</td><td>メタシステム</td><td>ズ H-0310-010-MS</td><td>デジタル記録用カメラシステム</td></tr><tr><td>ISISソフトウェア</td><td>メタシステム</td><td>対象外</td><td>顕微鏡ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

Γh2ax、53bp1 形成と dna 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

DNA 二重鎖切断 (DSB) は、深刻な DNA 損傷です。DSB の修復形成の分析、ゲノム、遺伝毒性試験、放射線生物学、老化、癌、および医薬品開発を含む研究分野の広範なスペクトルに関連しています。DSB に応答して、ヒストン H2AX は蛍光顕微鏡によるセリン 139 離散核病巣検出を形成するいくつかの megabase ペアの領域内でリン酸化されます。また、53BP1 (p53 結合タンパク質 1) は別重要な DSB 応答性タンパク質相同組換えを防止しながら非相同性末端結合による DSB の修復を促進します。ΓH2AX、53BP1 の特定の機能によると γH2AX と蛍光顕微鏡により 53BP1 の複合解析 DSB の詳細な分析のための合理的なアプローチがあります。本稿では、技術を実行するための組織的なノートを添加したステップバイ ステップ プロトコルを提供します。具体的には、細胞周期の γH2AX の巣パターンに及ぼす影響は、通常細胞株培養線維芽細胞で示されます。さらに、健康な人の x 線照射によるリンパ球のマーカーとしての γH2AX の巣の値が描かれています。最後に、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による、急性骨髄性白血病患者の CD34 陽性細胞の遺伝的不安定性を調べた。

G0/G1 期と G2 段階の場合 γH2AX 巣が (図 5 a) 異なる蛍光ドットとして表示されますセルの γH2AX 巣の分析は最も正確です。対照的に、レプリケーション プロセス (図 5 b) によって引き起こされる分散パン核 γH2AX 斑点、S 期細胞で γH2AX 巣の分析は複雑します。
細胞の固定を行った 4 %pfa (10 分) と 0.1% で透過 Octoxinol 9 (10 分)。メタノールを固定と透過にも使用できます。ただし、メタノールが非常に深刻な細胞核を分割し、4 %pfa と 0.1% 治療によって得られる γH2AX の巣と比較して明確な表示されない γH2AX 巣 γH2AX 巣を汚す Octoxinol 9。
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この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA 二重鎖切断の分析のためのプロトコルを提供します。

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

γ-H2AXおよび53BP1免疫蛍光顕微鏡の全体的な目標は、さまざまな組織におけるDNA二本鎖切断の形成と修復を分析することです。この方法は、腫瘍細胞で遺伝的不安定性がどのように生じるかなど、がん研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一のDNA二重鎖切断を視覚化できることと、修復プロセスを分析できることです。手順を実演するのは、当研究室の技術者であるSusanne Brendelです。実験は、0.9%塩化ナトリウムに1ミリリットルあたり200国際単位のヘパリンを含む抗凝固剤ストック溶液から始めて、溶液を準備することから始めます。血液または骨髄サンプルを回収する前に、各収集チューブに2ミリリットルの抗凝固剤ストック溶液を満たします。.次に、82.91グラムの塩化アンモニウム、7.91グラムの重炭酸アンモニウム、および2ミリリットルの0.5モルエチレンジアメネテトラディ酸溶液をpH8.0に含有する赤血球用の10倍溶解液を調製し、薬剤を二重蒸留水に総容量1リットル溶解します。次に、マイクロタイターチューブ内の360ミリグラムのパラホルムアルデヒド(PFA)に8.3マイクロリットルの1モルの水酸化カリウム溶液を加えて、固定溶液を調製します。チューブにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をチューブの1ミリリットルマークまで充填し、加熱ブロック内でチューブを摂氏95度に加熱して、36%PFA溶液1ミリリットルを得ます。36%PFA溶液の1ミリリットルを15ミリリットルのチューブに移します。そして、8ミリリットルのPBSを添加して、9ミリリットルの4%PFAストック溶液を得ます。4%PFAストック溶液を分注し、細胞固定に使用するまでマイナス18°Cで保存します。次に、50マイクロリットルのオクトキシノール9を50ミリリットルのPBSに加えて透過化溶液を調製し、約0.1パーセントのオクトキシノール9の溶液を得る。最後に、タンパク質ブロッキング剤をPBSと混合することにより、5%および2%のブロッキング溶液を調製します。血液または骨髄のサンプルを調製するには、2ミリリットルの抗凝固剤ストック溶液で満たされたチューブを回収します。無菌条件下で、静脈穿刺または骨髄穿刺により、チューブあたり7ミリリットルの血液または骨髄をそれぞれ採取します。サンプルを室温で一晩保管します。一晩保存した後、ヘパリン化した血液サンプルをPBSで1対1に希釈し、ヘパリン化した骨髄サンプルをPBSで1対3の比率で希釈します。細胞をピペットに2回出し入れして、細胞を静かに浮遊させます。次に、密度勾配培地を1ボリューム追加します。希釈した血液または骨髄を密度勾配培地の上に穏やかに重ね、2つの層が混ざらないように注意してください。チューブを室温で30分間、400 Gで遠心分離し、ピペットで上部血漿層を引き抜きます。次に、密度勾配培地の上の層で単核細胞を慎重に回収します。単核細胞を新しいチューブに移し、少なくとも3容量のPBSを追加します。細胞をピペットに2回出し入れして、細胞を静かに浮遊させます。チューブを遠心分離します。スピン後、上清を取り除きます。赤血球用の4°Cの1x溶解溶液を10ミリリットル加えます。細胞をピペットに2回出し入れして細胞を穏やかに再懸濁し、チューブを氷上に5分間置きます。次に、摂氏4度で30ミリリットルのPBSを加え、チューブを遠心分離します。CD34 マイクロビーズおよび細胞分離カラムを使用して、CD34 陽性細胞を単離します。患者サンプルの単核細胞を含む2つの細胞スピンを、各調製物について5つの細胞の1×10の遠心分離により調製します。細胞を200マイクロリットルの4%PFAで10分間固定します。固定後、シェーカーで細胞を30ミリリットルのPBSでそれぞれ5分間、穏やかに3回洗浄します。次に、0.1%オクトキシノール9の200マイクロリットルで細胞を10分間透過させます。ラボシェーカーで、30ミリリットルの5%ブロッキング溶液で細胞を3回穏やかに洗浄します。細胞を30ミリリットルの新鮮な5%ブロッキング溶液で1時間ブロックします。0.1%オクトキシノール9中の4%パラホルムアルデヒドによる細胞の固定と透過化により、γ-H2AXおよび53BP1病巣が明確に保持されます。一方の調製物をマウスモノクローナル抗γ-H2AX抗体でインキュベートし、もう一方の調製物をマウスモノクローナル抗γ-H2AX抗体およびポリクローナルウサギ抗53BP1抗体でマウスモノクローナル抗Γ-H2AX抗体と1系統の細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。実績のある抗γ-H2AX抗体および抗53BP1抗体の使用を強く推奨します。インキュベーション後、ラボ用シェーカーで5分ごとに30ミリリットルの2%ブロッキング溶液で細胞を3回穏やかに洗浄します。次に、細胞の最初の調製物を、2%ブロッキング溶液で500分の1に希釈したAlexa 488標識ヤギ抗マウス二次抗体でインキュベートします。2回目の調製物であるAlexa 488標識ヤギ抗マウス二次抗体およびAlexa 555標識ロバ抗ウサギ二次抗体を500分の1に希釈して2%のブロッキング溶液でインキュベートします。実験室のシェーカーで30ミリリットルのPBSで細胞を3回穏やかに洗浄します。PBSを取り外し、封入剤でセルをマウントします。封入剤の上にカバースリップを敷き詰め、気泡が溜まらないように注意して置きます。封入剤が硬化するまで少なくとも3時間待ってから、蛍光顕微鏡で細胞を分析してください。最後に、DAPI、Alexa 488、およびCy3用のフィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて、細胞核内のγ-H2AXおよび53BP1の病巣を100倍の倍率でイメージングしながら解析します。細胞内のγ-H2AX病巣の解析は、この代表的な線維芽細胞の画像に示すように、γ-H2AX病巣が明確な蛍光ドットとして現れるG0 G1期とG2期で最も正確です。対照的に、S期の細胞内のγ-H2AX病巣の解析は、複製プロセスによって引き起こされる汎核ガンマH2AXの分散した斑点によって複雑になります。γ-H2AXの免疫蛍光染色法を用いて、照射組織中のDNA二本鎖切断の定量を行い、照射リンパ球中のγ-H2AX病巣のレベルが照射量に比例することを解明しました。急性骨髄性白血病患者のCD34陽性細胞におけるγ-H2AXおよび53BP1病巣の共局在は、DNA二本鎖切断部位における53BP1を介した非相同末端結合修復メカニズムの促進を示している。このビデオを見た後、DNA二本鎖切断の分析のためのγ-H2AXおよび53BP1免疫蛍光顕微鏡法の実施方法について十分に理解しているはずです。この手順に続いて、DNA損傷応答の変化を分析するために、腫瘍細胞でリン酸化関連ATM、ATR、チェックポイントキナーゼ1、チェックポイントキナーゼ2、TP53の免疫ブロッティングなどの他の方法を実行できます。

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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学ぶ γH2AX・53BP1免疫蛍光顕微鏡法によるDNA二重鎖切断の形成と修復解析。腫瘍細胞の遺伝的不安定性を可視化し、がん研究におけるDNA損傷応答メカニズムの理解に貢献します。

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

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