腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

この実験では、プロテインキナーゼC（PKC）のアイソフォームを選択的に調節することで、さまざまな生理学的および病理学的条件下における腎近位尿細管細胞でのミトコンドリア機能および細胞機能を決定します。まず、腎皮質から一次腎近位尿細管細胞を単離するか、あるいは腎近位尿細管と同様の酸化代謝能を持つRPCsを単離します。

アデノウイルスベクターを用いて、プロテインキナーゼCεの活性型および不活性型を発現させ、RPCをin vivoで感染させます。次に、さまざまなミトコンドリア機能および細胞生存率をアッセイし、ミトコンドリアのATP合成能および細胞死抑制能に対する当該酵素の影響を決定します。また、回収した細胞溶解液を用いて、リン酸化プロテインキナーゼCεの免疫ブロット分析を行います。

結果から、プロテインキナーゼεの活性化は、ATPを生成するミトコンドリアの能力を負に調節し、細胞内のATPレベルおよび腎近位尿細管細胞の生存率を低下させることが示された。細胞株などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、腎近位尿細管細胞の初代培養が、腎近位尿細管の分化機能および酸化能を維持している点にある。プロテインキナーゼは標的および潜在的な治療剤として利用可能であるため、本手法の意義は、腎損傷の予防や損傷後の腎機能回復を促進する治療へと展開される。

この手法により、損傷および回復のメカニズムを解明することができます。また、新鮮に単離したウサギ腎臓に、50 mLずつの滅菌D-M-E-M-F 12培地、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）、およびPBS酸化鉄溶液を順次加え、各腎臓の皮質を回収することなどに適用可能です。

まず、15 mLダウンホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズします。次に、ホモジネートを2枚の滅菌メッシュシィーに通し、1 Lの滅菌ビーカーに回収します。シィーに残った細胞を、デフェロキサミン含有バッファーで洗浄します。

底に残っている組織をすべて、円錐形遠心チューブに入れた 40 milliliters のデフェロキサミン含有バッファーへ、85 micron のセルストレーナーを用いて移します。強力磁石を用いて、細胞懸濁液を静かに混ぜ合わせます。

鉄が充填された糸球体を回収し、磁石に付着した鉄を吸引します。細胞懸濁液の容量を40 millilitersに調整し、コラゲナーゼを含む消化培地を1 milliliter添加します。室温で17分間インキュベートします。

懸濁液を静かに混ぜ合わせます。数回の洗浄後、4°Cで50×gにて2分間遠心分離を行い、細胞を回収します。得られた細胞ペレットを、グルコースを含まない46 mLの培地に再懸濁します。

一次RT PCを、1皿あたり1 mgのタンパク質密度で、2 mLのグルコースフリーD-M-E-M-F 12培地を用い、オービタルシェーカーを用いて37 °C、5% carbon dioxide条件下で培養します。培地を補充した後、コンフルエントになったRPT細胞に、構成的に活性化したprotein kinase C epsilonまたはドミナントネガティブなprotein kinase C epsilonのCD NAを搭載したアデノウイルスを感染させ、24時間インキュベートします。その後、培地を補充し、トランスフェクションした一次RPCをさらに24時間培養します。一次細胞単層のミトコンドリア形態を可視化するため、培地を補充し、MIT tracker red 580を添加して、ディッシュをインキュベーターに戻し30分間静置します。

次に、水浸入レンズを用いた蛍光顕微鏡下で、生存している単層を観察します。目的2。ミトコンドリア機能を評価するため、クラーク型電極を備えた酸素消費測定装置を用いて、RPTC懸濁液の状態3呼吸を評価します。

まず、DP不在下で状態2呼吸を測定します。次に、最終濃度が0.4 millimolarとなるようにDPを添加します。状態3呼吸を開始し、続いて状態4呼吸へ移行させます。最終濃度が0.5 micrograms per milliliterとなるようにオリゴマイシンを添加します。

また、ステート3で呼吸している細胞に0.5 µMのFCCPを添加し、脱共役呼吸の測定も行います。0.5 mMのJC-1溶液20 µLを各RPTC培養皿にゆっくりと加え、渦巻き状に混ぜて染料を十分に混合させます。その後、培養皿をインキュベーターに戻し、30分間静置します。

次に、培養物を氷上に置き、氷冷したPBSで2回洗浄します。その後、細胞を回収します。RPT細胞をエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングによって単層を単一細胞懸濁液にします。

488 nmのアルゴンイオンレーザーによる励起を用い、フローサイトメトリーで蛍光を分析します。次に、単離したミトコンドリアのミトコンドリア膜電位を算出します。これにより、呼吸鎖の完全性の評価を容易にします。

氷冷PBSバッファーでRPTC単層を2回洗浄した後、細胞を回収し、遠心分離によりペレット化します。ペレットを1 mLのバッファーAで1回洗浄し、その後、ダウン型ホモジナイザーを用いて、顕微鏡で確認した際にホモジネート中のほとんどの細胞が破砕されるまで細胞をホモジナイズします。次に、低速遠心分離により細胞残渣を除去します。

上清から粗ミトコンドリアを4°C、15,000 ×gで10分間遠心分離してペレット化し、ペレット化したミトコンドリアをバッファーCで3回洗浄します。ミトコンドリアペレットを50〜100 µLのアッセイバッファーに再懸濁し、液体窒素で凍結してNADHユビキノン酸化還元酵素活性を測定します。ミトコンドリアを含む500 µLのアッセイバッファーに各試薬を添加します。また、ミトコンドリア以外のすべての試薬を添加したブランクサンプルも含めてください。プレートを30°Cで5分間、混合しながら平衡化させます。

次に、プレートを分光光度計にセットし、各ウェルに3.25 millimolarのユビキノンを10 microliters添加して反応を開始させます。340 nanometersにおける吸光度を、22秒間隔で3分間記録します。同様のアッセイにおいて、ATP合成酵素反応の基質として還元型シトクロムCを用い、シトクロムC酸化酵素の活性を測定します。

各処理群の全APA活性およびオリゴマイシン非感受性APA活性を測定するための混合液を調製します。サンプルを反応混合液中で31 °Cで10分間インキュベートします。TP基質を添加して反応を開始させ、31 °Cで5分間インキュベートします。

インキュベーション混合液 200 µL を 3 M TCA 50 µL 含有チューブに移し、氷上で 10 分間静置してタンパク質を沈殿させます。その後、遠心分離によりペレット化します。次に、96ウェルプレートに、各リン酸標準液 50 µL と各サンプル上清 50 µL を、それぞれ 2 Duplicate で分注します。

次に、各ウェルに250 µLのサマナー試薬を加え、30 °Cで15分間インキュベートします。その後、595 nmにおける吸光度を測定します。RPTC単層を氷冷したPBSバッファーで2回洗浄します。

1 mLのPBSで細胞を回収し、細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移します。遠心分離によりRPTCサンプルをペレット化し、ATP生物発光アッセイキットのルシフェラーゼ法を用いてATP含量を測定します。35 mmディッシュにおける細胞生存率の解析には、5つのRPTC単層を用い、3つの対照処理群（オネーシス陽性細胞、アポトーシス陽性細胞、および無染色コントロール）と2つのディッシュを使用します。

第2セットに50 millimolarのシスプラチンを2 µL加えます。続いて、500 millimolarのtert-ブチルヒドロペルオキシドを2 µL加えます。付属テキストに詳述されている通り、プロピジウムイオダイドを用いて細胞を染色した後、結合バッファーで単層細胞を洗浄します。

次に、テキストプロトコルに詳しく記載されている通り、ZI結合ANNEXIN 5を用いて細胞を染色します。その後、細胞を穏やかに回収し、500 µLの結合バッファーに懸濁させます。その際、ラバーポリサイマンを使用してください。

ピペットを用いて細胞を分散させ、単一細胞懸濁液とした後、その懸濁液をフローサイトメトリー用チューブに移します。細胞を単一細胞懸濁液に分散させてください。直ちにフローサイトメトリーによるPIおよびFEの蛍光定量へと進みます。CD NAコーティングされたアデノウイルスベクターによる、構成的活性型および不活性型プロテインキナーゼC epsilon変異体の導入により、RPTCおよびミトコンドリアにおけるプロテインキナーゼC epsilonのタンパク質レベルが有意に上昇します。

予想通り、この酵素の構成的に活性型である形態はRP tcsにおいてリン酸化されており、ドミナントネガティブ型の酵素はリン酸化されていません。活性型protein kinase C epsilonの存在は、ミトコンドリアのエネルギー源として使用される基質に関わらず、RPTCにおけるミトコンドリア呼吸を低下させます。一方で、不活性型のprotein kinase C epsilonはミトコンドリア呼吸に影響を与えません。

興味深いことに、RP TCSにおけるプロテインキナーゼC epsilonの活性化は、複合体IおよびIVの活性を低下させます。このRPTC呼吸の低下は、ミトコンドリア膜電位の上昇に関連しています。ドミナントネガティブ変異体では、このような影響は見られません。

これらの変化は、活性型プロテインキナーゼC epsilonを過剰発現させたRPTCから単離したミトコンドリアにおいて、ATP合成酵素の活性低下を伴います。その結果、活性型プロテインキナーゼC epsilonを過剰発現させたRPTCのATP含量は低下します。プロテインキナーゼC epsilonの持続的な活性化は、ミトコンドリアの断片化によって証明されるように、ミトコンドリアの形態に深刻な影響を及ぼします。

プロテインキナーゼCの活性化であり、抑制ではない。また、RPTCの形態変化を引き起こし、細胞の収縮および生存細胞の伸長をもたらす。RPCsにおける活性型プロテインキナーゼCεの過剰発現によるこれらのミトコンドリアへの影響は、オンコシスとアポトーシスの両方による細胞死とも相関していた。

このビデオを視聴後、アデノウイルス法を用いて初代培養細胞でタンパク質を過剰発現させる方法と、TP合成におけるミトコンドリア能を評価する方法について十分に理解できているはずです。習得すれば、適切に実施することでこの手法は4時間で完了できます。なお、アデノウイルスを扱う際はリスクが伴うため、適切な予防策を講じることを忘れないでください。