Name: 脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶナイルレッドとオイルレッドO染色法を用いてCaenorhabditis elegansの脂質分布を定量化する手法。シンプルで低コストなこの技術は、脂質代謝と恒常性の研究に有用です。

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この作品は NIH グラントによって可能になった: R01GM109028 (S.P.C.)

1. ナイル (NR) 脂質の染色
<ol><li>5 mg/mL NR ストック溶液の調製<ol>
<li>500 mL ペットボトルで 100% アセトン 200 mL に NR 粉末 100 mg を追加します。</li>
		<li>光への露出を避けるためにアルミ箔でボトルをカバーします。</li>
		<li>使用前に暗闇の中で 2 時間のためのソリューションをかき混ぜます。</li>
		<li>長期的な使用、光の露出をせず密閉瓶で NR の原液を格納します。研究のニーズに応じて NR 原液をスケールします。NR 染色実験間で一貫性のある染色とイメージングの結果を取得する使用される同じ在庫ソリューションを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 作業溶液の調製<ol>
<li>すべて 1 mL 40% イソプロパノール (v/v)、NR 原液の 6 μ L を追加します。</li>
		<li>各サンプルの NR 実用的なソリューションの 600 μ L を準備します。 メモ: は、染色する前にソリューション権利を働いて新鮮な NR をください。NR 在庫ソリューションのニーズ、に応じて 15 mL または 50 mL のメスシリンダーの円錐管を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 脂質染色のワームの準備<ol>
<li>線虫の成長媒体 (NGM) 後半ログ OP50エシェリヒア属大腸菌でシードの 20 ° C で L4 早期にワームを成長します。</li>
		<li>X リン酸緩衝生理食塩水 + 0.01% トリトン X-100 (pbst;) 溶液 1 ml の 1 プレートからワームを洗って 1.5 mL および microfuge の管でワームの懸濁液を置きます。</li>
		<li>遠心 560 x gで 1 分間にワームは懸濁液から清と繰り返し大腸菌まで、この手順をオフにするを削除します。</li>
		<li>ワーム ペレットに 40% イソプロピル アルコール液 100 μ L を追加し、3 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>1分間 560 x gでワームを遠心し、ワームのペレットを中断させることがなく、上清を除去します。 メモ: pbst; 場合、皿のワームを洗うのに大量に使用より大きい版を使用して、プレートごとに多くのワームを染色します。サンプル固定する前に 15 分以上の PBST でワームを洗浄しないでください。細菌の培養上清がクリアされない場合は、追加の洗浄を実行します。Nutator やロッカーを使用して 40% イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプルの動揺が発生しているかどうかを確認するチューブを常に監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質染色 NR<ol>
<li>暗闇の中 NR 実用的なソリューションの 600 μ L を各サンプルに追加します。3 回チューブを反転し、NR のソリューションでワームを完全にミックスします。</li>
		<li>2 時間室温で暗闇の中サンプルを回転させます。</li>
		<li>次の孵化、1分間 560 x gでワームを遠心し、上清を除去します。</li>
		<li>Pbst; 600 μ L を追加し、余分な NR 染色を削除する 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>1分間 560 x gでサンプルを遠心し、上清の約 50 μ L を除くすべてを削除します。 注: NR インキュベーションでは、攪拌は必要ありません。このステップの間にワームのセトリングが一般的です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顕微鏡のスライドの準備<ol>
<li>残りの上清でワーム ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>顕微鏡のスライドのワーム懸濁液 5 μ L を置き、空気の泡を引っかけないように慎重に観察をつけます。</li>
		<li>ワームをイメージングする前にマニキュアで coverslip をシールします。</li>
		<li>一度にいくつかのスライドのみを準備します。これは NR 画像はサンプル間で一定となります。NR 染色画像の品質低下後 6 h 離散脂肪滴が観察することは困難と背景の蛍光性の増加、NR 信号検出を妨害します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR ステンド ワームのイメージング<ol>
<li>ビューのフィールドごとのいくつかの動物を捕獲する 5 倍の倍率でワームをイメージします。</li>
		<li>個々 のワームよりよい定量化の 10 倍の倍率に切り替えます。</li>
		<li>NR ステンド ワームをイメージして定量化のための最適の条件を決定する異なる露光時間 FITC/GFP チャネルを使用します。</li>
		<li>圧縮データを失うことを避けるために TIF 形式でファイルを保存します。 注: 典型的な露出時間の範囲は 100-1000 さんが最適な露出時間を過ごしてから、イメージの一貫性を維持するすべてのサンプルのためにそれを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 染色画像の定量化<ol>
<li>ImageJ に顕微鏡写真をアップロードします。プラグインのプルダウン ・ メニューで画像ファイルが認識されない場合バイオ フォーマット関数を使用します。</li>
		<li>スタック関数の下で、画像のプルダウン メニューには、いくつかの顕微鏡写真を比較すると、画像のスタックを作成するのに画像のスタックを使用します。</li>
		<li>同じプルダウン メニューで画像のスタックの明るさ/コントラストを調整し、適用をクリックしてすべての画像への変更を反映します。</li>
		<li>各イメージのワームを描く NR によって放射される蛍光強度を定量化し解析プルダウン メニューの下メジャー関数を使用して、多角形選択ツールを採用してください。</li>
		<li>各イメージの 5 つの背景の場所を測定し、平均バック グラウンド蛍光強度を計算します。</li>
		<li>N 式を使用して各イメージのワームからのバック グラウンド蛍光を引く G = (A B x)、N が純蛍光、総蛍光 G、合計ワーム領域の A と B の平均背景の蛍光性の略します。</li>
		<li>ワームのサイズによって蛍光強度を正規化するには、その総面積による各ワームの純蛍光を分割します。結果は、ピクセルあたり任意の単位 (a.u.) での蛍光強度として報告されます。 メモ: は、JPEG 形式で画像をエクスポートしないでください。圧縮はファイルを格納するより管理しやすい間、この形式でデータの整合性が損なわれます。すべての画像を変更するか、同じ分析とを確認します。異なる倍率でサイズを正しく評価するスケール バーを含めるようにしてください。ImageJ を用いた蛍光強度の違いをよりよく視覚化するには、8 ビット RGB から画像の種類を切り替え、イメージ ルックアップ テーブル (LUT) メニューから火を選択します。これは高められた蛍光強度と相関する輝度色が増加熱マップ イメージを作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. オイル赤 O 染色 (オロ) 脂質
<ol><li>オロ ストック溶液の調製<ol>
<li>250 mL のボトルに 100 mL 100% イソプロパノールにオロ パウダー 500 mg を追加、よく混ぜてね。</li>
		<li>準備が整うと、光の露出無しで密閉ソリューションを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ作業溶液の調製<ol>
<li>オロ 60% イソプロパノール (3:2) 水で原液を希釈します。</li>
		<li>使用前に 0.2 μ m 酢酸セルロースの滅菌注射器フィルターを通して作業オロ ソリューションをフィルターします。 注: 最高のソリューションの品質を前日作業オロ ソリューションを準備、一晩を混在させること。ただし、ソリューションが必要な同じ日の場合希釈し、使用前に少なくとも 2 時間ロッカーにオロ ソリューションをミックスします。ロッキング、前にオロ液漏れを避けるためにパラフィン テープで円錐管をラップします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ脂質染色のワームの準備<ol>
<li>線虫の成長媒体 (NGM) 後半ログ OP50 E. 大腸菌望ましいライフ ステージとシードに 20 ° C でワームを成長します。</li>
		<li>プレートに PBST 溶液 1 mL を追加し、すべてのワームがプレートをオフになるまで旋回します。プレートを傾けるし、pbst; 1 mL で洗います。ワームの懸濁液を 1.5 mL および microfuge の管に転送します。</li>
		<li>遠心 560 x gで 1 分間にワームは、ペレットと洗浄ステップ pbst; 1 mL で 3 回繰り返しを乱すことがなく上澄みを除去します。すべての培養上清が 100 μ L を削除します。</li>
		<li>ワーム ペレットに 40% イソプロパノールの 600 μ L を追加し、3 分間室温でロックします。</li>
		<li>ワームの餌を中断させることがなく 30 s と削除すべて培養上清中のgが 100 μ L x 560 でワームを遠心します。 注: は、高スループットの染色を行う場合、プレートをワームを洗浄するのに PBST の高いボリュームを使用します。ワーム pbst; サンプル固定する前に 15 分以上は洗浄しないでください。細菌の培養上清がクリアされない場合は、追加の洗浄を行います。Nutator やロッカーを使用して 40% イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプルの動揺が発生しているかどうかを確認するチューブを常に監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質染色オロ<ol>
<li>600 μ L オロ作業ソリューションを各サンプルに追加します。3 回チューブを反転し、オロにもワームをミックスします。</li>
		<li>室温で 2 時間 30 rpm でサンプルを回転させます。</li>
		<li>1分間 560 x gでサンプルを遠心し、すべて上澄みが 100 μ L を排除します。</li>
		<li>Pbst; 600 μ L のサンプルを再懸濁します、余分なオロ染色を削除する 30 分間 30 rpm でチューブを回転させます。</li>
		<li>560 × gで 1 分でサンプルを遠心し、上清を 50 μ l 添加以外のすべてを排除します。</li>
		<li>動物の生殖細胞や消化管細胞の場所を区別しやすく、1 μ L を追加することによって核を染色 (2-(4-amidinophenyl)-1 H-インドール-6-carboxamidine) (DAPI) オロ実用的なソリューションのすべて 1 ml。オロ染色 DAPI をイメージング用のスライドをマウントする前に追加すると 2 h を行います。腸の核は、サイズが大きいと、生殖腺は発展途上の生殖細胞によって区別されます。 注: オロ染色後、ワームがおよび microfuge の管の側面に付着、失敗は顕著なペレットを形成します。この場合、もう一度ワームを遠心分離機または少なくとも 10 分のために重力によって解決するワームを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージングのワームのためのスライドの準備<ol>
<li>残りの上清でワームを再懸濁します、ソリューションをよく混ぜます。</li>
		<li>顕微鏡のスライドのワーム懸濁液 5 μ L を入れて、気泡ではフォームないの確保、慎重に観察を配置します。</li>
		<li>マニキュアとイメージ ワーム coverslip をシールします。 注: 固定と染色の後ワームでき非常に堅いピペットにくい。これを回避するには、先端を切り落とすことによりワイドボア ピペットを確認します。</li>
		<li>染色後すぐにではなく、イメージング スライド 24 h まで 4 ° C でマイクロ遠心分離機ラックに格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ ステンド ワームのイメージング<ol>
<li>画像オロ ステンド ワームにカラー対応のカメラを使用します。</li>
		<li>5 倍の倍率を使用して、1 つのビューのフィールドのいくつかのワームをイメージします。</li>
		<li>個々 のワームのより良い検査のため 10 倍の倍率に切り替えます。</li>
		<li>圧縮によるデータの損失を避けるために TIF 形式の画像をエクスポートします。 注: オロ + DAPI 染色する場合は、蛍光を捉えることができますいずれかにカラー対応のカメラを切り替えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ ステンド ワームの画像解析<ol>
<li>ImageJ micrograph(s) にアップロードします。プラグインのプルダウン ・ メニューで画像ファイルが認識されない場合バイオ フォーマット関数を使用します。</li>
		<li>スタック関数の下で、画像のプルダウン メニューには、いくつかの顕微鏡写真を比較すると、画像のスタックを作成するのに画像のスタックを使用します。</li>
		<li>脂質小滴の可視性を改善するために同じプルダウン メニューの下の明るさ/コントラストを調整します。</li>
		<li>動物の体全体または特定の組織での脂質蓄積によると画像を分類します。</li>
		<li>脂質の局在化のより良い評価と ImageJ を用いた非固有のイメージ アイテムの識別のため、画像のプルダウン メニューの下色関数を選択し、RGB 各成分の信号を RGB にスタックをクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

肥満および代謝性疾患の率の上昇は、細胞や組織の脂肪蓄積を調節する機構を研究対象に適したモデルを線虫になります。最近の証拠は、脂質レベルの変化がインスリン シグナル8、ホルモン受容体2、生殖出力5への活性化に至る細胞プロセスに関連付けられることを示唆しています。ラベル無料顕微鏡とクロマト グラフ法、ナイルの赤と油に比べて赤 O は、一貫して中性脂質はワームを染色する比較的安価な染料と再現性をもって10,12,13。最初は、2 番目の下皮、腸、生殖細胞など組織のなかの脂質分布の評価を容易にしながら総脂質レベルの定量化のためことができます。組み合わせて使用するとき、黄金の NR は研究者が遺伝子型と環境の変化が脂質蓄積に与える影響し、ワームのどこにこれらの変更が発生して判断するを有効にします。</p...

脂質は、生命に不可欠です。膜の不可欠なコンポーネント、二次メッセンジャーとして機能し信号のトランスデューサー、エネルギー貯蔵に重要な機能を持っています。脂質代謝が調節不全、肥満、II 型糖尿病、公衆衛生の懸念9を押しているような病気に します。線虫(線虫) 比較的短いライフ サイクル、透明体、知られている細胞系統、完全に配列されたゲノムをもっているために、脂質の代謝を研究するためのエクセレント モデル生物であります。両性具有者に主にc. の elegansは、要するに持ち帰り高スループット転送遺伝子スクリーニング遺伝子経路の代謝4の広い配列を勉強する時間の期間の同質の動物の数が多いを高めるために研究者をことができます。このアプローチは、273線虫脂質代謝遺伝子ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエにおける保全の高度を明らかにしました。さらに、線虫の以上 300 の脂質遺伝子人間第オーソロガス メタボリック シンドローム11に関係のない病気に関連付けられているがあります。伝統的に、線虫脂質ストレージの検討が主染料ラベルのアッセイは、脂質蓄積に関する信頼性の高い情報を提供にしていました。あまり一般的は、組織全体で脂質がローカライズして豊富な脂質の測定の違いの説明です。しかし、最近の作品では脂質分布を脂質蓄積6と同じくらい重要にすることができることを明らかにしました。
最近は、高性能液体クロマトグラフィー質量分析 (高速液体クロマトグラフィー-MS)、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS) などの方法を統合する研究を始めているし、コヒーレント反ストークス アドレスにラマン散乱 (CARS) 顕微鏡、脂質抽出物、特定の脂質画分および脂質堆積物、それぞれ10,11の内容を直接分析することによって汚れ・ ベース ・ アプローチの欠点。さらに、CARS 顕微鏡ではナイルの赤は、脂肪蓄積オフのターゲット自動蛍光細胞小器官10の染色につながる重要な汚れとの使用のため定着性色素として使用する場合のプロキシとして使用できますを明らかにしました。ただし、これらのクロマトグラフィーに関連する必要な技術的な専門知識とコスト、顕微鏡検査方法の使用多くの研究質問理不尽。この記事ではこだわると線虫ナイルの赤を使用して中性脂質沈着汚れし、オイル赤 O の脂質豊富な全動物と特定の組織を区別するために便利で信頼性の高い方法をについて説明します。
ナイルの赤、9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one、benzophenoxazone 染料容易に様々 な有機溶剤に溶解するが、主水に溶解されていません。それは優秀な lysochrome 色素中性脂質トリグリセリドなどを染色するために使用またはコレステロール エステルそれは強い色を特徴とするので可溶性脂質で、周囲の組織とのごくわずかな相互作用よりも溶剤に難溶です。脂質。450-500 と 520 の nm、それぞれ1の励起・発光極大値があります。離散脂質体の腸や他の組織の中でいずれかのクラスターを観察または動物の遺伝子型または実験的な治療によって、均等に分散できる蛍光グリーンのナイルの赤はc. の elegansをステンド グラスを見ると、7。
オイル赤 O、lysochrome、トリグリセリド、リポタンパク質を染色に使用される脂溶性の色素です。アゾ染料は、その化学構造に 3 つの芳香環に接続されている 2 つのアゾ基が含まれているために呼び出されます。それは、イオン化することは困難非常に脂質に溶けるがレンダリングをします。その汚れの色は赤く、その光吸収最大は 518 nm 3。線虫は、オイル赤い O ショー異なったティッシュ6脂質分布の定性的な評価を容易に動物の透明体に対して際立つ赤脂質液滴と汚れます。

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m 顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>n/a</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>ERC5sカメラ</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>カラー対応</td></tr><tr><td>MRmカメラ</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>蛍光対応</td></tr><tr><td>ナイルレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>N1142</td><td>脂質染色</td></tr><tr><td>オイルレッド O</td><td>アルファ エーザー</td><td>A12989</td><td>脂質染色</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーD1306</td><td>DNA染色</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>固定液</td></tr><tr><td>0.2 &micro;m seterileシリンジ</td><td>フィルターVWR</td><td>28145-477</td><td>セルロースアセテートフィルター</td></tr><tr><td>遠心分離機 5430</td><td>エッペンドルフ</td><td>5428000015</td><td>遠心分離</td></tr>機<tr><td>シェーカー ロティサリー</td><td>ラボ 地震</td><td>400110Q</td><td>シェーカー</td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>ローテーター</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>細菌の増殖</td></tr></tbody></table>

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 o 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

線虫脂質代謝・ エネルギー代謝を研究するための特別なモデル生物であります。その脂質の遺伝子の多くは人間には維持され、メタボリック シンドロームまたはその他の疾患に関連付けられています。この生物における脂質蓄積の検討は定着性染料またはラベル自由な方法で実施できます。定着性の汚れはナイル川のように赤いとオイル赤 O の脂質レベルを定量的に測定し、質的、組織間でそれぞれ脂質分布を観察する安価な信頼性の高い方法があります。さらに、これらの汚れ各種の脂質代謝遺伝子および細道の高速スクリーニングを可能にします。また、疎水性性質は、脂溶性を容易に、周囲の組織との相互作用を減らす溶媒に解離を防ぐことができます。これらのメソッドは一般的な脂質含量を調べることで効果的なしかし、化学組成と脂質堆積物の多様性の詳細については行いません。これらの目的は、GC-MS と車の顕微鏡などラベル自由な方法がより適していますな、コストにかかわらず。

SKN 1 は bZip 胃酸転写因子 NRF2 の哺乳類と相同を共有して脂肪酸酸化を仲介することが示されています。彼らの食事療法のグルコース濃度に応じて恒常活性skn 1の対立遺伝子を持つワームはナイルの赤7と異なる脂質レベルを表示します。図 1A-C活性skn 1動物脂質レベルを上げることにつながる条件にさらされているを示しています。腸に沿って顕著な FITC/GFP チャネルを使用してキャプチャした NR 蛍光が頭、尾、そして消化管内腔に調光器脂質レベル増加に伴い、NR ステンド離散的な粒子が低い露光時間が余儀なくされるかもしれませんより、検知しにくいです。このメソッドは、脂質蓄積の定量的プロキシとして蛍光強度を使用するがそれは脂肪質の店ではない細胞の構造の非特異的染色を区別する適切な腸管自動から混信しやすい蛍光。したがって、代替ラベルおよび非ラベル メソッド使わなければなりません並列に<s...

ナイルの赤固定線虫の染色は、組織中の脂質分布の定性的な評価を容易にオイル赤 O 染色中性脂質堆積物の定量的測定法です。

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

これらの染色法の全体的な目標は、細胞内脂質の存在量を定量化し、異なる組織間の脂質分布を評価することです。この方法は、脂質が遺伝的および生化学的にどのように制御されているか、これが脂質の恒常性を調節する疾患状態など、脂質代謝における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、比較的簡単で安価に実行できることです。ナイルレッド脂質染色を行うには、線虫増殖培地またはNGMでプレートワームを後期丸太OP50大腸菌で播種し、摂氏20度でワームをL4初期に増殖させます。ワームを1ミリメートルのPBST溶液で洗浄し、ワーム懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。線虫を重力の560倍で1分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、大腸菌が懸濁液から除去されるまでPBST洗浄を繰り返します。次に、ワームペレットに100マイクロリットルの40%イソプロパノールまたは60%のORO染色を加え、サンプルを室温で3分間インキュベートします。イソプロパノールの添加は、染色前の線虫の適切な透過処理に重要です。重力の560倍で1分間ワームを遠心分離し、ワームペレットを乱さずに上清を取り除きます。遠心分離ステップ中の光への曝露を最小限に抑えることが重要です。次に、暗闇の中で、事前に調製した600マイクロリットルのNRワーキング溶液を各サンプルに加えます。チューブを3回反転させ、ウォームと溶液を完全に混合します。その後、サンプルを暗所で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ワームを遠心分離し、上清を取り除きます。次に、600マイクロリットルのPBSTを加え、サンプルを暗所で30分間インキュベートして、余分なNR染色を取り除きます。前回と同様にサンプルを再度回転させた後、約50マイクロリットルの上清を除くすべての上清を取り除き、残りの溶液にワームペレットを再懸濁します。イメージング用のスライドを準備するには、5マイクロリットルのウォーム懸濁液を顕微鏡スライドにピペットで固定し、気泡が閉じ込められないようにカバースリップを慎重に塗布します。FITC GFPチャンネルを使用してNR染色された線虫を画像化し、さまざまな露光時間を試して、線虫を5倍の倍率で画像化して、視野ごとに複数の動物を撮影します。その後、10倍の倍率に切り替えて、個々の線虫の定量を改善します。画像を定量化するには、顕微鏡写真をImageJにアップロードします。画像のプルダウンメニューで、画像デッキの明るさ、コントラストを調整し、[適用]をクリックしてすべての画像に変更を反映させます。ポリゴン選択ツールを使用して、画像化された各ワームを描写し、分析プルダウン メニューで測定機能を使用して、NR が放出する蛍光強度を修飾します。各画像について、5つの背景位置を測定し、平均背景蛍光強度を計算します。各サンプルに600マイクロリットルのオイルレッドOまたはORO作業溶液を追加し、チューブを3回反転させて、ワームとOROをよく混合します。サンプルを30RPMで回転させ、RTで2時間回転させます。サンプルを重力の560倍で1分間遠心分離し、100マイクロリットルを除くすべての上清を吸引します。次に、600マイクロリットルのPBSTを使用してサンプルを再懸濁し、チューブを30 RPMで30分間回転させて、余分なORO染色を除去します。腸細胞内の動物の生殖細胞系の位置をよりよく区別するには、OROワーキング溶液1ミリリットルごとに1マイクロリットルのDAPIを追加して核を染色します。次に、イメージング用のスライドを準備するために、ワームと残りの上清を再懸濁し、溶液をよく混合します。5マイクロリットルのウォーム懸濁液を顕微鏡スライドに置き、気泡が形成されないようにカバースリップを慎重に塗布します。OROで染色された線虫を画像化するには、5倍の倍率でカラー対応カメラを使用して、1つの視野で複数の線虫を画像化します。次に、10倍の倍率に切り替えて、個々の線虫をよりよく調べます。最後に、画像をImageJにアップロードし、テキストプロトコルに従って画像デッキを作成した後、動物の体全体または特定の組織における脂質の蓄積に従って画像を分類します。SKN-1は哺乳類のNrf2と相同性を共有しており、脂肪酸酸化を媒介することが示されています。この図は、脂質レベルの上昇につながる条件に曝露された活性化SKN-1動物を示しています。これらの画像に見られるように、FITC GFPチャネルを使用して捕捉されたNR蛍光は腸に沿って目立ちますが、頭、尾、腸管腔では暗くなっています。年齢依存性体細胞脂肪減少症またはASDFの有無によって線虫を分類するのは簡単ですが、中程度の脂肪減少を持つ動物を特定するのは難しい場合があります。全身に真っ赤な染色が見られ、半透明の領域がほとんどない非ASDF動物と比較して、ASDFワームは腸細胞の脂肪減少が顕著です。ASDFを発症する過程にある動物は、脂肪の減少の大部分が最終的に発生する半透明の斑点を示すことがよくあります。さらに、ASDFワームは、表現型が完全な体細胞脂肪の減少によって定義されるのではなく、非老化動物と比較して広範な脂肪の減少によって定義されるため、頭と尾の領域に明るい赤色の染色を特徴とする可能性があります。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、3時間プラスイメージング時間で行うことができます。この手順を試行する際は、染色の30分以内に線虫を洗浄して透過処理することを忘れないでください。この手順に続いて、CARS顕微鏡などの他の方法を実行して、各技術が特定する脂質種の種類を比較し、特定の種類の問題にどの方法がより適しているかを判断できます。このビデオを見れば、ナイルレッドとオイルレッドO染色を使用して線虫の脂質を定量化し、脂質分布を評価する方法と、ImageJ顕微鏡写真分析の方法を十分に理解できるはずです。

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