タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識
June 4th, 2020
このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。
このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識と、その運動の高分解能における定量的研究を可能にする。蛍光色素によるインキュベーションは、蛍光タンパク質の必要性をバイパスするだけで、関連するアーティファクトや制限を回避し、トランスフェクト不可能な細胞にプロトコルを適用することができます。優等核の染色を達成するためには、SYBR Goldを使用し、最適化した条件下では何も使用しないでください。
さもなければ、全細胞DNAが染色され得る。ラベリング手順の1日前に、35ミリメートルペトリ皿中の培地2ミリリットルで5番目のHeLa細胞に10回10回培養する。翌朝、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄してから、フェノール赤自由培養液1ミリリットルと適切な2Xラベリング溶液の1ミリリットルを添加する。
30分37度と5%の二酸化炭素で、上清を含む色素を各35ミリメートルのペトリ皿から慎重に吸引し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗います。次に、新鮮なフェノール赤自由細胞培養培地で細胞を供給し、生きたイメージングまで光から保護された培養インキュベーターに培養液を戻す。ライブセルイメージングの場合、イメージングセッションの少なくとも1時間前に、ステージトップインキュベーターを超解像度の構造照明顕微鏡ステージに配置し、レーザーを含む顕微鏡のすべてのコンポーネントの温度を摂氏37度に、二酸化炭素濃度を5%スイッチに設定し、高倍率、高数値開腹浸漬目的を選択します。
レーザーが温まったら、35ミリメートルのペトリ皿を顕微鏡のステージに取り付け、眼を使って皿の底に取り付けられた細胞で関心のある領域を見つけます。超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得するには、バックエンドハイエンド電子乗算電荷結合デバイスカメラを使用します。画像取得ソフトウェアでは、カメラに推奨される高電子乗算ゲインを設定します。
ヌクレオイド追跡用のタイムラプスシリーズを取得する前に、ミトコンドリア染色用の1つのチャネルとSYBR金用の別のチャネルで同じ視野の2色超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得します。ミトコンドリア画像カラーチャネルを、使用するミトコンドリア染色に適した励起と放出に設定し、SYBRゴールド色素に適した励起およびバンパスエミッションフィルタを設定します。両方のチャンネルに可能な限り低いレーザーパワーを設定します。
顕微鏡が連続的にチャンネルを取得する場合は、ミトコンドリア染色検出用のチャネルをオフにします。ソフトウェアの Z スタック ボックスのチェックを外して、Z スタックの取得をオフにして単一の焦点面の取得を設定し、カメラの露出時間を最短に設定します。グリッドの3回転を設定し、複数のレーザーパワー値と数回の露出時間でラベル付けされたセルの2次元画像を取得し、カメラの露出時間にレーザーパワーを最適化します。
ほとんどまたは全くアーティファクトを持つミトコンドリアの明るいスポットを持つ構造化された照明顕微鏡画像を生成するレーザーパワーとカメラの露出時間を選択し、最適化された設定を使用してタイムラプスシリーズの取得を開始します。タイムラプス画像の解析のために、変換された構造化照明顕微鏡画像とスポットトラッキングモジュールを備えた適切な画像解析ソフトウェアを開き、[新しいスポットを追加]をクリックしてスポット作成ウィザードを開始します。[作成] タブで[時間の経過に従ってスポットを追跡]をクリックし、ウィザードの 2 番目の手順に進みます。
推定 x-y 直径を 0.1 ~ 0.15 マイクロメートルに設定します。[背景の減算] をクリックし、ウィザードの 3 番目の手順に進みます。ヒストグラムの垂直線をドラッグして、各フレーム内でアーチファクト内のスポットが検出されないとき、大部分のヌクレオチドが検出されるまで、品質フィルタの閾値を調整します。
ウィザードの 4 番目と 5 番目の手順に進み、自己回帰モーション アルゴリズムを選択します。最大距離を 0.5 マイクロメートルに、最大ギャップ サイズをゼロに設定します。微調整されたパラメーターにより、ソフトウェアがすべてのスポットを検出してトラックを正しく作成できる場合は、矢印ボタンをクリックしてトラックの作成を確認し、統計情報アイコンをクリックしてトラックの統計情報を抽出します。
次に、必要な統計情報パラメータを選択し、[名前を付けて保存]をクリックして、値をドット CSV ファイルとしてエクスポートして定量化と視覚化を行います。SYBR金またはピコグリーンの高濃度で標識すると、核の豊富な染色と細胞質内の穿刺染色が生じます。より低い濃度では、細胞質内で明るいスポットのパターンで核内にかすかなSYBR金シグナルが現れる。
低濃度でのピコグリーン標識は、主に核染色をもたらす。遠赤色ミトコンドリア色素中のSYBR金の低濃度で同時染色すると、SYBR金染色のほとんどすべてがミトコンドリア内で起こり、高濃度で標識すると核および細胞質の有意な染色が生じることが明らかになる。タイムラプスイメージングは、45分後にヌクレオイド染色が飽和に近いことを明らかにします。
固定は、固定細胞の透過化はミトコンドリアの点線染色パターンを排除し、核染色を強化しながら、核への色素のわずかな再分配を引き起こす。SYBR金が固定および透過化後に細胞に添加された場合、色素は細胞質と核全体に均一に分布し、染色特異性の損失をもたらす。超分解能構造照明顕微鏡による生細胞3Dイメージングは、ミトコンドリア内の明るいスポットとしてミトコンドリアヌクレオイドを明らかにする。
回折限界を超える解像度で核の位置を追跡することは、核の大部分がミトコンドリアネットワークに限定される短距離のランダムな動きを示すことを示しています。このプロトコルはサンプルの固定と互換性がないことに注意することが重要です。しかし、我々のプロトコルは、分子およびオルガネラの形態、ダイナミクスおよび活動の研究のための生細胞画像に基づくアッセイの広い範囲と互換性があるべきである。
我々の研究は、細胞ベースの技術のための非有機色素を再標的化することの利点を示している。細胞研究におけるその応用のために他の蛍光色素の探索を促すかもしれない。
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概要
このプロトコルは、生細胞内でミトコンドリア核様体の特定のラベリングを可能にし、高解像度でのその動きの定量的研究を容易にします。市販のDNAゲル染色剤を使用することで、蛍光タンパク質の過剰発現の必要性を回避し、アーティファクトを防ぎ、非トランスフェクト可能な細胞タイプへの適用可能性を広げています。
主要な研究構成要素
研究分野
- 細胞生物学
- 顕微鏡学
- 分子生物学
背景
- ミトコンドリア核様体は細胞機能において重要な役割を果たしています。
- 従来の染色法はアーティファクトを引き起こす可能性があります。
- この研究は選択的核様体ラベリングの条件の最適化に焦点を当てています。
使用された方法
- 超解像度構造化照明顕微鏡（SR-SIM）
- HeLa細胞
- SYBR Gold染色
主な結果
- このプロトコルにより、ミトコンドリア核様体を明るい点として効果的に視覚化することができます。
- タイムラプスイメージングにより、核様体の動きをリアルタイムで追跡することができます。
- 高解像度イメージングにより、回折限界を超えるダイナミクスを明らかにします。
結論
- この研究はミトコンドリア核様体をラベル付けする新しい方法を実証し、その動きに関する貴重な洞察を提供します。
- この発見は、ミトコンドリアのダイナミクスとその細胞生物学研究における重要性の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables artifact-free, live-cell visualization of mitochondrial nucleoids, supporting mechanistic de-risking in mitochondrial target validation. By avoiding fluorescent protein overexpression, it ensures phenotypic fidelity in early discovery assays. The method enhances predictive confidence in nucleoid dynamics as a biomarker for mitochondrial function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mitochondrial DNA-protein complexes without overexpression artifacts.
- Operational Value: Compatible with non-transfectable cells, expanding target validation models.
- Predictive Value: Provides quantitative motion data to de-risk mechanistic hypotheses about nucleoid function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescent signals for high-content nucleoid tracking.
- Scalability: Uses a single dye (SYBR Gold) under optimized conditions for consistent labeling across plates.
- Quantitative Output: Enables spot detection and trajectory analysis for dose-response or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links nucleoid dynamics to mitochondrial health in preclinical disease models.
- Translational Continuity: Supports longitudinal tracking from discovery to validation stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Nucleoid motion parameters inform go/no-go criteria for mitochondrial-targeted compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits between early target hypothesis testing and lead optimization, providing dynamic readouts that bridge static imaging and functional assays.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleoid involvement in mitochondrial inheritance and stress response.
- Screening: Delivers quantitative motility metrics for compound effect profiling.
- Analytics: Generates track statistics (velocity, confinement, directionality) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects nucleoid behavior to mitochondrial membrane potential or ROS biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging module for mitochondrial quality control across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial genetics and nucleoid-protein interactions.
- Operational Value: Eliminates transfection steps, improving assay throughput and consistency.
- Strategic Value: Increases confidence in target engagement by linking compound effects to nucleoid dynamics.
- Portfolio Impact: Enables early prioritization of compounds based on subcellular functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell super-resolution microscopy and image analysis.
- Needs structured illumination microscopy with environmental control (37°C, 5% CO2).
- Demands standardization of dye concentration and incubation time to avoid nuclear staining.
- Requires adaptation for different mitochondrial stains when multiplexing.
- Limited to live-cell applications; incompatible with fixation or permeabilization steps.
