ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

γ-H2AXおよび53BP1免疫蛍光顕微鏡の全体的な目標は、さまざまな組織におけるDNA二本鎖切断の形成と修復を分析することです。この方法は、腫瘍細胞で遺伝的不安定性がどのように生じるかなど、がん研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、単一のDNA二重鎖切断を視覚化できることと、修復プロセスを分析できることです。

手順を実演するのは、当研究室の技術者であるSusanne Brendelです。実験は、0.9%塩化ナトリウムに1ミリリットルあたり200国際単位のヘパリンを含む抗凝固剤ストック溶液から始めて、溶液を準備することから始めます。血液または骨髄サンプルを回収する前に、各収集チューブに2ミリリットルの抗凝固剤ストック溶液を満たします。.

次に、82.91グラムの塩化アンモニウム、7.91グラムの重炭酸アンモニウム、および2ミリリットルの0.5モルエチレンジアメネテトラディ酸溶液をpH8.0に含有する赤血球用の10倍溶解液を調製し、薬剤を二重蒸留水に総容量1リットル溶解します。次に、マイクロタイターチューブ内の360ミリグラムのパラホルムアルデヒド(PFA)に8.3マイクロリットルの1モルの水酸化カリウム溶液を加えて、固定溶液を調製します。チューブにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をチューブの1ミリリットルマークまで充填し、加熱ブロック内でチューブを摂氏95度に加熱して、36%PFA溶液1ミリリットルを得ます。

36%PFA溶液の1ミリリットルを15ミリリットルのチューブに移します。そして、8ミリリットルのPBSを添加して、9ミリリットルの4%PFAストック溶液を得ます。4%PFAストック溶液を分注し、細胞固定に使用するまでマイナス18°Cで保存します。

次に、50マイクロリットルのオクトキシノール9を50ミリリットルのPBSに加えて透過化溶液を調製し、約0.1パーセントのオクトキシノール9の溶液を得る。最後に、タンパク質ブロッキング剤をPBSと混合することにより、5%および2%のブロッキング溶液を調製します。血液または骨髄のサンプルを調製するには、2ミリリットルの抗凝固剤ストック溶液で満たされたチューブを回収します。

無菌条件下で、静脈穿刺または骨髄穿刺により、チューブあたり7ミリリットルの血液または骨髄をそれぞれ採取します。サンプルを室温で一晩保管します。一晩保存した後、ヘパリン化した血液サンプルをPBSで1対1に希釈し、ヘパリン化した骨髄サンプルをPBSで1対3の比率で希釈します。

細胞をピペットに2回出し入れして、細胞を静かに浮遊させます。次に、密度勾配培地を1ボリューム追加します。希釈した血液または骨髄を密度勾配培地の上に穏やかに重ね、2つの層が混ざらないように注意してください。

チューブを室温で30分間、400 Gで遠心分離し、ピペットで上部血漿層を引き抜きます。次に、密度勾配培地の上の層で単核細胞を慎重に回収します。単核細胞を新しいチューブに移し、少なくとも3容量のPBSを追加します。

細胞をピペットに2回出し入れして、細胞を静かに浮遊させます。チューブを遠心分離します。スピン後、上清を取り除きます。

赤血球用の4°Cの1x溶解溶液を10ミリリットル加えます。細胞をピペットに2回出し入れして細胞を穏やかに再懸濁し、チューブを氷上に5分間置きます。次に、摂氏4度で30ミリリットルのPBSを加え、チューブを遠心分離します。

CD34 マイクロビーズおよび細胞分離カラムを使用して、CD34 陽性細胞を単離します。患者サンプルの単核細胞を含む2つの細胞スピンを、各調製物について5つの細胞の1×10の遠心分離により調製します。細胞を200マイクロリットルの4%PFAで10分間固定します。

固定後、シェーカーで細胞を30ミリリットルのPBSでそれぞれ5分間、穏やかに3回洗浄します。次に、0.1%オクトキシノール9の200マイクロリットルで細胞を10分間透過させます。ラボシェーカーで、30ミリリットルの5%ブロッキング溶液で細胞を3回穏やかに洗浄します。

細胞を30ミリリットルの新鮮な5%ブロッキング溶液で1時間ブロックします。0.1%オクトキシノール9中の4%パラホルムアルデヒドによる細胞の固定と透過化により、γ-H2AXおよび53BP1病巣が明確に保持されます。一方の調製物をマウスモノクローナル抗γ-H2AX抗体でインキュベートし、もう一方の調製物をマウスモノクローナル抗γ-H2AX抗体およびポリクローナルウサギ抗53BP1抗体でマウスモノクローナル抗Γ-H2AX抗体と1系統の細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。

実績のある抗γ-H2AX抗体および抗53BP1抗体の使用を強く推奨します。インキュベーション後、ラボ用シェーカーで5分ごとに30ミリリットルの2%ブロッキング溶液で細胞を3回穏やかに洗浄します。次に、細胞の最初の調製物を、2%ブロッキング溶液で500分の1に希釈したAlexa 488標識ヤギ抗マウス二次抗体でインキュベー

2回目の調製物であるAlexa 488標識ヤギ抗マウス二次抗体およびAlexa 555標識ロバ抗ウサギ二次抗体を500分の1に希釈して2%のブロッキング溶液でインキュベートします。実験室のシェーカーで30ミリリットルのPBSで細胞を3回穏やかに洗浄します。PBSを取り外し、封入剤でセルをマウントします。

封入剤の上にカバースリップを敷き詰め、気泡が溜まらないように注意して置きます。封入剤が硬化するまで少なくとも3時間待ってから、蛍光顕微鏡で細胞を分析してください。最後に、DAPI、Alexa 488、およびCy3用のフィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて、細胞核内のγ-H2AXおよび53BP1の病巣を100倍の倍率でイメージングしながら解析します。

細胞内のγ-H2AX病巣の解析は、この代表的な線維芽細胞の画像に示すように、γ-H2AX病巣が明確な蛍光ドットとして現れるG0 G1期とG2期で最も正確です。対照的に、S期の細胞内のγ-H2AX病巣の解析は、複製プロセスによって引き起こされる汎核ガンマH2AXの分散した斑点によって複雑になります。γ-H2AXの免疫蛍光染色法を用いて、照射組織中のDNA二本鎖切断の定量を行い、照射リンパ球中のγ-H2AX病巣のレベルが照射量に比例することを解明しました。

急性骨髄性白血病患者のCD34陽性細胞におけるγ-H2AXおよび53BP1病巣の共局在は、DNA二本鎖切断部位における53BP1を介した非相同末端結合修復メカニズムの促進を示している。このビデオを見た後、DNA二本鎖切断の分析のためのγ-H2AXおよび53BP1免疫蛍光顕微鏡法の実施方法について十分に理解しているはずです。この手順に続いて、DNA損傷応答の変化を分析するために、腫瘍細胞でリン酸化関連ATM、ATR、チェックポイントキナーゼ1、チェックポイントキナーゼ2、TP53の免疫ブロッティングなどの他の方法を実行できます。