携帯電話のアプリケーションのコア-シェル希土類ドープ アップコンバージョンナノ結晶の合成

この手順の全体的な目標は、高温共沈法に基づいてコアシェルランタニドをドープしたアップコンバージョンナノ結晶を合成し、さらなる細胞応用を可能にする生体適合性のある表面修飾を行うことです。ここ数年、私たちの研究室では、非常にユニークなランタニドドープナノ結晶のアップコンバージョンを開発し、非常にユニークな光学特性を示し、長波長の赤外光を吸収し、基本的にこの光を短波長域の多色発光に変換することができました。このようなユニークなナノ結晶構造は、生物医学的応用のための非常に有望な特性を示しました。

この方法は、近赤外光照射による光ゲート膜チャネルタンパク質制御のためのコアシェルアップコンバージョンナノ構造の合成と、それらの生体適合性表面修飾技術のための実現可能なアプローチを提供します。手順を開始するには、メタノール中の希土類酢酸錯体のストック溶液を調製します。水酸化ナトリウムとフッ化アンモニウムのメタノール溶液を1ミリリットルあたり20ミリグラム調製します。

ストック溶液は摂氏4度で保管してください。次に、3ミリリットルのオレイン酸と7ミリリットルの1-オクタデセンを50ミリリットルの3ネック丸底フラスコにピペットで入れます。これに加えて、1.089ミリリットルの酢酸イットリウム溶液、0.608ミリリットルの酢酸イッテルビウム溶液、83.6マイクロリットルの酢酸ツリウム溶液、および128.5マイクロリットルの酢酸ネオジム溶液。

フラスコに攪拌棒と温度計を装備します。フラスコを油浴で摂氏100度に加熱し、メタノールが蒸発するまで攪拌します。次に、フラスコをシュレンクラインに接続し、フラスコを2〜3分間ポンプダウンして残留メタノールを除去します。

次に、フラスコを窒素雰囲気の下に置きます。反応混合物を700rpmで撹拌しながら、150°Cで1時間加熱します。次に、混合物を室温まで冷まします。

次に、15ミリリットルの遠心分離チューブに2ミリリットルの水酸化ナトリウム原液と2.965ミリリットルのフッ化アンモニウム原液を入れます。チューブをしっかりとキャップし、水酸化ナトリウムとフッ化アンモニウムの混合物を5秒間ボルテックスします。5分間かけて、ガラスピペットを使用して、攪拌しながら水酸化ナトリウム-フッ化アンモニウム混合物を反応フラスコにゆっくりと加えます。

次に、反応混合物を摂氏50度以下に加熱します。混合物をその温度で30分間保持します。次に、混合物を摂氏100度に加熱してメタノールを蒸発させます。

フラスコをシュレンクラインに接続し、真空下で2〜3分間残留メタノールを除去します。フラスコに窒素ガスを満たし、反応混合物を毎分5°Cで290°Cに加熱します。混合物を摂氏290度またはそれより少し上に1.5時間保持します。.

次に、攪拌しながら混合物を室温まで冷まします。製品混合物を50ミリリットルの遠心分離管に移します。残留物を30ミリリットルのエタノールでチューブにすすぎます。

混合物を室温で8分間、4, 000倍gで遠心分離します。上清を捨て、2分間超音波処理により固形物を10ミリリットルのヘキサンに分散させます。分散液に30ミリリットルのエタノールを加え、同じ条件で再度遠心分離し、上清を捨てます。

固形物を5ミリリットルのヘキサンに分散させ、分散液を摂氏4度で保存します。暗所で808ナノメートルレーザーを照射した場合のコアシェルUCNs溶液のアップコンバート発光を確認します。DBCO修飾UCNの調製を開始するには、調製したコアシェルナノ結晶を30ミリリットルのエタノールで遠心分離して洗浄します。

上清を捨て、塩酸のpH 4水溶液を10ミリリットル加えます。混合物を30分間超音波処理して、固形物を溶解します。混合物をガラスバイアルに移し、2時間激しく攪拌します。

次に、混合物を4つの30ミリリットル部分のジエチルエーテルで洗浄します。エーテル画分を組み合わせ、洗浄した水層を脇に置きます。エーテル層から微量リガンドフリーUCNを10ミリリットルの脱イオン水で回収し、水層を結合します。

結合した水性層に20ミリリットルのアセトンを加え、混合物を5秒間ボルテックスします。混合物を35, 000倍gで10分間遠心分離します。上清を捨て、沈殿物を2ミリリットルの脱イオン水に溶解して、リガンドフリーUCNの溶液を得ます。

次に、200ミリグラムのポリアクリル酸を20ミリリットルの脱イオン水に20分間超音波処理により溶解します。これにリガンドフリーUCNの溶液を加えながら、激しく攪拌します。水酸化ナトリウムの1モル溶液で混合物のpHを7.4に調整します。

混合物を30分間超音波処理し、室温で24時間撹拌します。次に、混合物を35, 000倍gで10分間遠心分離します。固形物を10ミリリットルの脱イオン水で遠心分離して4回洗浄します。

洗浄した固形物を8ミリリットルの脱イオン水に分散させて、ポリマー修飾UCNの1ミリグラム/ミリリットルの溶液を得ます。ポリマー修飾UCNの1ミリグラムを35, 000倍gで10分間遠心分離します。残りの溶液を摂氏4度で保存します。

固形物を1ミリリットルの乾燥DMFで3回遠心分離して洗浄します。次に、沈殿物を200マイクロリットルの乾燥DMFに溶解します。この溶液に、12.2ミリグラムのHOBT、14ミリグラムのEDC、5ミリグラムのDBCO-アミン、および16マイクロリットルのDIPEAを加えます。

混合物を室温で24時間攪拌します。次に、混合物を35,000倍gで10分間遠心分離します。固形物をDMSOの1ミリリットル分で遠心分離して4回洗浄します。

DBCO修飾UCNを0.2ミリリットルのDMSOに分散させ、分散液を摂氏4度で保存します。まず、12ウェルプレートに5番目のHEK293細胞を10個1回播種し、細胞を摂氏37度で24時間インキュベートします。次に、微量遠心チューブで、選択したプラスミド1マイクログラムとP3000トランスフェクションエージェント2マイクロリットルを100マイクロリットルのMEMに組み合わせます。

別の微量遠心チューブで、1.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬と100マイクロリットルのMEMを組み合わせます。両方の混合物を室温で10分間インキュベートします。次に、混合物を混合し、400マイクロリットルの低血清MEMを追加します。

次に、インキュベートした細胞を1ミリリットルの無血清DMEMで2回洗浄します。600マイクロリットルのトランスフェクション混合物を12ウェルプレートのウェルに分配します。細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。

次に、培地を取り出し、DMEMの1ミリリットルの部分で細胞を2回洗浄します。DMEM中のテトラアセチル化N-アジドアセチル-マンノサミン溶液1ミリリットルをウェルに分配します。細胞を摂氏37度で2日間インキュベートします。

次に、細胞を洗浄し、トリプシン化し、共焦点皿で一晩再培養します。次に、DBCO-UCNの50ミリグラム/ミリリットル溶液の2マイクロリットルを含む1ミリリットルの新鮮なDMEMと媒体を交換します。細胞を摂氏37度で2時間インキュベートし、DMEMで細胞を2回洗浄します。

ヒュームフードの照明を消し、カルシウムイメージングに適したジエン緩衝液を細胞に加え、暗所で30分間細胞をインキュベートします。無血清DMEMで細胞を洗浄します。細胞に808ナノメートルの近赤外光を照射し、1平方センチメートルあたり0.8ワット

細胞に20分間照射されるまで、5分間の休憩を挟んで5分間の照射を交互に行います。共焦点顕微鏡で細胞を画像化します。コアおよびコアシェルUCNの透過型電子顕微鏡では、シェルの厚さが約5ナノメートルの球状構造が示されました。

高分解能TEMは、高度に結晶化したナノ構造と一致するd-spacingを示しました。表面改質後、UCNは緩衝液に容易に分散しました。動的光散乱は、水溶液中のDBCO-UCNの流体力学的直径が約96ナノメートルであることを示しました。

PAAおよびDBCO修飾UCNのゼータ電位は、負に帯電した表面を示しており、これは緩衝液の水溶液への溶解度および安定性と一致しています。アップコンバートされた発光試験では、PAAおよびDBCO修飾UCNに808ナノメートルの光を照射すると、ベースコアシェルUCNと同じ発光パターンを持つことが示されました。光依存性チャネルタンパク質を発現するアジ化物タグ付きHEK293細胞を使用して、DBCO-UCNのバイオアプリケーションをテストしました。

アジドタグにおけるUCNの局在は、DBCO基がアジド含有色素で染色されたことに起因していました。これらの細胞を近赤外光に曝露すると、DBCO-UCNは、蛍光カルシウムインジケーターを用いた共焦点イメージングおよびフローサイトメトリーで示されるように、細胞膜を横切るカルシウムイオンの流れを促進しました。このビデオを見れば、生体適合性表面修飾を施したコアシェルアップコンバージョンナノ結晶の調製方法と、この手順に従って生細胞内の光依存性イオンチャネルを活性化するためのさらなるバイオアプリケーションについて十分に理解できるはずです。