Name: 腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: 学ぶプロテインキナーゼCアイソザイムの過剰発現法を用いた腎近位尿細管細胞におけるミトコンドリア機能と細胞生存率の評価手法。この方法は腎疾患治療標的の探索に有用である。

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この作品は、米国国立衛生研究所、国立糖尿病の研究所および消化器腎臓病、2R01DK59558（GNへの）からの助成金によってサポートされていました。研究資源助成UL1 RR029884のための健康のナショナルセンターの国立研究所によってサポートUAMSトランスレーショナル·リサーチ研究所がUAMSでフローサイトメトリーコアの部分的な資金を提供した。私たちは感謝博士Peipei平（カリフォルニア大学ロサンゼルス校、ロサンゼルス、カリフォルニア州）のcDNAのPKC-εと博士アレンSamarel（ロヨラ大学医療センターのドミナントネガティブ（非アクティブ）の変異体コーディング運ぶアデノウイルスのアリコートを提供するため; PKC-εの恒常的活性変異体をコードするアデノウイルスベクターのアリコートを提供するためのメイウッド、イリノイ州）。我々はまた、博士に感謝します。 PKC-ε恒常的活性をコードするcDNAを提供するためのピーター·パーカーとピーターサグデン（インペリアル·カレッジ·ロンドン、ロンドン、英国）。

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
<li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C%2C+Ras+plays+multiple+roles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li>
<li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B5+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li>
<li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ERK1%2F2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li>
<li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li>
<li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B1+and+ERK1%2F2+mediate+mitochondrial+dysfunction%2C+decreases+in+active+Na%2B+transport%2C+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li>
<li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-%281%2C2-dichlorovinyl%29-L-cysteine+injury+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li>
<li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+functional+p21WAF1%2FCIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで紹介する手法は、腎近位尿細管細胞の初代培養におけるPKCの個々のアイソザイムの過剰発現を可能にします。このアプローチにはいくつかの長所があります：1。それは様々な侮辱（虚血、低酸素、酸化ストレス）、薬、腎臓内nephrotoxicantsのための第一の目標である細胞（腎近位尿細管細胞）の均一な集団での調節機構を調査することができます。 2。改良された条件で初代培養で増殖させたRPTC の in vitroモデルで、この内のミトコンドリア機能がin vivoで腎近位尿細管のミトコンドリアの機能に似ています。1,2 3。 in vitroモデルでは、この内の別の毒物にミトコンドリアの応答はin vivoでの腎近位尿細管の反応に似ています。 4。このアプローチでは、シグナル伝達mechaniに関与するタンパク質を含む、特定のタンパク質をコードする遺伝子の効率的なトランスフェクションおよび送達を可能にするミトコンドリアの機能を調節するSMS。したがって、このモデルでは、キナーゼとホスファターゼの恒常的活性および...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>層流フード</td><td>サーモエレクトロン株式会社</td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2ミリリットルと15ミリリットルのダウンス組織グラインダー</td><td> WHEATON </td><td> 989から24607、357544 </td></tr><tr><td> 85〜235ミクロンのナイロンメッシュ</td><td>小型部品</td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50ミリリットル滅菌遠心管</td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 mlマイクロチューブ</td><td>ザルスタット</td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mmの無菌培養皿</td><td>コー​​ニング</td><td> 430165 </td></tr><tr><td>ジョアン遠心機</td><td>ジョアン</td><td>ジョアンCR3 11175704ローター：ジョアンT40 </td></tr><tr&gt; <td>調整可能なマイクロ遠心</td><td> SIGMA </td><td>モデル1から15 </td></tr><tr><td>生物学的酸素モニタ</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> YSIモデル5300A </td></tr><tr><td>シングルチャンバマイクロ酸素システム</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5356S </td></tr><tr><td>酸素プローブ</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5331A </td></tr><tr><td>循環バス</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KClおよび標準メンブレンキット</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5775 </td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td> YSI Incorporatedの</td><td> 5222 </td></tr><tr><td>フラットベッドレコーダー</td><td>キップ＆Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48ウェルと96ウェル透明板</td><td>コスター</td><td> 3548、3679 </td></tr><tr><td>サーモR </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td>オービタルシェーカーMAXQ 2000 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td>スペクトルFLUORプラス（吸光/蛍光/発光リーダー） </td><td>テカン</td><td> F129005 </td></tr><tr><td>ウォータージャケット米国オートフロー自動CO 2インキュベーター</td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td>フローサイトメトリー用の12x75 mmのポリスチレン培養試験管</td><td>フィッシャーブランド</td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop 水浸対物レンズ63X / 0,90 W </td><td>カールツァイス</td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12キー</td><td> Cellgro </td><td> 99から830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12のハム</td><td>シグマ</td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td>メシル酸デフェロキサミン</td><td> HospiRA </td><td> D110 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプI </td><td>ワージントン</td><td> 4196 </td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>シグマ</td><td> T 6522 - 500mgの</td></tr><tr><td> 5,5 &#39;、6,6&#39; - テトラクロロ-1,1 &#39;、3,3&#39; - tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineヨウ（JC-1） </td><td>インビトロジェン</td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker赤</td><td>インビトロジェン</td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATPの生物発光アッセイキットHS II </td><td>ロッシュ</td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td>アネキシンV - FITCソリューション</td><td>バイオビジョン</td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Biosciences社</td><td> BD FACSキャリバー</td></tr></tbody></table>

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼcアイソザイム

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

アイソザイムのプロテインキナーゼC（PKC）ファミリーは多数の生理学的および病理学的プロセスに関与している。我々の最近のデータは、PKCは、ミトコンドリアの機能と細胞のエネルギー状態を調節していることを実証している。多数の報告は、PKC-αおよびPKC-εの活性化は虚血性心とを仲介する心保護におけるミトコンドリア機能を改善することを実証した。対照的に、我々は、PKC-α、PKC-εは腎細胞でnephrotoxicant誘発性ミトコンドリア機能障害や細胞死に関与していることを明らかにした。したがって、本研究の目的は、PKCアイソザイムを選択的に活性化または酸化的リン酸化と細胞生存の制御に果たす役割を決定するために阻害されるおそれのある積極的なミトコンドリアの機能を維持する腎細胞のin vitroモデルを開発することであった。腎近位尿細管細胞（RPTC）の初代培養は水戸のミトコンドリア呼吸と活動の結果改善された条件で培養したin vivoでの RPTCと同様chondrial酵素。伝統的なトランスフェクション技術（リポフェクタミン、エレクトロポレーション）は初代培養において非効率的であり、ミトコンドリアの機能に悪影響を及ぼすので、PKC-ε変異体cDNAをアデノウイルスベクターを介しRPTCに届けられました。 90％を超える培養R​​PTCのトランスフェクションでは、このアプローチは結果。 1：ここでは、におけるPKC-εの役割を評価するための方法を提示します。 ATP合成に関連付けられているミトコンドリアの形態と機能の調節、および2。初代培養におけるRPTCの生存。 PKC-εが過剰発現している恒常的に活性化、PKC-ε突然変異体によって活性化される。 PKC-εは、過剰発現することにより、PKC-εの不活性変異体を阻害される。ミトコンドリア機能は、呼吸、呼吸鎖の完全性、呼吸複合体およびF 0 F 1-ATPアーゼ、ATPの生産速度、およびATP含量の活動を調べることで評価される。呼吸がある状態3（過剰基質およびADPの存在下で最大呼吸）と非結合呼吸としてジギトニン透過性RPTCにssessed。呼吸鎖の完全性は、単離されたミトコンドリアの呼吸鎖のすべての4つの複合体の活性を測定することにより評価される。酸化的リン酸化の容量は、ミトコンドリア膜電位、ATPの生産速度、およびF 0 F 1-ATPaseの活性を測定することによって評価されます。 RPTCのエネルギー状態は、細胞内ATP含量を測定することにより評価されています。生きた細胞内のミトコンドリアの形態はMitoTracker赤580、具体的にミトコンドリアに蓄積蛍光染料、およびライブ単層蛍光顕微鏡で調べたを用いて可視化されています。 RPTC生存率は、アネキシンV /アポトーシスと腫瘍症を決定するために、フローサイトメトリーに続いてヨウ化プロピジウム染色を用いて評価されています。 これらの方法は、個々のPKCアイソザイムの選択的活性化/阻害を可能にin vitroで再生することができる生理学的、病理学的条件の様々な細胞機能における役割を評価した。

Figure 1に示すとおりのアデノウイルスデリバリーRPTCとミトコンドリアにおけるPKC-εの大幅に増加したタンパク質レベルにおけるPKC-ε結果の恒常的活性（caPKC-ε）と非アクティブ（dnPKC - ε）変異体をコードするcDNA。細胞が不活性であったcDNAコードdnPKCを過剰発現- εPKC-ε（リン酸化されていない）（ 図1）に感染したのに対し、caPKC-εベクターを有するcDNAを感染させた細胞は、PKC-εのリン酸化（活性）フォームを過剰発現させた。アクティブ、PKC-εの存在は関係なく非アクティブ、PKC-εは何の効果（ 図2）がなかったのに対し、ミトコンドリア活性化するために使用される基板のRPTCでミトコンドリアの呼吸を減少させた。呼吸鎖内でアクティブに、PKC-εのターゲットを決定するために、我々は呼吸鎖の全ての酵素複合体の活動を決定した。 図3に示すように、 </sチョン·&gt;、複合体IとRPTCにおける複雑なIVのPKC-ε削減活動の活性化が、複合体IIと複合...

呼吸と酸化的リン酸化により、細胞生存率に関連するミトコンドリア機能に対するプロテインキナーゼC（PKC）アイソザイムの活性化の効果を説明する。アプローチは、選択的に初代細胞培養や細胞のミトコンドリアの機能とエネルギー状態を決定するために種々のアッセイにおけるPKCアイソザイムを過剰発現するアデノウイルスの手法を適応します。

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

プロテインキナーゼC（PKC）ファミリーのアイソザイムは、数多くの生理学的および病理学的プロセスに関与しています。我々の最近のデータは、PKCが……であることを示しています。

本実験では、プロテインキナーゼC（PKC）のアイソフォームを選択的に調節し、さまざまな生理学的および病理学的条件下における腎近位尿細管細胞でのミトコンドリアおよび細胞機能を決定します。まず、腎皮質から一次腎近位尿細管細胞を分離するか、あるいは腎近位尿細管と同様の酸化代謝能を有するRPCsを分離します。アデノウイルスベクターを用いて、活性型および不活性型 protein kinase C epsilon の両方を発現させ、RPCsを感染させます。その後、さまざまなミトコンドリア機能と細胞生存率を測定し、ATP合成能および細胞死抑制能に対する当該酵素の影響を評価します。また、細胞溶解液を用いて、リン酸化 protein kinase C epsilon のイムノブロット解析を実施します。結果から、プロテインキナーゼεの活性化がミトコンドリアのATP生成能を負に調節し、細胞内のATPレベルおよび腎近位尿細管細胞の生存能を低下させることが示されました。細胞株などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、腎近位尿細管細胞の初代培養が、腎近位尿細管の分化機能と酸化能を維持している点にあります。プロテインキナーゼは標的および潜在的な治療薬として利用可能であるため、本手法の意義は、腎障害の予防や障害後の腎機能回復の促進といった治療へと広がります。この手法により、損傷と回復のメカニズムを解明することができます。また、新鮮に単離したウサギ腎臓を、50 mLずつの滅菌D-M-E-M-F 12培地、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）、およびPBS酸化鉄溶液で順次処理し、各腎臓の皮質を回収する場合などに適用可能です。まず、15 mLダウンホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズします。次に、ホモジネートを2枚の滅菌メッシュシープに通して、1 Lの滅菌ビーカーに回収します。シープ上に残った細胞を、デフェロキサミン含有バッファーで洗浄します。底部に残っている組織をすべて、コニカルチューブに入れた40 mLのデフェロキサミン含有バッファーに、85 µmのセーバーを用いて移します。強力磁石を用いて、細胞懸濁液を静かに混合します。鉄で充填された糸球体を回収し、マグネットに付着した鉄を吸引します。細胞懸濁液の容量を 40 milliliters に調整し、コラゲナーゼを含む消化培地を 1 milliliter 加えます。室温で 17 minutes インキュベートします。懸濁液を静かに混ぜ合わせます。数回の洗浄後、4°Cで50×gにて2分間遠心分離し、細胞を回収します。細胞ペレットを、グルコースを含まない46 mLの培地に再懸濁します。一次RT PCを、1ディッシュあたり1 mgのタンパク質密度で、2 mLのグルコースフリーD-M-E-M-F 12培地を用い、オービタルシェーカーを用いて37 °C、5% carbon dioxide条件下で培養します。培地を補充した後、コンフルエントになったRPT細胞に、恒常活性型プロテインキナーゼC epsilonまたはドミナントネガティブ型プロテインキナーゼC epsilonのいずれかのCD NAを搭載したアデノウイルスを感染させ、24時間インキュベートします。その後、培地を補充し、形質導入した一次RPCをさらに24時間培養します。一次細胞単層のミトコンドリア形態を可視化するために、培地を補充し、MIT tracker red five 80を添加して、ディッシュをインキュベーターに30分間戻します。次に、水浸客体レンズを用いて、蛍光顕微鏡下で生存単層を観察します。2つ目の目的として、クラーク型電極を備えた酸素消費測定装置を用いて、RPTC懸濁液の状態3呼吸を評価し、ミトコンドリア機能を評価します。まず、DP不在下での状態2呼吸を測定します。次に、最終濃度が0.4 millimolarになるようにDPを添加します。状態3呼吸を開始し、その後、状態4呼吸へと移行させます。最終濃度が0.5 micrograms per milliliterになるようにオリゴマイシンを添加します。また、ステート3で呼吸している細胞に0.5 µMのFCCPを添加し、脱共役呼吸の測定も行います。0.5 mMのJC-1溶液を20 µLずつ各RPTC培養皿にゆっくりと加え、渦巻き状に混ぜて色素を十分に混合させます。その後、培養皿をインキュベーターに戻し、30分間静置します。次に、培養物を氷上に置き、氷冷PBSで2回洗浄します。その後、細胞を回収します。RPT細胞をエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングにより単層細胞を単一細胞懸濁液に分散させます。488 nmのアルゴンイオンレーザーによる励起を用い、フローサイトメトリーで蛍光を分析します。次に、単離したミトコンドリアのミトコンドリア膜電位を算出します。これにより、呼吸鎖の完全性の評価を容易にします。氷冷したPBSバッファーでRPTC単層を2回洗浄した後、細胞を回収し、遠心分離によってペレット化します。ペレットを1 mLのバッファーAで1回洗浄し、その後、ダウン式ホモジナイザーを用いて、顕微鏡下で観察した際にホモジネート中のほとんどの細胞が破壊されるまで細胞をホモジナイズします。次に、低速遠心分離によって細胞残渣を除去します。上清から粗ミトコンドリアを 15,000 ×g、4 °C で 10 分間遠心分離してペレット化し、ペレット化したミトコンドリアをバッファー C で 3 回洗浄します。ミトコンドリアペレットを 50 〜 100 µL のアッセイバッファーに再懸濁し、液体窒素で凍結して NADH ユビキノン酸化還元酵素活性を測定します。ミトコンドリアを含む添加物と共にアッセイバッファー 500 µL を加えます。また、ミトコンドリア以外のすべての添加物を含むブランクサンプルも用意します。プレートを 30 °C で 5 分間、混合しながら平衡化します。次に、プレートを分光光度計に設置し、各ウェルに3.25 millimolarのユビキノンを10 µL添加して反応を開始させます。340 nmにおける吸光度を、22秒間隔で3分間記録します。同様のアッセイにおいて、ATP合成酵素反応の基質として還元型シトクロムCを用い、シトクロムC酸化酵素の活性を測定します。各処理群の総APA活性およびオリゴマイシン非感受性APA活性を測定するための混合液を調製します。反応混合液中でのサンプルを31 °Cで10分間インキュベートします。TP基質を添加して反応を開始させ、31 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション混合液 200 µLを 3 M TCA 50 µLを含むチューブに移し、氷上で10分間静置してタンパク質を沈殿させます。その後、遠心分離によりペレット化します。次に、96ウェルプレートに、各リン酸標準液 50 µLと各サンプルの上清 50 µLを、それぞれ重複して分注します。次に、各ウェルに250 µLのSumner試薬を加え、30 °Cで15分間インキュベートします。その後、595 nmにおける吸光度を測定します。RPTC単層を氷冷したPBSバッファーで2回洗浄します。1 mLのPBSで細胞を回収し、細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移します。遠心分離によってRPTCサンプルをペレット化し、ATP生物発光アッセイキットのルシフェラーゼ法を用いてATP含有量を測定します。35 mmディッシュにおける細胞生存率の解析では、5つのRPTC単層を用いて、オネーシス陽性細胞、アポトーシス陽性細胞の3つの対照処理群、および2つのディッシュを用いた無染色対照を準備します。2セット目に50 millimolarのcisplatinを2 µL加えます。500 millimolarのturt butyl hydroperoxideを2 µL加えます。付随するテキストに詳述されている通りにpropidium iodideを用いて細胞を染色した後、結合バッファーで単層細胞を洗浄します。次に、テキストプロトコルの詳細に従い、ZIで標識したANNEXIN 5を用いて細胞を染色します。その後、細胞を穏やかに回収し、500 µLのバインディングバッファーに懸濁させます。この際、ラバーポリシーマンを使用してください。ピペットを用いて細胞を単一細胞懸濁液に分散させ、その細胞懸濁液をフローサイトメトリー用チューブに移します。細胞を単一細胞懸濁液に分散させてください。直ちにフローサイトメトリーに進み、PIおよびFEの蛍光を定量します。CD NAコーティングによるアデノウイルス送達を用いて、プロテインキナーゼC epsilonの恒常活性型および不活性型変異体を導入した結果、RPTCおよびミトコンドリアにおけるプロテインキナーゼC epsilonのタンパク質レベルが有意に上昇しました。予想通り、この酵素の構成的活性型はRP tcsにおいてリン酸化されており、ドミナントネガティブ型酵素はリン酸化されていません。活性型プロテインキナーゼC epsilonの存在は、ミトコンドリアのエネルギー供給に用いられる基質に関わらず、RPTCにおけるミトコンドリア呼吸を低下させます。一方、不活性型プロテインキナーゼC epsilonはミトコンドリア呼吸に影響を与えません。興味深いことに、RP TCSにおけるプロテインキナーゼCイプシロンの活性化は、複合体Iの活性を4分の1に減少させます。このRPTC呼吸の低下は、ミトコンドリア膜電位の上昇を伴います。ドミナントネガティブ変異体では、このような効果は見られません。これらの変化は、活性型プロテインキナーゼCεを過剰発現させたRPTCから単離したミトコンドリアにおいて、ATP合成酵素の活性低下を伴います。その結果、活性型プロテインキナーゼCεを過剰発現させたRPTCのATP含有量は減少します。プロテインキナーゼCεの持続的な活性化は、ミトコンドリアの断片化によって証明されるように、ミトコンドリアの形態に深刻な影響を及ぼします。プロテインキナーゼCの活性化（抑制ではない）は、RPTCの形態変化をもたらし、細胞の収縮および生存細胞の伸長を引き起こします。RPCsにおける活性型プロテインキナーゼC epsilonの過剰発現によるこれらのミトコンドリアへの影響は、オンコシスとアポトーシスの両方による細胞死とも相関していました。このビデオを視聴することで、アデノウイルス法を用いて一次培養細胞でタンパク質を過剰発現させる方法、およびTP合成におけるミトコンドリア能を評価する方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、適切に実施することでこの手法は4時間で完了します。また、アデノウイルスを扱う際は注意が必要ですので、適切な予防策を講じることを忘れないでください。

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Biology

生物学

このビデオは、細胞外フラックスアッセイを使用して、脳血管内皮(CVE)細胞のミトコンドリア機能の評価を示しています。CVE細胞は、細胞外フラックス細胞培養プレートに播種されます。細胞外フラックスセンサーは、バイオアナライザーにロードしてキャリブレーションする前に水和されます。次に、セルを含むプレートを解析のためにロードします。...

脳血管内皮細胞におけるミトコンドリア機能の評価

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。...

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

内皮細胞のミトコンドリアは、血液脳関門の完全性を維持するために重要です。私たちは、脳血管内皮細胞に生体エネルギー機能を測定するためのプロトコルを紹介します。...

脳血管内皮細胞での生体エネルギー機能の評価

肝細胞におけるミトコンドリア機能に対する環境有機塩素農薬(OP)の影響を理解することは、代謝障害を引き起こすOMPのメカニズムを探求する上で重要である。本論文では、肝ミトコンドリア機能の検出方法について詳しく説明する。...

有機塩素系農薬に曝露した肝細胞におけるミトコンドリア機能の検出実験プロトコル

このプロトコルは、分離し腎作用前のヴィヴォ、ミトコンドリアの生体エネルギーを含む評価するためにその後サブ培養することができますマウス主要な腎尿細管細胞を特徴付けるコスト効率の高いアプローチを提供します。...

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

この方法は、低コンダクタンスプロトンリークに対するミトコンドリア透過性遷移細孔の寄与を利用して、野生型対照と比較して心筋細胞ミトコンドリアコエンザイムQ含量が増加した新生児脆弱X症候群マウスにおける細孔開放の電圧閾値を決定する。...

コエンザイムQ過剰の設定におけるミトコンドリア透過性転移細孔の開放確率の評価

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。...

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

ここでは、代謝性の高い近位管上皮細胞における低酸素/再酸素化損傷をモデル化する in vitro...

近位管上皮細胞における低酸素症/再酸素化損傷のモデル化

この記事では、共焦点顕微鏡とImageJを使用して、Dendra2光スイッチング蛍光 を介して...

腎臓近位尿細管細胞におけるミトコンドリア分裂/融合ダイナミクスの評価

学ぶプロテインキナーゼCアイソザイムの過剰発現法を用いた腎近位尿細管細胞におけるミトコンドリア機能と細胞生存率の評価手法。この方法は腎疾患治療標的の探索に有用である。

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

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