Name: 多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学ぶ角度付き定位手術法でマウスおよびラットの脳深部領域へのカニューレ挿入とウイルス微量注入を行う方法。この適応可能なプロトコルはオプトジェネティクスやケモジェネティクスなど多様な神経科学研究への応用を可能にする。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)がF31-DK-113673(C.L.F.)、T32-GM-095421(C.L.F.)、DK-089056(C.L.F.)を助成金で支えました(.M 米国糖尿病学会革新的基礎科学賞(#1-19-IBS-192からG.J.M)、NIDDK出資の栄養肥満研究センター(DK-035816)、糖尿病研究センター(DK-017047)、糖尿病、 肥満と代謝トレーニンググラントT32 DK0007247(T.H.M)ワシントン大学で。

すべての手順は、国立衛生研究所、動物のケアと使用のためのガイドに従って承認され、ワシントン大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)と環境安全衛生の両方によって承認されました。
1. 角度付き座標の計算
<ol><li>コロナ脳アトラスを使用して、斜辺が対象のターゲット領域を通過するように直角三角形をマークします。代表例(図1)では、視床下部心室核(VMN)は、コロナ中線から15°の角度で標的化されています。 注: 図 1 に示されている回転軸の位置 (つまり、側面 C の長さ) は任意であり、任意の脳領域を対象とするように変更できます。これは直感に反しているように見えるかもしれませんが、プロトコルの後のステップでは、この点が回転の定位中心に合うように z 軸の頭部の位置を調整します (セクション 6 を参照)。ただし、ヘッドホルダー装置の物理的な制約により、コロナ回転角度15°を超えないようにすることをお勧めします。</li>
	<li>必要な角度(a)と辺Bの推定長さを設定し、三角法を使用して側面AとCの長さを計算します。このステップは、回転中にヘッドを適切に配置するために重要です。 注: 図 1の例では、アトラスグリッド線を使用して側面 B の長さを近似し、長さが 7.576 mm になります。この情報は、辺 A の長さを計算するために使用されます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg"> この例では、2.03 mm は、頭が 15 度回転したときに光ファイバーカニューレが脳に入る正線からの R/L 距離を示しています。<ol>
<li>必要に応じて、D/V 座標を近似するために、側面 C の長さを計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg"> 注: 1) 斜辺の長さ (C) は射出深度を表しませんが、D/V 座標を決定するのに役立ちます。したがって、D/V 座標を最適化するためにテストインジェクションを実行することをお勧めします。2) VMNを対象としたこの例では、角度のないマイクロインジェクション(A/ P = -1.4、R/L = 0.4 0°、D/V = -5.7)の2つの座標と、角度付き光ファイバー移植用(A/P = -1.4、R/L = 0.0、15°、D/V-5.4)の2つの座標が得られます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 角度付き手順のためのステレオタックスの準備
<ol><li>定位フレームとマイクロマニピュレータがキャリブレーションされていることを確認します(完全なプロトコルについてはKopfのマニュアルを参照してください)。</li>
	<li>ヘッドホルダーベースプレートのソケットに中央の高さゲージを配置します。</li>
	<li>ツールホルダーの中央のスコープを固定し、スコープを見下ろします。十字線が位置合わせされ、ゲージの十字線に焦点が合わされるまで、マイクロマニピュレータの位置を調整します。 注: このステップでは、スコープはヘッドホルダーの回転中心の焦点面に配置されます。いったん確立された後は、残りのステップ中にマイクロマニピュレータを移動しないでください。</li>
	<li>イヤーバーをホルダーに配置し、両側のインジケータ線が0になるように中央に配置します(図3A)。</li>
	<li>ヘッドホルダーの内側横および前後部ノブ(図2)を使用して、中央の高さゲージの十字線の上にあるX面とY面のイヤーバーを中央揃えにします(図3A)。</li>
	<li>Z 軸のイヤー バーの位置を揃えるには、ホルダーからイヤー バーを取り外し、中央の高さゲージを取り外します。イヤーバーを交換し、0でもう一度中央に配置します。</li>
	<li>スコープを見下ろす。垂直シフトノブ(図3B)とコロナチルトノブをそれぞれ使用して、スコープのクロスヘアがコロナ回転中ずっとイヤーバーの間を中央に配置されるまで、イヤーバーを下方向に回転させます。</li>
	<li>ステレオタックスは現在、キャリブレーションされ、準備ができています。ヘッドホルダーの位置を調整しないでください。</li>
</ol>3. 注射・注入用材料の調製
<ol><li>すべての器具、手術器具、材料が滅菌され、ステレオタックスの隣の無菌外科分野に置かれていることを確認してください。</li>
	<li>バイオセーフティレベルおよび関連する機関バイオセーフティ規制要件に従って、ウイルス構造を取り扱い、保管します。</li>
	<li>適切な取り扱いの練習と個人的な保護具を使用するように注意して、注射器にウイルスを引き出します。</li>
</ol>4. 麻酔
<ol><li>手術前にマウスの体重を記録します。</li>
	<li>イオブルランを使用してマウスを深く麻酔します。</li>
	<li>ひるむ応答がなくなるまでつま先ピンチテストを実行して、マウスが深く麻酔されていることを確認します。動物が強い反射神経を示し続ける場合は、濃度および/または麻酔の持続時間を増加させます。</li>
	<li>手術中にしっとりと保つために、各目に眼軟膏を塗布します。</li>
	<li>頭皮を耳のすぐ後ろから、髪の毛のクリッパーで目のすぐ後ろに剃ります。</li>
	<li>マウスにIACUC承認鎮痛薬を提供します。</li>
	<li>外科処置を通して動物を絶えず監視し、熱的サポートを提供する。</li>
</ol>5. 外科的処置
<ol><li>上部切歯を咬切り棒の隙間に入れ、舌が咬棒の下であることを確認してヘッドホルダーに入れる。</li>
	<li>耳の棒を外耳の肉にそっと挿入して、耳の棒を優しく挿入して、耳の棒が対称的に配置されるようにします(通常、大人のマウスでは3から4の間)。このステップは、ヘッドが安定し、回転に向けて中心を保つために重要です。</li>
	<li>無菌は、ベタジンとアルコール綿棒の3つの交互スクラブ、または代替機関承認の外科的部位製剤で剃った切開領域を調製する。</li>
	<li>動物の上に外科用ドレープを置いて、無菌の外科フィールドを維持し、術後感染のリスクを減らす。</li>
	<li>頭皮の矢状中線に沿って切開を行うことによって頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨の表面を静かにこすって筋膜を取り除き、縫合糸を露出させます。 注:縫合線を視覚化するのが難しい場合は、無菌綿先端アプリケータを使用して頭蓋骨に過酸化水素を適用して縫合体の視覚化を改善することができます。</li>
	<li>中央のスコープをホルダーに配置し、十字線をブレグマの中央に配置します(図4、左パネル)。マイクロマニピュレータをゼロにします。</li>
	<li>ブレグマ-ラムダ(B-L)距離に、十字線をλに移動します。 注: 縫合線が正線に沿って直線に沿っていない場合は、bregma とラムダの両方を通して「最適な線」を使用して正線を確立することをお勧めします。ただし、上記の手順に従う場合、スコープレチクルの初期配置は、耳のバーの中間に、B-L正線縫合糸を近似する必要があります。</li>
	<li>B-L距離が4.21mmより大幅に小さいか大きい場合は、割り当てられたブレグマを段階的に調整して、4.21mm±0.2mmのB-L距離を得ます。</li>
	<li>中央揃えのスコープを配置インジケーターに置き換えます。プローブをラムダとブレグマに置き、ヘッドホルダーの後側チルトノブを矢状平面(上または下向きの機首)に調整し、センタリングスコープを使用してブレグマを再割り当てします。</li>
	<li>アライメントインジケータを使用して、コロナチルトノブを使用してコロナ平面のレベルを設定します。頭蓋骨の表面変形を考慮して、ロストラル/尾軸全体の複数のポイントで測定します。</li>
	<li>コロナチルトノブのダイヤル上の位置は0°回転位置です。</li>
</ol>6. 角度の付いた座標に対する回転の中心軸の位置合わせ
<ol><li>ツールホルダの中央のスコープを固定し、マイクロマニピュレータをセクション 1 から計算された座標に配置します。角度付き注入のR/L座標は、側面Aの長さに対応することに注意してください。<ol>
<li>図 1の例では、VMN をターゲットとする光ファイバー配置の角度付き座標は、(A/P = -1.4、R/L = 0°コロナ回転で [2.03] 、コロナ回転が 15° の [0.00] 、D/V = -5.4) です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スコープを見下ろし、この座標をマークします(VMN の例ごとに、中間線から R/L 2.03 mm をマークします。 図4、中央パネル)。このマークは、頭が回転するとカニューレが脳に入るポイントを表します。</li>
	<li>マイクロマニピュレータを正中線に重ね合わせ(R/L = 0.00)します。コロナチルトノブを使用して、セクション1で計算された角度に頭を回転させます。<ol>
<li>スコープの十字線が既にマークに沿っている場合は、セクション 7 に進みます。</li>
		<li>スコープの十字線が基準マークに合っていない場合は、垂直シフトノブ(図 2)を使用して Z 軸のヘッド位置を調整し、十字線がマークにできるだけ近づくまで調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヘッドを 0° コロナ位置まで戻します。ステップ 6.3 で垂直シフトを調整した場合は、センタリングスコープを使用して bregma を再割り当てします。</li>
	<li>ヘッドを回転したときにクロスヘアが一貫して基準マークに当たるまで、手順6.3と6.4を繰り返します(図4C)。</li>
	<li>この時点で、セクション 1 で設定された任意の回転ポイントが、回転の定位中心に合わせて配置されます。</li>
</ol>7. マイクロインジェクション
<ol><li>ホルダに立体訓練を入れ、マイクロマニピュレータを最初の射出座標に操作します。<ol>
<li>VMN をターゲットにする例では、A/P = -1.4、R/L = 0.4 でドリルヘッドがレベルである間にドリルします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ビットが頭蓋骨のすぐ上になるまでドリルを下げます。ドリルをオンにし、ビットが頭蓋骨(硬膜ではなく)を通り抜けるまで穏やかに下げます。</li>
	<li>対側注射部位について繰り返します。</li>
	<li>滅菌ニードルドライバーを使用して、27〜30Gの針(例えば、無菌0.5mLインスリン注射器の)に90°ベンドを導入し、曲がった針を使用してデュラマーターを優しく突き刺します。</li>
	<li>注:出血が発生した場合は、無菌綿チップアプリケーターで圧力をかけ、出血が止まるまで無菌水で洗浄してください。</li>
	<li>注入する準備ができたら、慎重に定位ホルダーに充填されたハミルトン注射器を配置します。 メモ: 新しいツールに切り替えた後、マイクロマニピュレータの座標が適用されなくなりました。バリ穴の中心を、新しい注入のターゲットとして使用します。</li>
	<li>針をバリ穴の上に慎重に配置します。</li>
	<li>針を下げて、バリ穴の中央の硬膜にわずかに触れます。CRITICAL: ステレオチックセンタリングスコープとドリル用のマイクロマニピュレータの座標が維持されるように、マイクロマニピュレータをZ軸でのみゼロにします。</li>
	<li>針がバリ穴の端に偏向しないように注意深く見て、ゆっくりと針を脳に下げます。D/V射出座標まで0.05mmの腹側まで下げ続け、1分待ちます。この余分なステップは針の取り外しのウイルスの背流れを最小にする小さい「ポケット」を作成する。</li>
	<li>ゆっくりと針をD/V座標に上げ、注入を開始します。 注: 流量と体積は、ターゲット領域と実験計画によって異なります。VMNニューロンの光遺伝学的サイレンシングでは十分なカバレッジが望まれるため、200 nLのウイルスが1nL/sの割合で注入されます。</li>
	<li>マイクロインジェクションの後、退出中のウイルスの流出を最小限に抑えるために注射部位で10分待ちます。</li>
	<li>マイクロピペットを脳から1mm/分のおよその速度でゆっくりと引き出します。</li>
	<li>針が頭蓋骨から取り出されたら、少量のウイルスを排出して、針が血液や組織で詰まっていないかどうかを確認します。続行する前に、無菌綿チップアプリケーターを使用してウイルスを除去してください。</li>
	<li>反対側の手順 7.6 ~ 7.12 を繰り返します。</li>
	<li>マイクロインジェクションバリ穴を骨ワックスで密封して治癒を改善する(図5B)。</li>
</ol>8. 光ファイバー移植
注:ウイルス注入後、両側光ファイバーカニューレは、セクション1ごとに計算された角度で埋め込まれます。これらの座標は、セクション 6 から頭蓋骨に既にマークされている必要があることに注意してください。
<ol><li>角度付き座標について、手順 7.1 ~ 7.4 を繰り返します。</li>
	<li>ヘッドを 0°のレベルに戻します。</li>
	<li>次に、ハンドドリルを使用して、骨ねじ用の4つの追加の穴を生成します:2つは前に配置し、2つは後に配置する必要があります(図5A)。これらは、頭蓋に光ファイバーを貼り付けるアンカーとして機能します(図5D)。 注:頭蓋骨の上に座っている光ファイバーのフェルール部分を収容するために、角度付きの座標バリ穴から十分に離れた穴を配置してください。</li>
	<li>可能な限り穏やかに、小さなフラットヘッドドライバーを使用して、頭蓋骨にしっかりと座っているが、脳に浸透しないように骨ねじを設定します。</li>
	<li>光ファイバーカニューレをカニューレホルダーにクランプし、立体ホルダに入れる。</li>
	<li>計算された角度にヘッドを回転し、マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに再度示します。傾斜したバリ穴の中心を埋め込み対象として使用します。</li>
	<li>バリ穴の中央にある硬膜に触れるまで光ファイバーを下げます(図5C)。マイクロマニピュレータを z 軸にゼロにしてから、光ファイバーを D/V 角度の座標 (VMN の例ごとに -5.4) までゆっくりと遅くします。</li>
	<li>シアノアクリル酸ゲルを使用して光ファイバーフェルールをイプシラアンカースクリューに接続し、マイクロピペットチップを備えた加速剤を塗布します(図5D)。</li>
	<li>シアノクリレートゲルが完全に硬化したら、カニューレホルダーを緩め、光ファイバーのフェルールがクリアになるまで上げます。</li>
	<li>反対側の角度の座標に対してステップ 8.5 ~ 8.9 を繰り返し、ヘッドをレベル付けします。さらにセキュリティを強化するために、シアノクリレートゲルと加速器を使用して2つの角度光ファイバーカニューレとの間に追加の接続を行います(図5D)。</li>
	<li>歯科用セメントの小さな、比較的薄い量を準備します。頭蓋骨の表面に塗布し、光ファイバーカニューレのアンカーネジとベースを徹底的に覆うようにします。光ファイバーパッチケーブルでの後の交配のために、フェルールを十分に清潔にしておきます。</li>
	<li>セメントが乾燥したら、本位戦術装置からマウスを取り外します。</li>
	<li>サーマルサポート付きの回復ケージにマウスを置きます。それがアラート、モバイル、およびグルーミングが表示されたら、それが回復し、ホームケージに転送することを許可します。</li>
</ol>9. 手術後のケア
<ol><li>行動、姿勢、活動、グルーミングについて、手術後3日間毎日動物を監視し、食物摂取量と体重の記録を保持します。</li>
	<li>動物が痛みや健康状態の悪さの一般的な指標を示す場合は、獣医師のサービスに相談してください。</li>
	<li>行動研究を開始する前に、回復とウイルス発現のために少なくとも2週間マウスを許可する。</li>
</ol>10. 光遺伝学
<ol><li>光遺伝学研究のパフォーマンスについては、 Sidorら 8 を参照してください。</li>
	<li>研究の完了時にウイルス発現と繊維の配置を検証する。</li>
</ol>

<ol><li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise%2C+fall%2C+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li>
<li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534(2019).</li>
<li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing%2C+packaging%2C+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783(2016).</li>
<li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653(2015).</li>
<li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food%2C+Water%2C+and+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li>
<li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483(2015).</li>
<li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Scences%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li>
<li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li>
<li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549(2017).</li>
<li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+topic+in+optogenetics%3A+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

最近の神経科学の進歩は、脳神経回路の活動と機能に関する高度な洞察と理解を支えています。これには、生体内の離散ニューロン集団とその投影部位を活性化または沈黙させる光遺伝学的および化学遺伝学的技術の適用が含まれる。最近では、遺伝子組み換えカルシウム指標(GCaMP、RCaMPなど)および他の蛍光バイオセンサー(ドーパミン、ノルエピネフリンなど)の開発が含まれており、自由に動く動物における定義された細胞型における神経活動のインビボ記録に関する。しかし、これらの技術の効果的な雇用は、関心のある地域をターゲットにするために成功した立体的手術に依存しています。これらの方法を記述するいくつかの確立されたプロトコルがありますが、多くの脳領域を標的にするのに適していますが、正中線に沿って深部脳領域を標的にすることは、重要な追加の課題を表しています。ここで実証は、角度付きの定型的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための詳細な外科的技術である。重要なことに、この技術は、多様な神経科学技術(光遺伝学、化学遺伝学、光測定法のアプローチ)に適応し、適用することができます。
このアプローチを用いて、ニ...

行動、摂食、代謝の神経制御は、高度に複雑で統合的で冗長な神経回路の調整を伴う。神経科学分野の駆動目標は、神経回路構造と機能の関係を解剖することです。古典的な神経科学ツール(すなわち、病変、局所薬理注射、および電気刺激)は、行動および代謝を制御する特定の脳領域の役割に関する重要な知識を発見しているが、これらのツールは特異性および可逆性の欠如によって制限される。
近年の神経科学分野の進歩により、高い時空間分解能を持つ細胞型特異的な方法で回路機能を問い合わせて操作する能力が大幅に向上しています。例えば、光遺伝学2 および化学遺伝学的3 アプローチは、自由に動く動物の遺伝的に定義された細胞タイプにおける活動の迅速かつ可逆的な操作を可能にする。光遺伝学は、神経活動を制御するために、光感受性イオンチャネル、いわゆるチャネルロドプシンの使用を含む。この技術の鍵は、オプシンを活性化するチャネルロドプシンおよび光源の遺伝子送達である。遺伝子導入の一般的な戦略は、1)離散ニューロンでCre-recombinaseを発現する遺伝子操作マウスと、2)チャネルロドプシンをコードするCre依存性ウイルスベクターの組み合わせによるものである。
光遺伝学は、神経活動を制御するためのエレガントで非常に正確な手段を提供するが、この方法は、定義された脳領域へのウイルスベクターおよび光ファイバー配置の正常な立体的マイクロインジェクションに依存する。立体的な手順は現代の神経科学研究室では一般的であるが(そして、この手順を記述するいくつかの優れたプロトコルがある)4、5、6、中線に沿って一貫して再現的に離散的な脳領域を標的にすることができる(すなわち、心座視下部、恒常性機能の調節に不可欠な脳領域7)は、追加の課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状の座頭座、第3心室、および隣接する視床下部核の回避が含まれる。さらに、阻害研究に必要なハードウェアの二国間注入には有意な空間的制限がある。これらの課題を念頭に置いて、本明細書では、このプロトコルは、角度付きの定位的アプローチを介して離散的な脳領域を標的にするための変更可能な手順を提示する。

<table><tbody><tr><td>光ファイバーカニューレ</td><td>ドーリックレンズ</td><td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td><td>カスタマイズ可能な</td></tr><tr><td>Kopf モデル 1900 脳定位固定装置</td><td>Kopf</td><td>モデル 1900</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1900-51 センターハイトゲージ</td><td>Kopf</td><td>モデル 1900-51</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1905 アライメントインジケーター</td><td>Kopf</td><td>モデル 1905</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1911 脳定位固定装置</td><td>Kopf</td><td>モデル 1911</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1915 センタリングスコープ</td><td>Kopf</td><td>モデル 1915</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1922 60 度非破裂イヤーバー</td><td>Kopf</td><td>モデル 1922</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1923-B マウスガス麻酔ヘッドホルダー</td><td>Kopf</td><td>モデル 1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kopf モデル 1940 マイクロマニピュレーター</td><td>Kopf</td><td>モデル 1940</td><td></td></tr><tr><td>Micro4マイクロインジェクションシステム</td><td>World Precision Instruments</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>マウス、骨ネジ</td><td>、プラスチック、</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr>、<tr><td>脳定位カニューレホルダー、1.25mmフェルール</td>、<td>トールラボ、</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドリル、</td><td>セルポイント、サイエンティフィック</td><td>、イデアルマイクロドリル</td><td></td></tr></tbody></table>

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

定位外科は現代の神経科学研究室で不可欠なツールです。しかし、到達困難な脳領域を正確かつ正確に標的にする能力は、特に正中線に沿って脳構造を標的とする場合には依然として課題を提示する。これらの課題には、優れた矢状脳および第3心室の回避と、選択的および離散的な脳核を一貫して標的とする能力が含まれる。さらに、より高度な神経科学技術(例えば、光遺伝学、光測定、2光子イメージング)は、脳への重要なハードウェアの標的移植に依存しており、空間的な制限は一般的な障害である。ここで提示される、角度付きコロナアプローチを用いたげっ歯類の脳構造の定位的な標的化のための変更可能なプロトコルである。1)マウスまたはラットモデル、2)様々な神経科学技術、および3)複数の脳領域に適応することができる。代表的な例として、光遺伝学的阻害実験に対するマウス視床下部心室核(VMN)の標的化に関する定位座標の計算が含まれる。この手順は、光感受性クロリドチャネル(SwiChR++)をクレ依存的なマウスモデルにコードするアデノ関連ウイルス(AAV)の二国間マイクロインジェクションから始まり、続いて光ファイバーカニューレの斜めの両側移植が行われます。このアプローチを用いて、インシュリン誘発低血糖に対するグルコース対調節応答に対するVMNニューロンのサブセットの活性化が必要であることを示す。

このプロトコルは、血糖制御における視床下部VMNニューロンの役割を問い合う光遺伝学的研究を行うための外科的処置を説明する9。最初に利用されたのは、抑制性チャネルロドプシンウイルスのVMNへの二国間マイクロインジェクションに対する標準的な(非角度)定位的アプローチであった。角度付きアプローチも適していますが、対象となる脳領域をターゲットにするのに十分であり、簡単で信頼性の高い一貫したアプローチであるため、標準(非角度)アプローチが選択されました。しかし、VMNが正中線に近いことを考えると、空間制約は二国間光ファイバーの非角度移植を可能にせず、光ファイバーを正確に角度で埋め込む外科戦略の開発を必要としなかった(図6)。
この手術戦略を用いて、蛍光レポーターと融合した修飾チャネルロドプシンアニオン伝導チャネルを発現するCre依存型AAVを、二国間でNos1-creマウスのVMNに対して「SwiChR++」ウイルス10と呼ぶ。その後、正...

ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

このプロトコルは、マウスとラットの両方で利用でき、多くの新しい神経科学技術に適用できる適応可能な定位手術であるため、重要です。この適応可能な定位手術の主な利点は、脳の困難で到達しにくい領域を標的にするために使用できることです。この手順を実演するのは、研究室の若くて才能のあるポスドク研究員であるチェルシー・フェイバーです。フレームとマイクロマニピュレーターのキャリブレーションが完了したことを確認したら、センターハイトゲージをヘッドホルダーベースプレートのソケットにセットします。センタリングスコープをツールホルダーに固定し、スコープを見下ろします。十字線がゲージの十字線に位置合わせされ、焦点が合うまでマイクロマニピュレーターの位置を調整し、両側のインジケーターラインがゼロになるようにイヤーバーをホルダーに配置します。ヘッドホルダーの内側外側および前後のノブを使用して、中央の高さゲージの十字線の上のX面とY面の耳のバーを中央に並べます。イヤーバーの位置をZ軸に合わせるには、イヤーバーをホルダーから取り外し、中央の高さゲージを取り外します。次に、イヤーバーを交換し、バーをゼロに再度センタリングします。次に、スコープをもう一度見下ろし、垂直シフトノブとコロナルチルトノブをそれぞれ使用して、スコープの十字線がコロナル回転中にイヤーバーの中央に留まるまでイヤーバーを下げて回転させます。角度のある座標の回転の中心軸を揃えるには、センタリングスコープをツールホルダーに固定し、マイクロマニピュレータを計算された座標に配置します。角度付きインプラントの右/左座標は、サイドAの長さに対応していることに注意してください。マイクロマニピュレーターを正中線上に再配置し、コロナルチルトノブを使用してヘッドを計算された角度に回転させます。スコープの十字線が基準マークと揃っていない場合は、垂直シフトノブを使用して、十字線がマークにできるだけ近づくまでZ軸のヘッド位置を調整します。この時点で、任意の回転点はステレオタックスの回転中心に揃える必要があります。ヘッドを回転させてゼロ度の冠状位置に戻し、その後の穴あけおよびマイクロインジェクションステップに進みます。マイクロインジェクションを行った後、ヘッドをゼロ度レベル位置に戻し、ハンドドリルを使用して、前方に2つの穴を配置し、角度のある座標バリ穴から後方に2つの穴を配置して、頭蓋骨の上にある光ファイバーのフェルール部分を収容します。すべての穴を開けたら、小さなマイナスドライバーを使用して、骨のネジをできるだけ優しく挿入し、脳を貫通せずに頭蓋骨にしっかりと固定します。clamp 光ファイバーカニューレをカニューレホルダーに差し込み、カニューレホルダーをツールホルダーに入れます。マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに注意してください、計算された角度にヘッドを回転させます。角度のついたバリ穴の中心を埋め込みターゲットとして使用します。光ファイバーをバリ穴の中心内の硬膜にちょうど触れるまで下げ、Z軸のマイクロマニピュレーターをゼロにします。光ファイバーを背側腹側角度付き座標までゆっくりと下げてから、シアノアクリレートゲルを使用して光ファイバーフェルールを同側アンカースクリューに接続します。マイクロピペットチップを使用して促進剤を塗布します。ゲルが完全に固まったら、カニューレホルダーをそっと緩めて、フェルールから離れるまで持ち上げます。2 番目の光ファイバーを反対側の角度付き座標に埋め込み、ヘッドを水平にします。安全性を高めるために、シアノアクリレートゲルと促進剤を使用して、2つの角度のついた光ファイバーカニューレの間に追加の接続を行い、頭蓋骨の表面に少量の比較的薄い歯科用セメントを塗布し、アンカースクリューと光ファイバーカニューレの基部を完全に覆うように注意します。視床下部腹内側核ニューロンの役割を調査するために、この代表的な分析では、標準的な非角度の定位アプローチを使用して、抑制チャネルロドプシンウイルスの腹内側核への両側マイクロインジェクションを行いました。腹内側核が正中線に近いため、スペースの制約により、両側光ファイバーの非角度移植はできず、光ファイバーを斜めに正確に移植するための外科的戦略の開発が必要でした。覚えておくべき最も重要なことは、単に忍耐強く、時間をかけることです。なぜなら、座標の割り当てに一貫性と正確さを保つことが成功に不可欠だからです。この手順は、化学遺伝学、光遺伝学、繊維測光アプローチなど、げっ歯類の脳へのマイクロインジェクションまたは移植を必要とするあらゆる神経科学的方法に適応して適用できます。

adaptable-angled-stereotactic-approach-for-versatile-neuroscience

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

（ドリルは除く）の周りの千ドルのための固定装置、（CNC制御されるコンピュータ数値）このプロトコルは、デザインやロボットへの既存の固定装置をアップグレードするために必要なソフトウェアが含まれています。...

オープンソースロボット定位固定装置を構築する

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。...

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

定位脳波（SEEG）は発作病巣をローカライズを助けるためにてんかん手術で使用手術技法である。また、脳機能を研究するユニークな機会を与える。ここでは、SEEGはヒト対象における認知プロセスを調査するために使用することができる方法について説明します。...

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

ワイヤレス、マルチ チャンネル記録と自由行動下ラットにおける刺激の双方向システムを導入します。システムは軽量でコンパクトなこのように animal´s...

ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタ フェース

SEEG方法論は、定位ロボットによって簡素化され、高速化されます。手術室でロボットを使用する前に、術前の容積測定MRIを患者に登録することに細心の注意を払う必要があります。ロボットは手順を合理化し、手術時間の短縮と正確な移植につながります。...

ロボット定位誘導システムを用いた立体脳波(SEEG)法の手術技術とニュアンス

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。...

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。...

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

ここで紹介するプロトコルは、対流増強注入を使用してブタの脳に定位固定性を示し、リアルタイムの磁気共鳴画像法(MRI)視覚化ガイダンスとリアルタイムの輸液分布視覚化を行います。...

ブタ脳への注入のための磁気共鳴ガイド下定位固定装置

マイクロプリズムレンズは、1光子顕微鏡と2光子顕微鏡の両方に対応したヘッドプレートと光学設計と一体化することで、頭部を固定した状態でのよく制御された実験や、自由に動く動物の自然な行動課題など、さまざまな条件下で垂直カラム内の神経応答を測定する上で大きな利点を発揮します。...

自由に動く動物と頭部固定動物におけるマイクロプリズムを用いた同定された神経集団の長期イメージング

このプロトコルは、機能的磁気共鳴画像法 (fMRI) 中に投与される局所経頭蓋直流刺激 (tDCS) のための神経ナビゲート電極配置の方法を説明しています。...

機能的磁気共鳴画像法中に投与される神経ナビゲートされた焦点化経頭蓋直流刺激

学ぶ角度付き定位手術法でマウスおよびラットの脳深部領域へのカニューレ挿入とウイルス微量注入を行う方法。この適応可能なプロトコルはオプトジェネティクスやケモジェネティクスなど多様な神経科学研究への応用を可能にする。

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

さらに動画を探す