マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

この方法は、腎線維症やその他のさまざまな腎症の発症と密接に関連している脂肪酸酸化など、腎代謝に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ハイスループットプラットフォームを使用して、腎尿細管上皮細胞のミトコンドリア生体エネルギーを調節する化合物をスクリーニングすることです。この技術の意味は、腎上皮細胞のミトコンドリア代謝を調節する化合物の高濃度スクリーニングを可能にするため、腎代謝性疾患の治療にまで及びます。

コラーゲンコーティングされた60mmシャーレを調製するには、事前にろ過した20ミリモル酢酸を2ミリリットル加え、続いて35マイクロリットルのコラーゲンI溶液を各ディッシュに加えます。その後、プレートを室温で1時間インキュベートし、風乾してUVにさらします。次に、PBSを使用して酢酸残基を洗い流します。3回のすすぎを行います。

次に、皿を摂氏37度の二酸化炭素を含まない細胞培養インキュベーターに保管します。マウスの手術の準備をした後、脱毛クリームを使用して胸部と腹部から毛皮を取り除きます。その後、ヨウ素で皮膚を消毒し、ヨウ素の残留物を拭き取ります。

次に、腹腔を開くために切開を行い、心臓と腎臓を露出させます。次に、毎分32ミリリットルで灌流ポンプをセットアップし、灌流を開始する前にチューブ内の気泡を取り除きます。ラインの最後に27ゲージの針を使用します。

続行するには、心臓の頂点から左心室に針を挿入します。バッファーが心臓を満たしたらすぐに、右心房に穴を開けて、灌流バッファーの出口を作成します。次に、分解バッファーに切り替え、分解のためにポンプ速度を毎分30ミリリットルにわずかに下げます。

20ミリリットルの消化緩衝液を灌流した後、尿細管細胞を分離するために両方の腎臓を取り出します。採取した腎臓を処理するには、まず、腎カプセルと髄質を取り出します。次に、両方の腎臓を細かく刻み、摂氏37度のオーブンで10ミリリットルの消化緩衝液に5分間穏やかに回転させてインキュベー

消化後、バッファーを70ミクロンのフィルターに通して、未消化の組織をすべて取り除きます。消化された組織を採取した後、10ミリリットルの培地を加えて消化を止めます。次に、ろ過した組織懸濁液を50gで5分間遠心分離し、管状細胞をペレット化します。

次に、上清を新しいチューブに移し、5ミリリットルの培養培地を加え、遠心分離を繰り返して残りの管状細胞を回収します。次に、最初のペレットを20ミリリットルの培養培地に再懸濁し、50 gで5分間遠心分離して、収集した細胞をさらに精製します。上清を処分します。.

次に、両方のペレットを10ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、トリパンブルー染色を用いて生細胞をカウントします。次に、60ミリメートルのコラーゲンコーティングされた皿に最大1,000万個の細胞を播種し、管状細胞を一晩接着させます。

まず、コラーゲンでコーティングされた新たに調製した96ウェルマイクロプレートのウェルに、40, 000個の細胞でP1尿細管細胞を播種します。ウェルあたり100マイクロリットルの培地を使用してください。細胞外フラックスアッセイにおける細胞密度と化合物濃度の最適化は、実験を成功させるための鍵です。

最適な細胞密度と化合物濃度を特定するために、パイロット滴定実験をお勧めします。次に、センサーカートリッジをハイドレートします。まず、センサーカートリッジを持ち上げ、プレートの各ウェルに200マイクロリットルのキャリブレーション溶液を充填します。

次に、カートリッジの位置を変えてセンサーを水没させ、アセンブリを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、古い培地を吸引し、175マイクロリットルのグルコースまたは脂肪酸アッセイ培地と交換します。その後、二酸化炭素なしで1時間インキュベーションを続けます。

細胞インキュベーション中に、カートリッジのポートAに25マイクロリットルのオリゴマイシンをロードし、ポートBにFCCPをロードし、ポートCにロテノン/アンチマイシンAをロードし、ポートDおよび他のすべてのポートに水をロードします。次に、セットアップのキャリブレーションの準備ができるまで、カートリッジを二酸化炭素を含まないインキュベーターに保管します。細胞外フラックス分析装置とコントローラーの電源を入れて進めます。

次に、Analyzer Softwareを開き、標準アッセイを選択して、Assay Wizardオプションを押します。次に、[Compounds] タブで、コンパウンドを適切なポートに割り当てます。[Background Correction] タブで、セルが含まれていないウェルを選択します。

次に、[グループとラベル] タブを使用して、実験グループにラベルを付けます。次に、[Protocol]タブで、使用可能なコマンドを使用して適切な混合サイクルと測定サイクルを設定します。これらの設定はテキストプロトコルで示され、入力されたら、後で使用するためにテンプレートを保存します。

次に、[ウィザードの終了]を押して続行します。次に、[開始]を押してキャリブレーションを開始します。次に、アナライザーはプレートホルダーを排出し、カートリッジプレートを挿入するように促します。

このキャリブレーション プロセスが完了するまでに 20 分から 25 分かかります。システムがキャリブレーションされたら、プロンプトコマンドを押してキャリブレーションプレートをセルプレートに交換し、実行を続行します。実行が完了したら、OCRデータを保存し、プレートをアナライザーから取り外します。

次に、各アッセイウェルにHoechstを添加し、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、355ナノメートルの励起と460ナノメートルの放射を使用して細胞をカウントし、OCRデータを細胞数に正規化します。このプロトコールでは、腎臓細胞、不完全に消化された尿細管、およびその他の組織破片の不均一な集団をコラーゲンコーティングプレート上で培養しました。

単離の翌日、培養培地を遠心分離して破片を除去し、尿細管細胞を再播種しました。その後、細胞はより容易に付着し、培養5日目までに、細胞は80〜90%のコンフルエント度になりました。その後、腎臓のTECを継代培養し、1週間以内にコンフルエントに成長させました。

同様の成長は、次の2つの航海で起こりました。細胞の単層はドーム状になり、プレートから持ち上げられ、タイトジャンクションによって結合したままになります。単離された一次TECのミトコンドリア呼吸は、記載されているように、さまざまなめっき密度でのOCRの記載された細胞外フラックス分析を使用して測定されました。

ウェルあたり40,000個の細胞が他のどのめっき密度よりもプレートの表面をよりよく覆っていたため、細胞と化合物との間の相互作用をテストするのに最適な濃度となった。例えば、脂肪酸基質を含む培地を解糖系阻害剤である2DGとともにTECに適用し、1番と2番のTECにおける脂肪酸酸化を直接評価しました。

この手順を試行する際は、各ウェルの正確な量と濃度を常に記録しておくことが重要です。成分の最終濃度が変化すると、実験全体が失敗する可能性があります。その開発後、この技術は、腎臓学分野の研究者がさまざまな腎症の病因における尿細管脂肪酸代謝の役割を探求する道を開くでしょう。