腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

呼吸と酸化的リン酸化により、細胞生存率に関連するミトコンドリア機能に対するプロテインキナーゼC（PKC）アイソザイムの活性化の効果を説明する。アプローチは、選択的に初代細胞培養や細胞のミトコンドリアの機能とエネルギー状態を決定するために種々のアッセイにおけるPKCアイソザイムを過剰発現するアデノウイルスの手法を適応します。

この実験では、プロテインキナーゼC ISO xmsの選択的調節を使用して、さまざまな生理学的および病理学的条件下で腎近位尿細管細胞におけるミトコンドリアおよび細胞機能を決定します。まず、酸化代謝を有する腎皮質またはRPCから一次腎近位尿細管細胞を単離します。腎近位尿細管のそれに似ています。

Vivoは、タンパク質のisysの活性型および不活性型を発現するアデノウイルスベクターをRPCに感染させます。次に、キナーゼCは、さまざまなミトコンドリア機能と細胞生存率をアッセイして、TPを合成し細胞死を防ぐミトコンドリア能力に対するイザイムの影響を決定します。また、細胞ライセート中のリン酸化およびプロテインキナーゼCイプシロンの免疫ブロット解析も行います。

結果は、プロテインキナーゼイプシロンの活性化がミトコンドリアのTPを生成する能力を負に調節し、TPの細胞レベルと腎近位尿細管細胞の生存率を低下させることを示しています。この技術の主な利点は、細胞株などの既存の技術で、腎近位尿細管細胞の初代培養物が腎臓近位の分化機能を維持し、腎臓近位の私を酸化することです。プロテインキナーゼは標的および潜在的な治療薬として使用できるため、この技術の意味は治療にまで及び、腎障害の予防または損傷後の腎臓回復の促進につながります。

この方法では、怪我と回復のメカニズムを洞察できます。それはまた、50ミリリットルで順次、新たに分離されたウサギの腎臓あたりなどにも適用することができます。滅菌D-M-E-M-F 12中滅菌リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4およびPBS酸化鉄溶液のそれぞれを、各腎臓の皮質を採取します。

まず、15ミリリットルのダウンホモジナイザーを使用して組織を均質化します。次に、ホモジネートを2つの滅菌メッシュふるいに通して、1リットルの滅菌ビーカーに入れます。ふるいに残っている細胞をデフェロキサミン含有緩衝液ですすいでください。

底に残った組織を移します。85ミクロンのふるいを、円錐形の遠心分離管に入れた40ミリリットルのデフェロキサミン含有緩衝液に入れます。細胞懸濁液を強力な磁石で穏やかに混合します。

鉄で満たされた糸球体を捕らえ、磁石に付着した鉄を吸引します。細胞懸濁液の容量を40ミリリットルに調整し、コラゲナーゼを含む消化培地を1ミリリットル加えます。室温で17分間インキュベートします。

懸濁液を穏やかに混合します。数回の洗浄後、Gの50倍で摂氏4度で2分間遠心分離することにより細胞を回収します。Resusは、グルコースシードを含まない46ミリリットルの培地に細胞ペレットを懸濁します。

1皿あたり1ミリグラムのタンパク質密度の一次RT PCは、摂氏37度と5%二酸化炭素のオービタルシェーカー上の2ミリリットルのグルコースフリーD-M-E-M-F 12培地で培養します。培地を補充した後、コンフルエントRPT細胞にCD NAを運ぶアデノウイルスを感染させ、構成活性プロテインキナーゼ、Cイプシロン、またはドミナントネガティブプロテインキナーゼCイプシロンのいずれかを24時間インキュベートし、培地を補充し、トランスフェクションした一次RPCをさらに24時間培養する。初代細胞単層のミトコンドリア形態を視覚化するために、培地を補充し、MITトラッカーレッドファイブ80を追加し、皿をインキュベーターに30分間戻します。

次に、水浸漬を使用して蛍光顕微鏡下で生きた単分子膜を調べます。目標2。ミトコンドリアの機能を評価するには、クラーク型電極を備えた酸素消費チャンバー内のRPTC懸濁液の状態3呼吸を評価します。

まず、DPがない場合の状態2呼吸を測定します。次に、DPを最終濃度0.4ミリモルまで追加します。状態4の呼吸のために状態3の呼吸を開始すること。オリゴマイシンを最終濃度0.5マイクログラム/ミリリットルまで添加します。

また、状態3で呼吸する細胞に0.5マイクロモルのFCCPを添加することによる非結合呼吸の測定も含まれます。各RPTC培養皿に20マイクロリットルの0.5ミリモルJC1溶液をゆっくりと加え、渦巻き状に染料を完全に混合します。皿をインキュベーターに30分間戻します。

次に、培養物を氷の上に置き、氷冷PBS洗浄を2回行います。次に、細胞を収穫します。RPT細胞をeinor tubeに移し、ピペッティングにより単分子膜を単一細胞懸濁液に分解します。

488ナノメートルのアルゴンイオンレーザーによる励起を用いたフローサイトメトリーによる蛍光解析。次に、ミトコンドリアを分離したミトコンドリア膜電位を計算します。呼吸鎖の完全性の評価を容易にします。

RPTC単分子膜を氷冷PBSバッファーで2回洗浄した後、遠心分離により細胞とペレットを回収します。ペレットを1ミリリットルのバッファーAで1回洗浄し、顕微鏡で検査したときにホモジネート中のほとんどの細胞が壊れるまで、ダウンホモジナイザーで細胞をホモジナイザーします。次に、低速遠心分離により細胞の破片を除去します。

上清から粗ミトコンドリアを15, 000倍Gで摂氏4度で10分間ペレット化し、緩衝液cでペレット化したミトコンドリアを3回洗浄し、ミトコンドリアペレットを50〜100マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁し、液体窒素で凍結してNADHユビキノンオキシドレダクターゼ活性をアッセイします。500マイクロリットルのアッセイバッファーを添加すると、ミトコンドリアには、すべての添加物があるがミトコンドリアを含まないブランクサンプルも含まれます。プレートを摂氏30度で平衡化し、5分間混合します。

次に、プレートを仕様に置き、10マイクロリットルの3.25ミリモルユビキノンを追加して、それぞれで反応を開始します。よく340ナノメートルで22秒間隔で3分間の吸光度を記録します。同様のアッセイで、還元型シトクロムCをA TPシンターゼ反応の基質として使用して、シトクロムCオキシダーゼの活性を測定します。

各処理群の総APA活性およびオリゴマイシン非感受性APA活性をアッセイするためのミックスを調製します。反応混合物中でサンプルを摂氏31度で10分間インキュベートします。TP基質を添加して反応を開始し、摂氏31度で5分間インキュベートします。

200マイクロリットルのインキュベーション混合物を50マイクロリットルの3モルTCAを含むチューブに移し、タンパク質を氷上に10分間沈殿させます。その後、遠心分離によりペレット化します。次に、96ウェルプレートに各リン酸標準試料50マイクロリットルと各サンプル上清50マイクロリットルを二重にロードします。

次に、250マイクロリットルのSumner試薬を各ウェルに加え、摂氏30度で15分間インキュベートします。次に、595ナノメートルで吸光度を記録します。RPTC単分子膜を氷冷PBSバッファーで2回洗浄します。

1ミリリットルのPBSで細胞を採取し、細胞懸濁液をアイノールチューブに移します。RPTCサンプルを遠心分離によりペレット化し、A TP生物発光アッセイキットのルシフェラーゼ法を用いてTP含量を測定します。35ミリメートル皿の細胞生存率の解析には、アポトーシス陽性のオンオーシス細胞の3つの対照治療群と、2つの皿の無染色制御に5つのRPTC単層を使用します。

2番目のセットに2マイクロリットルの50ミリモルシスプラチンを追加します。500ミリモルタートブチルヒドロペルオキシドを2マイクロリットル加えます。添付のテキストで詳述されているように、ヨウ化プロピジウムを使用して細胞を染色した後、単層を結合バッファーで洗浄します。

次に、テキストプロトコールに詳述されているように、ZIと結合したANNEXIN 5を使用して細胞を染色します。次に、細胞を穏やかに回収し、500マイクロリットルの結合緩衝液に懸濁します。ゴム製の警官を使う。

ピペットを使用して細胞を単一の細胞懸濁液に分散させ、細胞懸濁液をフローサイトメトリーチューブに移します。細胞を単一細胞懸濁液に分散させます。フローサイトメトリーによるPIおよびFEの蛍光の定量化に直ちに進み、プロテインキナーゼCイプシロンの構成活性変異体および不活性変異体をコーティングするCD NAのアデノウイルス送達により、RPTCおよびミトコンドリアにおけるプロテインキナーゼCイプシロンのタンパク質レベルが大幅に増加します。

予想通り、酵素の構成的に活性な形態はRP tcsでリン酸化され、ドミナントネガティブ酵素はリン酸化されません。活性プロテインキナーゼCイプシロンの存在は、ミトコンドリアを活性化するために使用される基質に関係なく、RPTCのミトコンドリア呼吸を減少させます。しかし、不活性なプロテインキナーゼCイプシロンは、ミトコンドリア呼吸に影響を与えません。

興味深いことに、RP TCSにおけるプロテインキナーゼCイプシロンの活性化は、複合体の活性を4つに1つ低下させます。このRPTC呼吸の減少は、ミトコンドリア膜電位の増加と関連しています。ドミナントネガティブミュータントはそのような効果を持ちません。

これらの変化は、RPTCから単離されたミトコンドリアにおけるTPシンターゼの活性の低下も伴い、活性プロテインキナーゼCイプシロンを過剰に発現します。その結果、RPTCのA TP含量が活性プロテインキナーゼCイプシロンを過剰に発現すると、プロテインキナーゼの持続的活性化が低下する。Cイプシロンは、ミトコンドリアの断片化によって証明されるように、ミトコンドリアの形態に大きな影響を与えます。

プロテインキナーゼCの活性化ですが、阻害ではありません。また、RPTCの形態に変化をもたらし、細胞の収縮と生存細胞の伸長を引き起こします。これらのミトコンドリアへの影響は、活性プロテインキナーゼCイプシロンをRPCで過剰発現させることも、オンとアポトーシスの両方による細胞死と相関していました。

このビデオを見れば、アデノウイルス技術を使用して初代培養でタンパク質を過剰発現する方法や、TP合成のためのミトコンドリア容量の評価方法について十分に理解できるはずです。一度マスターすれば、このテクニックは適切に実行されれば4時間で完了します。そして、不十分な点として、アデノウイルスのアクセスを扱う作業を忘れてはならないので、適切な予防策を講じてください。