動的および3次元蛍光顕微鏡写真によるミトコンドリア形態の変化の理解

私たちの研究の目的は、ミトコンドリアネットワークの変化を観察し、これらのミトコンドリアネットワークが細胞の状態に応じてどのように変化するかを調べることです。フィジーやPythonなどのオープンソースツールを使用し、既存のライブラリとカスタムマクロおよびスクリプトを組み合わせて、複雑な蛍光顕微鏡データからのミトコンドリア形態解析を自動化しています。ミトコンドリアの核分裂と融合のダイナミクスを3Dで局在化して記述する信頼性の高い定量的データと指標を達成することは、依然として課題です。

このようなデータ生成の標準化は一般的に利用できません。したがって、細胞特異的な分裂と融合の頻度、および細胞内局在に関する知識は限られています。ミトコンドリアの分裂と核融合の生命検出を利用可能な研究指標に追加しました。

そして、これらをミトコンドリア構造数と組み合わせることで、ミトコンドリアネットワークのダイナミクスを理解するための新しい指標を定義することができました。私たちの発見により、細胞特異的な分裂と融合のパラメーターを特徴付け、ミトコンドリア系が平衡状態にあるかシフトしているかを初めて判断することができます。これにより、健康や病気における表現型の大きな誤解が防止され、正確な報告のための明確な枠組みが提供されます。

まず、ImageJ で raw ファイルを開きます。色の設定を調整して、関心のある領域の視認性を高めますが、何も設定しないでください。分析する必要がある単一セルの数に応じて画像を複製します。

視野に複数のセルが存在する場合は、[解析]、[ツール]に移動し、[同期ウィンドウ]ツールと[フリーハンド描画]ツールを使用して、対象のセルの周囲に対象領域を描画し、[編集]を選択して[外部をクリア]を選択して、選択したセルを分離します。赤と青のチャンネルを互いに分割し、ミトコンドリアチャンネルをtifファイルとして保存します。ポイントスプレッド関数または PSF を生成するには、RAW イメージを再度開きます。

次に、[プラグイン] を選択し、次に [PSF ジェネレーター] を選択して [Born wolf 3D Optical Model] を選択して、PSF ジェネレーター プラグインを開きます。Image(イメージ)を選択し、[Show Information](情報を表示)を選択するか、キーボードのIを押して、RAWイメージのイメージ情報を開きます。画像情報ウィンドウの一番下までスクロールします。

ボクセルサイズと深度オプションを選択し、波長を568ナノメートルに変更します。ピクセルサイズXYを166.1ナノメートル、Zステップを200ナノメートルに設定します。サイズ XYZ を 512 x 512 の画像解像度に一致するように設定し、10 個の Z スライスを含むように Z スタックを設定します。

[実行] をクリックします。PSF を tif ファイルとして独自のフォルダーに保存します。[プラグイン] に移動し、[マクロ] を選択し、[編集] を選択し、[Deconvolution_time_lapse_mine] の順に選択します。

ijm を使用してデコンボリューションマクロにアクセスします。必要に応じて入力行と出力行を編集し、[実行] を押してマクロを実行します。画像のコントラストの強調とぼかしを行うには、[プラグイン] に移動し、[マクロ] を選択し、[編集] を選択して前処理を開きます。

ijm を使用して前処理マクロにアクセスします。転がるボールの半径を6に設定して、背景減算を実行します。シグマフィルタプラス(Sigma Filter Plus)は、半径がスケールファクターの1倍に設定されるように設定します。

使用されるピクセル数は 2 で、最小ピクセル率は 0.2 で、プラグインが外れ値を認識するように設定されています。ブロック・サイズを 64、ヒストグラム・ビンを 256、最大傾きを 2.5、ガンマを 0.8 に構成して、CLAHE 設定を調整し、「実行」をクリックします。前処理を使用して変更された目的のファイルを開きます。

ImageJのijmマクロ[プラグイン] に移動し、[アダプティブしきい値] を選択します。ローカルしきい値を加重平均に設定し、必要に応じてピクセルブロックサイズを調整します。

[プレビュー] をクリックし、ブロック サイズを調整して、できるだけ多くのミトコンドリアを明確に含めます。各セルの減算値を変更して不要な背景を排除し、結果の顕微鏡写真をメモします。時間を最適化するには、適用された減算値に従って画像をファイルに並べ替えます。

次に、[プラグイン] に移動し、[マクロ] を選択し、[編集] を選択して [しきい値] を開きます。ijm を使用してしきい値マクロにアクセスします。マクロスクリプトを編集して、正しい入力パスと出力パス、ブロックサイズ、および減算値を定義します。

[実行] をクリックしてマクロを実行します。同じ治療条件に属する最大10枚の閾値付き顕微鏡写真を開きます。[Image]、[Stacks]、[Tools]に移動し、[Concatenate]を選択し、[OK.To を押してしきい値によって残された小さな涙点を削除し、[Plugins]、[Integral Image Filters]の順に進み、[Remove Outliers]を選択します。

プレビューを使用して X サイズと Y サイズを微調整し、フラグメントを削除します。連結されたファイルを TIF ファイルとして保存します。最後に、[プラグイン]、[マクロ]、[編集]、[QuickTest_new.ijm]に移動します。

適切なディレクトリを指すように入力パス行と出力パス行を編集し、[実行] をクリックして、ミトコンドリア イベント ローカライザーまたは MEL の結果を視覚化します。ミトコンドリアのダイナミクスは、3Dビューと2Dビューの両方で、赤い涙点マーキング核分裂イベントと緑色の涙点マーキング融合イベントで経時的に追跡されました。ミトコンドリアネットワークは、メトホルミン処理細胞ではより細長く相互接続された形態、メトホルミンCCCP Baf処理細胞では高度に断片化されたネットワークで、時間の経過とともに構造に治療特異的な違いを示しました。

メトホルミンCCCP Baf群は、対照群またはメトホルミンのみ群よりも有意に高い分裂および融合活性を示し、ミトコンドリアリモデリングの増加を示唆しました。このグループはまた、断片化の強化と一致して、ミトコンドリア数が有意に高かった。ミトコンドリアの体積は同じグループで有意に減少し、核分裂への移行をさらに裏付けました。

しかし、ミトコンドリア数に正規化すると、メトホルミンのみのグループが最も高い相対動的活性を示し、メトホルミン単独でより活発で効率的なリモデリングネットワークを促進する一方で、同時処理は広範ではあるが効率の低い構造代謝回転を促進することを示唆しています。