脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

これらの染色法の全体的な目標は、細胞内脂質の存在量を定量化し、異なる組織間の脂質分布を評価することです。この方法は、脂質が遺伝的および生化学的にどのように制御されているか、これが脂質の恒常性を調節する疾患状態など、脂質代謝における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、比較的簡単で安価に実行できることです。

ナイルレッド脂質染色を行うには、線虫増殖培地またはNGMでプレートワームを後期丸太OP50大腸菌で播種し、摂氏20度でワームをL4初期に増殖させます。ワームを1ミリメートルのPBST溶液で洗浄し、ワーム懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。線虫を重力の560倍で1分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、大腸菌が懸濁液から除去されるまでPBST洗浄を繰り返します。次に、ワームペレットに100マイクロリットルの40%イソプロパノールまたは60%のORO染色を加え、サンプルを室温で3分間インキュベートします。イソプロパノールの添加は、染色前の線虫の適切な透過処理に重要です。

重力の560倍で1分間ワームを遠心分離し、ワームペレットを乱さずに上清を取り除きます。遠心分離ステップ中の光への曝露を最小限に抑えることが重要です。次に、暗闇の中で、事前に調製した600マイクロリットルのNRワーキング溶液を各サンプルに加えます。

チューブを3回反転させ、ウォームと溶液を完全に混合します。その後、サンプルを暗所で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ワームを遠心分離し、上清を取り除きます。

次に、600マイクロリットルのPBSTを加え、サンプルを暗所で30分間インキュベートして、余分なNR染色を取り除きます。前回と同様にサンプルを再度回転させた後、約50マイクロリットルの上清を除くすべての上清を取り除き、残りの溶液にワームペレットを再懸濁します。イメージング用のスライドを準備するには、5マイクロリットルのウォーム懸濁液を顕微鏡スライドにピペットで固定し、気泡が閉じ込められないようにカバースリップを慎重に塗布します。

FITC GFPチャンネルを使用してNR染色された線虫を画像化し、さまざまな露光時間を試して、線虫を5倍の倍率で画像化して、視野ごとに複数の動物を撮影します。その後、10倍の倍率に切り替えて、個々の線虫の定量を改善します。画像を定量化するには、顕微鏡写真をImageJにアップロードします。

画像のプルダウンメニューで、画像デッキの明るさ、コントラストを調整し、[適用]をクリックしてすべての画像に変更を反映させます。ポリゴン選択ツールを使用して、画像化された各ワームを描写し、分析プルダウン メニューで測定機能を使用して、NR が放出する蛍光強度を修飾します。各画像について、5つの背景位置を測定し、平均背景蛍光強度を計算します。各サンプルに600マイクロリットルのオイルレッドOまたはORO作業溶液を追加し、チューブを3回反転させて、ワームとOROをよく混合します。

サンプルを30RPMで回転させ、RTで2時間回転させます。サンプルを重力の560倍で1分間遠心分離し、100マイクロリットルを除くすべての上清を吸引します。次に、600マイクロリットルのPBSTを使用してサンプルを再懸濁し、チューブを30 RPMで30分間回転させて、余分なORO染色を除去します。

腸細胞内の動物の生殖細胞系の位置をよりよく区別するには、OROワーキング溶液1ミリリットルごとに1マイクロリットルのDAPIを追加して核を染色します。次に、イメージング用のスライドを準備するために、ワームと残りの上清を再懸濁し、溶液をよく混合します。5マイクロリットルのウォーム懸濁液を顕微鏡スライドに置き、気泡が形成されないようにカバースリップを慎重に塗布します。

OROで染色された線虫を画像化するには、5倍の倍率でカラー対応カメラを使用して、1つの視野で複数の線虫を画像化します。次に、10倍の倍率に切り替えて、個々の線虫をよりよく調べます。最後に、画像をImageJにアップロードし、テキストプロトコルに従って画像デッキを作成した後、動物の体全体または特定の組織における脂質の蓄積に従って画像を分類します。

SKN-1は哺乳類のNrf2と相同性を共有しており、脂肪酸酸化を媒介することが示されています。この図は、脂質レベルの上昇につながる条件に曝露された活性化SKN-1動物を示しています。これらの画像に見られるように、FITC GFPチャネルを使用して捕捉されたNR蛍光は腸に沿って目立ちますが、頭、尾、腸管腔では暗くなっています。

年齢依存性体細胞脂肪減少症またはASDFの有無によって線虫を分類するのは簡単ですが、中程度の脂肪減少を持つ動物を特定するのは難しい場合があります。全身に真っ赤な染色が見られ、半透明の領域がほとんどない非ASDF動物と比較して、ASDFワームは腸細胞の脂肪減少が顕著です。ASDFを発症する過程にある動物は、脂肪の減少の大部分が最終的に発生する半透明の斑点を示すことがよくあります。

さらに、ASDFワームは、表現型が完全な体細胞脂肪の減少によって定義されるのではなく、非老化動物と比較して広範な脂肪の減少によって定義されるため、頭と尾の領域に明るい赤色の染色を特徴とする可能性があります。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、3時間プラスイメージング時間で行うことができます。この手順を試行する際は、染色の30分以内に線虫を洗浄して透過処理することを忘れないでください。

この手順に続いて、CARS顕微鏡などの他の方法を実行して、各技術が特定する脂質種の種類を比較し、特定の種類の問題にどの方法がより適しているかを判断できます。このビデオを見れば、ナイルレッドとオイルレッドO染色を使用して線虫の脂質を定量化し、脂質分布を評価する方法と、ImageJ顕微鏡写真分析の方法を十分に理解できるはずです。