腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

本実験では、プロテインキナーゼC（PKC）のアイソフォームを選択的に調節し、さまざまな生理学的および病理学的条件下における腎近位尿細管細胞でのミトコンドリアおよび細胞機能を決定します。まず、腎皮質から一次腎近位尿細管細胞を分離するか、あるいは腎近位尿細管と同様の酸化代謝能を有するRPCsを分離します。

アデノウイルスベクターを用いて、活性型および不活性型 protein kinase C epsilon の両方を発現させ、RPCsを感染させます。その後、さまざまなミトコンドリア機能と細胞生存率を測定し、ATP合成能および細胞死抑制能に対する当該酵素の影響を評価します。また、細胞溶解液を用いて、リン酸化 protein kinase C epsilon のイムノブロット解析を実施します。

結果から、プロテインキナーゼεの活性化がミトコンドリアのATP生成能を負に調節し、細胞内のATPレベルおよび腎近位尿細管細胞の生存能を低下させることが示されました。細胞株などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、腎近位尿細管細胞の初代培養が、腎近位尿細管の分化機能と酸化能を維持している点にあります。プロテインキナーゼは標的および潜在的な治療薬として利用可能であるため、本手法の意義は、腎障害の予防や障害後の腎機能回復の促進といった治療へと広がります。

この手法により、損傷と回復のメカニズムを解明することができます。また、新鮮に単離したウサギ腎臓を、50 mLずつの滅菌D-M-E-M-F 12培地、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）、およびPBS酸化鉄溶液で順次処理し、各腎臓の皮質を回収する場合などに適用可能です。

まず、15 mLダウンホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズします。次に、ホモジネートを2枚の滅菌メッシュシープに通して、1 Lの滅菌ビーカーに回収します。シープ上に残った細胞を、デフェロキサミン含有バッファーで洗浄します。

底部に残っている組織をすべて、コニカルチューブに入れた40 mLのデフェロキサミン含有バッファーに、85 µmのセーバーを用いて移します。強力磁石を用いて、細胞懸濁液を静かに混合します。

鉄で充填された糸球体を回収し、マグネットに付着した鉄を吸引します。細胞懸濁液の容量を 40 milliliters に調整し、コラゲナーゼを含む消化培地を 1 milliliter 加えます。室温で 17 minutes インキュベートします。

懸濁液を静かに混ぜ合わせます。数回の洗浄後、4°Cで50×gにて2分間遠心分離し、細胞を回収します。細胞ペレットを、グルコースを含まない46 mLの培地に再懸濁します。

一次RT PCを、1ディッシュあたり1 mgのタンパク質密度で、2 mLのグルコースフリーD-M-E-M-F 12培地を用い、オービタルシェーカーを用いて37 °C、5% carbon dioxide条件下で培養します。培地を補充した後、コンフルエントになったRPT細胞に、恒常活性型プロテインキナーゼC epsilonまたはドミナントネガティブ型プロテインキナーゼC epsilonのいずれかのCD NAを搭載したアデノウイルスを感染させ、24時間インキュベートします。その後、培地を補充し、形質導入した一次RPCをさらに24時間培養します。一次細胞単層のミトコンドリア形態を可視化するために、培地を補充し、MIT tracker red five 80を添加して、ディッシュをインキュベーターに30分間戻します。

次に、水浸客体レンズを用いて、蛍光顕微鏡下で生存単層を観察します。2つ目の目的として、クラーク型電極を備えた酸素消費測定装置を用いて、RPTC懸濁液の状態3呼吸を評価し、ミトコンドリア機能を評価します。

まず、DP不在下での状態2呼吸を測定します。次に、最終濃度が0.4 millimolarになるようにDPを添加します。状態3呼吸を開始し、その後、状態4呼吸へと移行させます。最終濃度が0.5 micrograms per milliliterになるようにオリゴマイシンを添加します。

また、ステート3で呼吸している細胞に0.5 µMのFCCPを添加し、脱共役呼吸の測定も行います。0.5 mMのJC-1溶液を20 µLずつ各RPTC培養皿にゆっくりと加え、渦巻き状に混ぜて色素を十分に混合させます。その後、培養皿をインキュベーターに戻し、30分間静置します。

次に、培養物を氷上に置き、氷冷PBSで2回洗浄します。その後、細胞を回収します。RPT細胞をエッペンドルフチューブに移し、ピペッティングにより単層細胞を単一細胞懸濁液に分散させます。

488 nmのアルゴンイオンレーザーによる励起を用い、フローサイトメトリーで蛍光を分析します。次に、単離したミトコンドリアのミトコンドリア膜電位を算出します。これにより、呼吸鎖の完全性の評価を容易にします。

氷冷したPBSバッファーでRPTC単層を2回洗浄した後、細胞を回収し、遠心分離によってペレット化します。ペレットを1 mLのバッファーAで1回洗浄し、その後、ダウン式ホモジナイザーを用いて、顕微鏡下で観察した際にホモジネート中のほとんどの細胞が破壊されるまで細胞をホモジナイズします。次に、低速遠心分離によって細胞残渣を除去します。

上清から粗ミトコンドリアを 15,000 ×g、4 °C で 10 分間遠心分離してペレット化し、ペレット化したミトコンドリアをバッファー C で 3 回洗浄します。ミトコンドリアペレットを 50 〜 100 µL のアッセイバッファーに再懸濁し、液体窒素で凍結して NADH ユビキノン酸化還元酵素活性を測定します。ミトコンドリアを含む添加物と共にアッセイバッファー 500 µL を加えます。また、ミトコンドリア以外のすべての添加物を含むブランクサンプルも用意します。プレートを 30 °C で 5 分間、混合しながら平衡化します。

次に、プレートを分光光度計に設置し、各ウェルに3.25 millimolarのユビキノンを10 µL添加して反応を開始させます。340 nmにおける吸光度を、22秒間隔で3分間記録します。同様のアッセイにおいて、ATP合成酵素反応の基質として還元型シトクロムCを用い、シトクロムC酸化酵素の活性を測定します。

各処理群の総APA活性およびオリゴマイシン非感受性APA活性を測定するための混合液を調製します。反応混合液中でのサンプルを31 °Cで10分間インキュベートします。TP基質を添加して反応を開始させ、31 °Cで5分間インキュベートします。

インキュベーション混合液 200 µLを 3 M TCA 50 µLを含むチューブに移し、氷上で10分間静置してタンパク質を沈殿させます。その後、遠心分離によりペレット化します。次に、96ウェルプレートに、各リン酸標準液 50 µLと各サンプルの上清 50 µLを、それぞれ重複して分注します。

次に、各ウェルに250 µLのSumner試薬を加え、30 °Cで15分間インキュベートします。その後、595 nmにおける吸光度を測定します。RPTC単層を氷冷したPBSバッファーで2回洗浄します。

1 mLのPBSで細胞を回収し、細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに移します。遠心分離によってRPTCサンプルをペレット化し、ATP生物発光アッセイキットのルシフェラーゼ法を用いてATP含有量を測定します。35 mmディッシュにおける細胞生存率の解析では、5つのRPTC単層を用いて、オネーシス陽性細胞、アポトーシス陽性細胞の3つの対照処理群、および2つのディッシュを用いた無染色対照を準備します。

2セット目に50 millimolarのcisplatinを2 µL加えます。500 millimolarのturt butyl hydroperoxideを2 µL加えます。付随するテキストに詳述されている通りにpropidium iodideを用いて細胞を染色した後、結合バッファーで単層細胞を洗浄します。

次に、テキストプロトコルの詳細に従い、ZIで標識したANNEXIN 5を用いて細胞を染色します。その後、細胞を穏やかに回収し、500 µLのバインディングバッファーに懸濁させます。この際、ラバーポリシーマンを使用してください。

ピペットを用いて細胞を単一細胞懸濁液に分散させ、その細胞懸濁液をフローサイトメトリー用チューブに移します。細胞を単一細胞懸濁液に分散させてください。直ちにフローサイトメトリーに進み、PIおよびFEの蛍光を定量します。CD NAコーティングによるアデノウイルス送達を用いて、プロテインキナーゼC epsilonの恒常活性型および不活性型変異体を導入した結果、RPTCおよびミトコンドリアにおけるプロテインキナーゼC epsilonのタンパク質レベルが有意に上昇しました。

予想通り、この酵素の構成的活性型はRP tcsにおいてリン酸化されており、ドミナントネガティブ型酵素はリン酸化されていません。活性型プロテインキナーゼC epsilonの存在は、ミトコンドリアのエネルギー供給に用いられる基質に関わらず、RPTCにおけるミトコンドリア呼吸を低下させます。一方、不活性型プロテインキナーゼC epsilonはミトコンドリア呼吸に影響を与えません。

興味深いことに、RP TCSにおけるプロテインキナーゼCイプシロンの活性化は、複合体Iの活性を4分の1に減少させます。このRPTC呼吸の低下は、ミトコンドリア膜電位の上昇を伴います。ドミナントネガティブ変異体では、このような効果は見られません。

これらの変化は、活性型プロテインキナーゼCεを過剰発現させたRPTCから単離したミトコンドリアにおいて、ATP合成酵素の活性低下を伴います。その結果、活性型プロテインキナーゼCεを過剰発現させたRPTCのATP含有量は減少します。プロテインキナーゼCεの持続的な活性化は、ミトコンドリアの断片化によって証明されるように、ミトコンドリアの形態に深刻な影響を及ぼします。

プロテインキナーゼCの活性化（抑制ではない）は、RPTCの形態変化をもたらし、細胞の収縮および生存細胞の伸長を引き起こします。RPCsにおける活性型プロテインキナーゼC epsilonの過剰発現によるこれらのミトコンドリアへの影響は、オンコシスとアポトーシスの両方による細胞死とも相関していました。

このビデオを視聴することで、アデノウイルス法を用いて一次培養細胞でタンパク質を過剰発現させる方法、およびTP合成におけるミトコンドリア能を評価する方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、適切に実施することでこの手法は4時間で完了します。また、アデノウイルスを扱う際は注意が必要ですので、適切な予防策を講じることを忘れないでください。