フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

我々のプロトコルは、タンパク質を含むFAHドメインの効率的な発現および精製のための方法を記述するが、一般的にタンパク質も含む。FHDタンパク質-1は、TCAサイクルおよびミトコンドリアのエネルギー代謝における調節的役割を果たす。FHD-1のダウンレギュレーションを細胞老化に関連付けることができ、観察されたフェノタイプの背後にある分子メカニズムを理解するために、酵素活性とタンパク質構造に関する情報が一般的に必要とされています。

IPTG誘導ベクターシステムを介してタンパク質を発現する主な利点は、すべての方法が比較的安価で、どの実験室でも確立しやすいということです。ニッケルNTAアガロース樹脂と組み合わせてポリヒスチジン型タンパク質を用いることで、アフィニティークロマトグラフィーの膨大な選択性を低コストで採用できます。ほとんどの目的で、この品質で得られたタンパク質は既に十分かもしれません。

他方の手のFPLCは、他の方法と比較していくつかの利点を有する十分に確立された一般的な方法である。まず、プラスミドの5〜10ナノグラムを氷上の有能なBL21-DE3 pLysS大腸菌の100マイクロリットルに挿入します。内容物を混ぜるためにチューブを少しタップします。

細菌を氷の上に30分間置き、数分おきにチューブを軽くたたきます。サーモシェーカーを摂氏42度に加熱します。細菌を含むチューブを装置に入れ、90秒間加熱します。

その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。氷上で5〜10分後、NZCYM培地の600マイクロリットルを追加し、細菌インキュベーターにチューブを入れます。37°Cで37°Cの方向に向けた中速で1時間振ります。

インキュベーション後、選択した抗生物質を含む10センチメートルLB寒天プレート上の細菌培養のプレート200マイクロリットル。一晩37°Cで細菌インキュベーター中のLB寒天プレート上の細菌を培養する。コロニー形成に成功した後、1つのコロニーを選び、選択した抗生物質で5ミリリットルのNZCYMに分散させる。

一晩摂氏37度で細菌インキュベーターの培養。細菌の増殖に成功した後、タンパク質量の需要に応じて、250ミリリットル、500ミリリットルまたは1リットルの培地で細菌を増幅する。次いで、細菌を培養し、37°Cで2〜3時間培養する。

インキュベーションに続いて、フォトメトリック解析用のサンプルを描画します。600ナノメートルでの光学密度が0.4に達した場合、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドの1ミリモルまで200マイクロモルを適用する。37°Cのタンパク質発現で細菌インキュベーターでさらに3〜5時間後に排出されます。

5,000回Gで5,000回の遠心分離を介して細菌ペレットを5分間収穫する。その後、上清を捨て、ペレットをマイナス20度で凍結して短い保管を行います。元の細菌懸濁液の各250ミリリットルに対して、選択した緩衝液の5ミリリットルを細菌ペレットに塗布する。

塗布バッファーの 5 ミリリットルあたり β-メルカプトエタノールの 10 マイクロリットルを追加します。.10ミリリットルのパスツールピペットを使用して、傷やピペット加工でペレットをサスペンションに機械的に強制します。すべての懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。

その後、サスペンションを超音波処理します。次に、4°Cで高速で30分間遠心分離機。氷上のフィルターユニットで連続して上清をフィルターします。

安定したリテーナーに取り付け、ニッケルNTAランニングバッファで洗浄することで、空のプラスチックまたはガラスカラムを準備します。タンパク質懸濁液の各10ミリリットルのために、カラムにニッケルNTAアガローススラリーの500マイクロリットルを適用する。カラムにニッケルNTAランニングバッファを完全に充填し、アガロース樹脂を破壊せず、バッファを重力で通します。

次に、カラムにタンパク質懸濁液を塗布し、サンプルを重力で通り抜けさせます。サンプルが通過したら、ニッケルNTAランニングバッファでカラムを充填します。カラムの下にUV透明キュベットを置き、ニッケルNTA溶出バッファーの1ミリリットルを収集します。

280ナノメートルのサンプルとブランクのサンプルの光学密度を確認してください。最適な方法では、サンプルは2.5を超える光学密度を表示します。FAHDタンパク質とニッケルNTA溶出バッファーは凍結と解凍時に沈殿するため、透析バッファーの100ミリリットルあたり1マイクロリットルのDTTを使用して、氷上で一晩異なるバッファーに対してタンパク質を透析します。

FPLCシステムを設定し、20%エタノールの5つのカラムボリュームとそれに続く5カラムの水量でカラムを洗浄します。カラムを平衡化した後、透析サンプルをカラムに適用し、流れを通して集めます。グラデーションの溶出を設定します。

勾配が終了した後、1 つの列の体積の範囲でそれ以上のピークが検出されないまで、高塩バッファーで実行します。マイクロプレートリーダーを起動し、摂氏25度で30分間平衡化します。酵素アッセイバッファーで試験される基質の 20 ミリモル溶液の 1 ミリリットルを準備します。.

テキストプロトコルのピペッティングスキームに従って、酵素のブランクとサンプルウェルを、酵素液の5マイクロリットルで90マイクロリットルの酵素アッセイバッファーを井戸にピペット処理して調製します。次に、95マイクロリットルの酵素アッセイバッファーをウェルにピペット処理して、基板ブランクとサンプルウェルを調製します。測定の直前に、6つのブランクウェルに5マイクロリットルの酵素アッセイバッファーを塗布します。

サンプルウェルに20ミリモル基板溶液の5マイクロリットルを塗布します。50マイクロリットルの設定でマルチチャンネルピペットを使用して、ウェルを穏やかに混ぜます。次に、プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、255ナノメートルで各ウェルを測定します。

最後に、スプレッドシートで分析を実行します。最適な変換と最適でない変換後の LB 寒天プレートの 2 つの例を以下に示します。あまりにも多くの細菌コロニーは、2つの多くの細菌がメッキされたか、抗生物質が期限切れである可能性があることを示しています。

あまりにも少ない細菌コロニーは、形質転換のために十分なプラスミドが使用されなかったか、細菌を選択するためにあまりにも多くの抗生物質が使用されたことを示している可能性があります。ミリグラム量で発現したタンパク質を含む細菌ペレットを収穫し、SDS-pageを介して発現を検証する。この単純なプロセスの間に、封入体を形成するタンパク質や発現していないタンパク質を含むいくつかの問題が発生する可能性があります。

Hisタグを使用してタンパク質にタグを付ける場合、ニッケルNTAアガロースによるアフィニティークロマトグラフィーは、汚染の大部分を排除する簡単で安価な捕獲方法です。タグが使用されていない場合、硫酸アンモニウム沈殿と連続した疎水性交換クロマトグラフィーの組み合わせも、他のタンパク質の大部分からタンパク質を分離してもよい。このタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーにより残りの汚染からさらに分離され、その後サイズ排除クロマトグラフィーが続き、十分に純粋なタンパク質を得る。

特に記載された方法のいずれも困難ではない。しかし、すべての方法はトレーニングを必要とします。最初の試みは失敗するかもしれませんが、いくつかの追加の適応の後に実験は成功します。

ここに示す全ての方法はタンパク質精製の一般的な方法である。FAHDタンパク質に特化しているが、プロトコルは、精製したい任意のタンパク質に適合することができる。組換えヒトFAHD-1は、記載された方法と高解像度のX線構造によって得られ、両方として作用する機能性、脱炭酸酵素およびヒドロラーゼによってFAHD-1の我々の理解に大きく貢献した。

この作業で使用される細菌は安全株であり、危険ではありません。一般的な安全ガイドは、すべての化学物質に適用され、FPLCカラムは注意して取り扱う必要があります。