Name: タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識法。SYBR Goldを用いた生細胞での高解像度タイムラプス構造照明顕微鏡法により、HeLa細胞における動的挙動を定量的に解析できます。蛍光タンパク質発現不要で非トランスフェクション細胞にも適用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、HeLa細胞を提供したアシファ・アフタールとアンジェリカ・ランボルト(マックス・プランク免疫生物学・エピジェネティクス研究所の両方)を認めている。

注:ここで言及したすべての細胞株は、10%のウシ胎児血清(FBS)、グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸を添加した高グルコースダルベックの修飾イーグル培地(DMEM)で培養した。5%CO2に設定したインキュベーターで37°Cまで温めることにより、ラベリングおよび画像化の日に使用されるすべての培地およびサプリメントを平衡化する。2ラベリングを含むすべての細胞培養作業は、層流フードの下で無菌条件で行われます。
1. ライブセルラベリング
<ol><li>ラベリング手順の前日、4 x 105 HeLa細胞を2mLの培地で35mmペトリ皿に#1.5ガラス底で培養する。マルチウェルチャンバースライドを使用できますが、ボリュームはウェルの体積に比例して調整する必要があります。細胞懸濁液を希釈して約50,000個の細胞/mLを持ち、35mmのペトリ皿に細胞懸濁液の2mLをシードします。</li>
	<li>SYBRゴールド(SG)商用在庫ソリューションの次の希釈液を準備します: 1:5,000.ミトトラッカーディープレッド(遠赤色染色)またはミトトラッカーCMXRosレッド(赤い汚れ)(材料表;市販株希釈1:2,000)をフェノール赤自由培養培地で準備します。SGと同じピコグリーンの希釈液を準備します。 注:ステップ 1.2 で説明されているソリューションは、2x ラベル付けソリューションです。蛍光色素を含むすべての溶液を光から可能な限り保護します。</li>
	<li>接着細胞を2 mL PBSで1回洗います。35mmペトリ皿に1mlのフェノール赤入り培養培地を加えます。8ウェルチャンバースライドの場合、総ウェル容量の1/2に等しいボリュームを使用します(例えば、総ウェル容量が250μLの場合は125 μLを追加します)。</li>
	<li>ステップ1.2~35mmのペトリ皿で調製した2xラベリング溶液を1 mL加えます。8ウェルチャンバースライドの場合は、総ウェル容量の1/2に等しいボリュームを使用してください。5%CO2の下で37°Cで30分間細胞をインキュ2ベートする。 注:長いインキュベーションは核DNAの標識を引き起こすので、1時間以上SG標識溶液で細胞をインキュベートしないでください。</li>
	<li>蛍光染料を含む培地を慎重に吸引し、PBSで細胞を一度洗います。</li>
	<li>フェノールを赤自由な細胞培養培地に添加し、細胞をイメージングまで37°CのCO2インキュベーターで暗闇の中に保管します。</li>
	<li>インキュベーションユニットを搭載したSR-SIM顕微鏡上の細胞の画像(下記参照)。</li>
</ol>2. SR-SIM画像取得
<ol><li>顕微鏡ステージにステージトップインキュベーターを取り付ける。所望の温度とCO2濃度(例えば、哺乳動物細胞の場合は37°Cおよび5%)を設定し、画像取得を開始する前に少なくとも1時間暖かく保ちます。</li>
	<li>レーザーを含むSR-SIM顕微鏡のすべてのコンポーネントのスイッチを入れ、少なくとも1時間温めます。</li>
	<li>顕微鏡メーカーがSR-SIMに推奨する高倍率、高い開口(NA)浸漬目的(例えば、100x 1.46 NA油)を選択してください。</li>
	<li>インキュベートされた顕微鏡の段階に(ステップ1.6から)ラベル付きの細胞とチャンバースライドまたは35 mm皿を取付ける。</li>
	<li>好ましくは眼で、サンプル上の関心領域を見つける。SR-SIMイメージングの品質を最適に達成するには、ガラスに適切に取り付けられているセルを選択します。</li>
	<li>SR-SIM 画像を取得するには、バックスチンドハイエンド電子乗算電荷結合デバイス(EM-CCD)カメラを使用します。</li>
	<li>画像取得ソフトウェアを使用して、使用するカメラに推奨される高いEMゲイン(例えば、300)を設定します。</li>
	<li>ヌクレオイド追跡用のタイムラプスシリーズを取得する前に、同じ視野の2色SR-SIM画像を取得します:ミトコンドリア染色用のチャネルとSG用のチャンネル。使用するミトコンドリア染色に適した第1のカラーチャンネルを設定する(例えば、遠赤色ミトコンドリア染色の場合、励起を633nm以上に設定し、650nmロングパス発光フィルタを設定する)。SG信号の場合、励起を488 nmに、500~550 nmのバンドパス放出フィルタを設定します。</li>
	<li>ソフトウェアを使用して、488 nmと遠赤色の汚れラインの両方に可能な限り低いレーザーパワーを設定します。 注:典型的な設定は、アフュースト光光チューナブルフィルタ(AOTF)によって調整された1%のレーザー出力電力です。</li>
	<li>SIM顕微鏡がチャンネルをシーケンシャルに取得する場合(シングルカメラ設定)、遠赤色の汚れ検出チャネルをオフにします。</li>
	<li>ソフトウェアの Z スタックボックスのチェックを外して Z スタックの取得をオフにして、単一焦点面の取得を設定します。</li>
	<li>EM-CCD カメラの露出時間を最短に設定します。</li>
	<li>グリッドの回転を 5 回ではなく 3 回転に設定します。</li>
	<li>フレームレートを上げるには、ソフトウェアの取得タブで、カメラセンサーの中央領域からのみデータを読み取るようにカメラを設定します。 注:たとえば、1,000 x 1,000 ピクセルのフルセンサーの領域を読み取りから 256 x 256 ピクセルのみを読み取るように切り替えると、カメラの露出時間を 50 ms から 13.4 ms に、フレーム全体の時間を 1.8 秒から 1.2 秒に短縮できます。カメラセンサーの中央部分のみが読み取られる場合、SR-SIMに通常使用される63倍または100倍の目標では、視野は非常に小さくなります。露光時間を短くすると、画像の信号対雑音比が低下します。</li>
	<li>レーザーパワーとカメラの露出時間を最適化する:複数のレーザーパワー値(例えば、0.5%、1%、1.5%、2%)で標識された細胞のSR-SIM2次元(2D)画像を取得するそして、数回の暴露時間(例えば、13.4 ms、25 ms、50 ms)。</li>
	<li>生の SIM データセットを処理します (ステップ 3.1 を参照)。</li>
	<li>SIM処理によって生成されるアーティファクトがほとんどまたはまったくないミトコンドリア(すなわち、核状の核状)に明るいスポットを持つSIM画像を得るレーザーパワーとカメラの露出時間を選択してください。ミトコンドリアの外側の領域を検査します(例えば、488 nmの固体レーザーの1%のパワーとEM-CCDカメラの25 ms露光)。</li>
	<li>ステップ2.15-2.17で最適化された設定を使用して、タイムラプスシリーズの取得を開始します。</li>
</ol>3. データ処理と分析
<ol><li>適切なソフトウェアの構造化された照明モジュールを使用して生 SIM データセットを処理する (材料表): SIM 処理パラメータの[自動] チェックボックスを選択します。複数のファイルの自動処理を行う場合は、バッチ処理ツールを使用し、[バッチに現在を使用] を選択解除し、[バッチの実行] をクリックして、SIM 処理用に複数のファイルを選択します。</li>
	<li>SIM 処理された時系列データセットを、Imaris ファイル コンバータ ソフトウェア (つまり、Imaris ソフトウェアのバージョンに対応するバージョン) を使用してims形式に変換します。</li>
	<li>リネージュ (またはトラック) モジュールのライセンスを持つソフトウェア (バージョン 8.4.1 以降) で変換されたファイルを開きます。</li>
	<li>[新しいスポットの追加] アイコンをクリックして、[スポット] の作成ウィザードを開始します。作成用のウィザードが起動します。</li>
	<li>ウィザードの [作成] タブを選択します。</li>
	<li>ウィザードの最初の手順で、[スポットの追跡(時間の経過) をクリックし、ウィザードの 2 番目の手順に進みます。</li>
	<li>推定 XY 直径を 0.1 ~0.15 μm に設定し、[背景減算]をクリックして、3 番目のステップに進みます。</li>
	<li>ヒストグラムの垂直線をドラッグしてフィルターの「品質」のしきい値を調整し、大部分の核OIDが「斑点」として検出される一方で、アーティファクトは検出されません(つまり、検出されたスポットは画像上に重ね合わせてボールとしてマークされます)。これが各フレームに当てはまるかどうかを確認し、必要に応じてしきい値を再調整します。4 番目に進み、ウィザードの 5 番目の手順に進みます。</li>
	<li>自己回帰モーションアルゴリズムを選択します。最大距離を 0.5 μm に設定し、[最大ギャップ サイズ]を 0 に設定します。</li>
	<li>時系列の各フレームを確認し、誤ったトラックが描画されているか、トラック間にギャップが生じたかどうかを確認します(現在の設定でウィザードによって構築されたトラックは、瞬時に画像上に線としてマークされます)。必要に応じて「最大距離」を調整します。ウィザードの 6 番目の手順に進みます。[トラック期間] フィルターを選択し、しきい値を 3 ~ 5 s に設定します。</li>
	<li>現在検出されているスポットまたはトラックが最適でない場合は、(ウィザード ウィンドウの下部にある) ナビゲーション ボタンを使用して、スポットまたはトラックの作成に必要なパラメーターを微調整するウィザードの前の手順に戻ります。</li>
	<li>微調整されたパラメーターにより、ソフトウェアがすべてのスポットを検出してトラックを正しく作成できる場合は、ウィザードの緑色の矢印ナビゲーションボタンをクリックしてトラックの作成を確認します。</li>
	<li>[統計] アイコン ウィンドウをクリックして、トラックの統計情報を抽出します。必要な統計パラメーター ([統計] の下の[詳細]タブと[平均値] タブ) を選択し、数値化と視覚化のためにフロッピー ドライブアイコンをクリックして値を csv ファイルとしてエクスポートします。 注:最大トラック速度、平均トラック速度、トラック長、およびトラック変位は重要なパラメータの例です。</li>
	<li>画像データセットを表示または公開する必要がある場合は、[スナップショット]または[アニメーション]ツールを使用して、オプションでオーバーレイされたトラックを使用して、タイムラプスシリーズを表すスナップショットやビデオファイルを作成します。</li>
</ol>4. 共焦点画像の取得
<ol><li>顕微鏡ステージにステージトップインキュベーターを設置し、所望の温度とCO2濃度(哺乳類細胞の場合は37°Cおよび5%)を設定し、画像取得を開始する前に少なくとも1時間暖かく保ちます。</li>
	<li>レーザーを含む共焦点レーザー走査顕微鏡のすべてのコンポーネントのスイッチを入れ、少なくとも1時間温めます。</li>
	<li>ナイキストの基準に従って、目的の中から高の倍率および空間サンプリングを選択します。</li>
	<li>SG チャネルの場合、励起を 488 nm に、検出範囲を 500 ~ 550 nm に設定します。ミトコンドリア染色チャネルの場合、赤色色素の場合は561 nmおよび570〜630 nmの発光、遠赤色色素では633 nmの励起および>650 nmの放出に設定します。</li>
	<li>PMT検出器のゲイン700mVで信号の取得を可能にする、可能な限り低いレーザーパワー(通常は1%以下)を設定します。</li>
	<li>「SGチャネル」でミトコンドリア核OIDが検出され、ミトコンドリアが「赤」または「遠赤色」チャネルで検出される細胞の2色共焦点画像を取得する。</li>
</ol>

<ol><li>Kaufman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+transcription+factor+TFAM+coordinates+the+assembly+of+multiple+DNA+molecules+into+nucleoid-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).</li>
<li>Farge, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sliding+and+DNA+denaturation+are+essential+for+DNA+organization+by+human+mitochondrial+transcription+factor+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein sliding and DNA denaturation are essential for DNA organization by human mitochondrial transcription factor A.</a> Nature Communications. 3, 1013(2012).</li>
<li>Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+nucleoid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA nucleoid structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 914-920 (2012).</li>
<li>Kang, D., Kim, S. H., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+%28TFAM%29%3A+roles+in+maintenance+of+mtDNA+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A (TFAM): roles in maintenance of mtDNA and cellular functions.</a> Mitochondrion. 7 (1-2), 39-44 (2007).</li>
<li>Tauber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+mitochondrial+nucleoids+upon+mitochondrial+network+fragmentation+and+network+reintegration+in+HEPG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Distribution of mitochondrial nucleoids upon mitochondrial network fragmentation and network reintegration in HEPG2 cells.</a> International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (3), 593-603 (2013).</li>
<li>Garrido, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+dynamics+of+human+mitochondrial+nucleoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and dynamics of human mitochondrial nucleoids.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1583-1596 (2003).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Morphosis%3A+Mitochondrial+Fusion%2C+Fission%2C+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).</li>
<li>Caielli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+mitochondrial+nucleoids+released+by+neutrophils+drive+type+I+interferon+production+in+human+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxidized mitochondrial nucleoids released by neutrophils drive type I interferon production in human lupus.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (5), 697-713 (2016).</li>
<li>Okayama, S., Ohta, K., Higashi, R., Nakamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopic+observation+of+mitochondrial+DNA+in+mammalian+cells+by+using+focused-ion+beam+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopic observation of mitochondrial DNA in mammalian cells by using focused-ion beam scanning electron microscopy.</a> Microscopy (Oxf). 63 (Suppl 1), i35(2014).</li>
<li>Alan, L., Spacek, T., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delaunay+algorithm+and+principal+component+analysis+for+3D+visualization+of+mitochondrial+DNA+nucleoids+by+Biplane+FPALM%2FdSTORM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Delaunay algorithm and principal component analysis for 3D visualization of mitochondrial DNA nucleoids by Biplane FPALM/dSTORM.</a> European Biophysics Journal. 45 (5), 443-461 (2016).</li>
<li>Kukat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Kukat, C., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mtDNA+makes+a+U-turn+for+the+mitochondrial+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mtDNA makes a U-turn for the mitochondrial nucleoid.</a> Trends in Cell Biology. 23 (9), 457-463 (2013).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Benke, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+dSTORM+of+cellular+DNA+based+on+direct+DNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Live-cell dSTORM of cellular DNA based on direct DNA labeling.</a> ChemBioChem. 13 (2), 298-301 (2012).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79-87 (2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Gustafsson, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Hirano, Y., Matsuda, A., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+structured-illumination+microscopy+toward+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in structured-illumination microscopy toward live-cell imaging.</a> Microscopy (Oxf). 64 (4), 237-249 (2015).</li>
<li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range%2C+limits%2C+and+membrane+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (24), 4994-5010 (2011).</li>
<li>Lewis, S. C., Uchiyama, L. F., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contacts+couple+mtDNA+synthesis+with+mitochondrial+division+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contacts couple mtDNA synthesis with mitochondrial division in human cells.</a> Science. 353 (6296), aaf5549(2016).</li>
<li>Dellinger, M., Geze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mitochondrial+DNA+in+living+animal+cells+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Detection of mitochondrial DNA in living animal cells with fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 204 (Pt 3), 196-202 (2001).</li>
<li>Ban-Ishihara, R., Ishihara, T., Sasaki, N., Mihara, K., Ishihara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+nucleoid+structure+regulated+by+mitochondrial+fission+contributes+to+cristae+reformation+and+release+of+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamics of nucleoid structure regulated by mitochondrial fission contributes to cristae reformation and release of cytochrome c.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11863-11868 (2013).</li>
<li>Zurek-Biesiada, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+of+DNA+in+situ+using+Vybrant%28%28R%29%29+DyeCycle+Violet+fluorescent+probe%3A+A+new+approach+to+study+nuclear+nanostructure+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy of DNA in situ using Vybrant((R)) DyeCycle Violet fluorescent probe: A new approach to study nuclear nanostructure at single molecule resolution.</a> Experimental Cell Research. 343 (2), 97-106 (2016).</li>
<li>He, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA%28%2B%29+protein+ATAD3+has+displacement+loop+binding+properties+and+is+involved+in+mitochondrial+nucleoid+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The AAA(+) protein ATAD3 has displacement loop binding properties and is involved in mitochondrial nucleoid organization.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 141-146 (2007).</li>
<li>Ashley, N., Harris, D., Poulton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mitochondrial+DNA+depletion+in+living+human+cells+using+PicoGreen+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of mitochondrial DNA depletion in living human cells using PicoGreen staining.</a> Experimental Cell Research. 303 (2), 432-446 (2005).</li>
<li>Jevtic, V., Kindle, P., Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYBR+Gold+dye+enables+preferential+labeling+of+mitochondrial+nucleoids+and+their+time-lapse+imaging+by+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SYBR Gold dye enables preferential labeling of mitochondrial nucleoids and their time-lapse imaging by structured illumination microscopy.</a> PLoS One. 13 (9), e0203956(2018).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコルにはいくつかの重要な要素があります:ミトコンドリアDNAの優先標識を達成するために、インキュベーション中のDNA結合色素の濃度は非常に低く(例えば、典型的な商業ストックの1:10,000希釈)、およびインキュベーション時間は30分であるべきです。インキュベーション時間は1時間を超えてはならない SYBR ゴールド染料を使用する必要があります。他のDNA結合色素は、低濃度で標識すると強いシグナルを生成するほど明るくない。
我々のプロトコルの限界は、色素が透過性のステップの間にミトコンドリアヌクレオイドから洗い流されるということです。したがって、記載された手順は、従来の免疫蛍光プロトコルには適していない。この場合、固定細胞内のヌクレオイドは、DNAまたはミトコンドリア転写因子(TFAM)に対する抗体などの他の技術で効率的に標識することができる。
DNA結合性有機色素を用いたミトコンドリアヌクレオイドの直接標識は、蛍光タンパク質標識よりも利点があります:任意のタイプの細胞は、蛍光タンパク質タグ付き構築物の一時的または安定し...

円形の16.5kbp DNA分子はミトコンドリアの遺伝物質を構成し、ミトコンドリア酸化リン酸化複合体に必要な22のtRNA、2つのrRNA、および13のポリペプチドをコードする。ミトコンドリア転写因子a(TFAM)および他のいくつかのタンパク質に結合したミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアヌクレオイド11、2、3、42,3,4を形成する。ミトコンドリア核は、ミトコンドリアネットワーク55、66の成分間で移動し、再分配し、その形態学的改変、分裂または融合は細胞周期相、応力、および他の要因に応じて(Pernas et7.また、ミトコンドリアヌクレオイドの運動は、全身性エリテマトーデス病8に関与し、他の疾患に関与しうる。蛍光顕微鏡は、オルガネラの生細胞研究のための簡単な技術であるが、この技術は、ミトコンドリアヌクレオイドのサイズよりも大きい>200nmの解像度を有する(〜100 nm99、10、11、12)。10,11,12この限界は、刺激放出枯渇(STED)および単一分子局在化顕微鏡(SMLM)13,14のようないわゆる「超解像」技術によって回避された。13,14これまで、ミトコンドリアヌクレオイドおよび他のDNAは、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)15によって生細胞で画像化された。15mtDNAと相関する位置を有する微細なサブミトコンドリア構造は、生細胞16においてSTEDにより観察された。しかしながら、これらの超解像技術は高い照明強度を必要とし、生細胞17に光毒性作用を引き起こす。したがって、回折限界を超える解像度を有するミトコンドリアヌクレオイドのタイムラプスイメージングは困難である。これに対処するために、我々は超解像構造照明顕微鏡(SR-SIM)1818を使用した。SIM は、STED および SMLM19よりもはるかに低い照明電力線量を必要とします。さらに、STEDおよびSMLM技術とは対照的に、SIMは単純な多色三次元(3D)イメージングを可能にし、フルオロフォアまたはイメージングバッファ組成物19の特定の光物性を必要としない。
生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの標識に関する従来の戦略は、TFAM20のようなミトコンドリアヌクレオイドタンパク質の蛍光タグ付けである。しかし、多くの場合、この戦略は適していません。さらに、蛍光タンパク質タグ付きTFAMの過剰発現は、深刻な人工物21を生成する。有機色素によるDNAの標識は、蛍光タンパク質(FP)ベースの戦略よりも優れた効果があります。有機色素はFPタグに関連する制約がない:それらは細胞または組織の任意のタイプに使用することができ、実験の任意の時点で適用することができる。ミトコンドリアヌクレオイドの生細胞イメージングは、いくつかのDNA結合色素で報告されている:DAPI2222、SYBRグリーン23、ヴィブラントDyeCycle24、およびピコグリーン15、25、26。15,25,26ヌクレオイド標識のためのほとんどのDNA結合色素の実質的な欠点は、それらが細胞内のすべてのDNAを染色することです。ミトコンドリアDNAのみに対する色素の標的化は非常に望ましい。そのためには、適切な物理化学的性質を有する色素を慎重に選択することが必要である。ローダミン123のような非局所陽性電荷を有する親油性染料は、その陰性膜電位を保持する生のミトコンドリアに蓄積することが知られている。さらに、ミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識に理想的な色素は、高い親和性を持つDNAを結合し、DNA結合時に明るい蛍光を発する必要があります。これらの要件を考慮すると、特定のシアニン(例えば、ピコグリーン)が有望であるが、核DNAはミトコンドリアDNA15、25、26,25,26と同時にこれらの染料によって豊富に染色される。本プロトコルは、別のシアニン色素を有する生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、SYBR Gold(SG)、および時間経過超解像SIMビデオにおける核oidの追跡について説明する。また、SG染色された生細胞は、生細胞に適したあらゆる種類の反転蛍光顕微鏡(共焦点、紡績円盤、蛍光等)で、488nmの光源を備えて画像化することができます。

<table><tbody><tr><td>Elyra PS1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>マルチモーダル超解像顕微鏡 超解像構造化照明顕微鏡用モジュール(SR-SIM)</td></tr><tr><td>高グルコースDMEM</td><td>GIBCO/ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>同上35 mm皿、ガラス底</td><td>Ibidi Gmbh</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>同上8ウェルマイクロスライド、ガラス底</td><td>Ibidi Gmbh</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane/Oxford Instruments</td><td></td><td>画像処理および視覚化ソフトウェア パッケージ</td></tr><tr><td>iXon 885</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>EMCCD カメラ 裏面照射型センサー付き</td></tr><tr><td>LSM880 Airyscan</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡 アレイ検出器付き</td></tr><tr><td>Mitotracker CMXRos Red</td><td>ThermoFischer</td><td>M7512</td><td>赤 生細胞 ミトコンドリア染色</td></tr><tr><td>Mitotracker ディープレッド FM</td><td>ThermoFischer</td><td>M22426</td><td>遠赤色の生細胞 ミトコンドリア染色</td></tr><tr><td>picoGreen</td><td>ThermoFischer</td><td>P7581</td><td>細胞透過性 DNA染色</td></tr><tr><td>プラン アポクロマート 100x/1.46 オイル対物レンズ</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR ゴールド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S11494</td><td>細胞透過型 DNA染色</td></tr><tr><td>ゼンブラック 2012 ソフトウェア</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>画像取得および処理ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

ミトコンドリアヌクレオイドは、ミトコンドリアDNA分子によって形成されるコンパクトな粒子であり、タンパク質で被覆される。ミトコンドリアDNAは、tRNA、rRNA、およびいくつかの必須のミトコンドリアポリペプチドをコードする。ミトコンドリア核は、核分裂/融合および他の形態学的変化を受ける動的ミトコンドリアネットワーク内で分裂し、分布する。高解像度ライブ蛍光顕微鏡は、核酸の位置と動きを特徴付けるための簡単な技術です。この技術では、ヌクレオイドは、一般に、それらのタンパク質成分、すなわち転写因子a(TFAM)の蛍光タグを介して標識される。しかし、この戦略は、蛍光タンパク質タグ付き構築物の過剰発現を必要とし、アーティファクト(TFAMについて報告)を引き起こす可能性があり、多くの場合実現不可能である。有機DNA結合色素はこれらの欠点を有しない。しかし、彼らは常に核およびミトコンドリアDNAの染色を示し、したがってミトコンドリアヌクレオイドに特異性を欠いている。このような色素の物理化学的性質を考慮して、核酸ゲル染色(SYBR Gold)を選択し、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの優先標識を達成した。色素の特性、特にDNAに結合する際の高輝度は、超解像構造照明画像の時系列を用いてミトコンドリア核体運動のその後の定量化を可能にする。

SGを用いて生細胞ラベリングを特徴づけ まず、種々の希釈液における色素とのインキュベーション時の細胞内のSGの分布は、共焦点顕微鏡によって特徴付けられた。SGまたはpicoGreenの高濃度でインキュベーションした後、両方の染料は主に核を標識し、細胞質にパンクチット染色を示した(図1)、同様に別の正に帯電したシアニン色素(すなわち、ピコグリーン)15に関する公表されたデータと同様である。しかし、1:10,000希釈時にSGとのインキュベーションを行った際、核内にかすかな染色が現れ、細胞質では明るいスポットのパターンを観察した(図1)。一方、ピコグリーン染料を希釈してインキュベーションを1:10,000で、主に核染色を行った。SG信号は、同じ濃度でピコグリーンのそれよりもはるかに明るかった。データは、SGが他の同様のDNA結合色素よりもミトコンドリアDNAをイメージング...

このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識と、その運動の高分解能における定量的研究を可能にする。蛍光色素によるインキュベーションは、蛍光タンパク質の必要性をバイパスするだけで、関連するアーティファクトや制限を回避し、トランスフェクト不可能な細胞にプロトコルを適用することができます。優等核の染色を達成するためには、SYBR Goldを使用し、最適化した条件下では何も使用しないでください。さもなければ、全細胞DNAが染色され得る。ラベリング手順の1日前に、35ミリメートルペトリ皿中の培地2ミリリットルで5番目のHeLa細胞に10回10回培養する。翌朝、2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄してから、フェノール赤自由培養液1ミリリットルと適切な2Xラベリング溶液の1ミリリットルを添加する。30分37度と5%の二酸化炭素で、上清を含む色素を各35ミリメートルのペトリ皿から慎重に吸引し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗います。次に、新鮮なフェノール赤自由細胞培養培地で細胞を供給し、生きたイメージングまで光から保護された培養インキュベーターに培養液を戻す。ライブセルイメージングの場合、イメージングセッションの少なくとも1時間前に、ステージトップインキュベーターを超解像度の構造照明顕微鏡ステージに配置し、レーザーを含む顕微鏡のすべてのコンポーネントの温度を摂氏37度に、二酸化炭素濃度を5%スイッチに設定し、高倍率、高数値開腹浸漬目的を選択します。レーザーが温まったら、35ミリメートルのペトリ皿を顕微鏡のステージに取り付け、眼を使って皿の底に取り付けられた細胞で関心のある領域を見つけます。超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得するには、バックエンドハイエンド電子乗算電荷結合デバイスカメラを使用します。画像取得ソフトウェアでは、カメラに推奨される高電子乗算ゲインを設定します。ヌクレオイド追跡用のタイムラプスシリーズを取得する前に、ミトコンドリア染色用の1つのチャネルとSYBR金用の別のチャネルで同じ視野の2色超解像度の構造化照明顕微鏡画像を取得します。ミトコンドリア画像カラーチャネルを、使用するミトコンドリア染色に適した励起と放出に設定し、SYBRゴールド色素に適した励起およびバンパスエミッションフィルタを設定します。両方のチャンネルに可能な限り低いレーザーパワーを設定します。顕微鏡が連続的にチャンネルを取得する場合は、ミトコンドリア染色検出用のチャネルをオフにします。ソフトウェアの Z スタック ボックスのチェックを外して、Z スタックの取得をオフにして単一の焦点面の取得を設定し、カメラの露出時間を最短に設定します。グリッドの3回転を設定し、複数のレーザーパワー値と数回の露出時間でラベル付けされたセルの2次元画像を取得し、カメラの露出時間にレーザーパワーを最適化します。ほとんどまたは全くアーティファクトを持つミトコンドリアの明るいスポットを持つ構造化された照明顕微鏡画像を生成するレーザーパワーとカメラの露出時間を選択し、最適化された設定を使用してタイムラプスシリーズの取得を開始します。タイムラプス画像の解析のために、変換された構造化照明顕微鏡画像とスポットトラッキングモジュールを備えた適切な画像解析ソフトウェアを開き、[新しいスポットを追加]をクリックしてスポット作成ウィザードを開始します。[作成] タブで[時間の経過に従ってスポットを追跡]をクリックし、ウィザードの 2 番目の手順に進みます。推定 x-y 直径を 0.1 ~ 0.15 マイクロメートルに設定します。[背景の減算] をクリックし、ウィザードの 3 番目の手順に進みます。ヒストグラムの垂直線をドラッグして、各フレーム内でアーチファクト内のスポットが検出されないとき、大部分のヌクレオチドが検出されるまで、品質フィルタの閾値を調整します。ウィザードの 4 番目と 5 番目の手順に進み、自己回帰モーション アルゴリズムを選択します。最大距離を 0.5 マイクロメートルに、最大ギャップ サイズをゼロに設定します。微調整されたパラメーターにより、ソフトウェアがすべてのスポットを検出してトラックを正しく作成できる場合は、矢印ボタンをクリックしてトラックの作成を確認し、統計情報アイコンをクリックしてトラックの統計情報を抽出します。次に、必要な統計情報パラメータを選択し、[名前を付けて保存]をクリックして、値をドット CSV ファイルとしてエクスポートして定量化と視覚化を行います。SYBR金またはピコグリーンの高濃度で標識すると、核の豊富な染色と細胞質内の穿刺染色が生じます。より低い濃度では、細胞質内で明るいスポットのパターンで核内にかすかなSYBR金シグナルが現れる。低濃度でのピコグリーン標識は、主に核染色をもたらす。遠赤色ミトコンドリア色素中のSYBR金の低濃度で同時染色すると、SYBR金染色のほとんどすべてがミトコンドリア内で起こり、高濃度で標識すると核および細胞質の有意な染色が生じることが明らかになる。タイムラプスイメージングは、45分後にヌクレオイド染色が飽和に近いことを明らかにします。固定は、固定細胞の透過化はミトコンドリアの点線染色パターンを排除し、核染色を強化しながら、核への色素のわずかな再分配を引き起こす。SYBR金が固定および透過化後に細胞に添加された場合、色素は細胞質と核全体に均一に分布し、染色特異性の損失をもたらす。超分解能構造照明顕微鏡による生細胞3Dイメージングは、ミトコンドリア内の明るいスポットとしてミトコンドリアヌクレオイドを明らかにする。回折限界を超える解像度で核の位置を追跡することは、核の大部分がミトコンドリアネットワークに限定される短距離のランダムな動きを示すことを示しています。このプロトコルはサンプルの固定と互換性がないことに注意することが重要です。しかし、我々のプロトコルは、分子およびオルガネラの形態、ダイナミクスおよび活動の研究のための生細胞画像に基づくアッセイの広い範囲と互換性があるべきである。我々の研究は、細胞ベースの技術のための非有機色素を再標的化することの利点を示している。細胞研究におけるその応用のために他の蛍光色素の探索を促すかもしれない。

specific-labeling-mitochondrial-nucleoids-for-time-lapse-structured

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Kennedy, L. H., et.al. アデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた器官型脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトオルガネラの可視化とライブイメージング。J. Vis. Exp.

器官型脳スライス培養におけるオリゴデンドロサイト内のミトコンドリア運動の共焦点イメージング

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。...

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

ベーカーの酵母ミトコンドリアゲノムは8つのポリペプチドをコードする。現在のプロトコルの目的は、すべてのラベルを付け、後で別々のバンドとして視覚化することです。...

ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。...

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

このプロトコルは刺激された放出枯渇(STED)の顕微鏡検査を使用してミトコンドリアの微細構造の視覚化および分析のための培養されたSH-SY5Yのセルそして第一次ラットの海馬ニューロンの伝播、微分および汚損のためのワークフローを示す。...

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

この研究では、ステップバイステップのプロトコルを説明し、サンプル調製、画像取得、データ解析など、生細胞のミトコンドリアの形態学的特性を決定するための重要な詳細を強調します。この方法は、さまざまな条件を研究するためにミトコンドリアの形態を調べるために一般的に使用されます。...

共焦点顕微鏡法を用いた生細胞のミトコンドリア形態の決定

ここでは、ミトコンドリアの分裂と融合活動の経時的な3次元変化の定量化に役立つImageJプラグインであるミトコンドリアイベントローカライザー(MEL)について説明します。また、ImageJでの分析前の顕微鏡写真のクリーンアップに役立つ画像処理パイプラインについても説明します。...

動的および3次元蛍光顕微鏡写真によるミトコンドリア形態の変化の理解

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP...

高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

学ぶミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識法。SYBR Goldを用いた生細胞での高解像度タイムラプス構造照明顕微鏡法により、HeLa細胞における動的挙動を定量的に解析できます。蛍光タンパク質発現不要で非トランスフェクション細胞にも適用可能です。

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

さらに動画を探す