多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

このプロトコルは、マウスとラットの両方で利用でき、多くの新しい神経科学技術に適用できる適応可能な定位手術であるため、重要です。この適応可能な定位手術の主な利点は、脳の困難で到達しにくい領域を標的にするために使用できることです。この手順を実演するのは、研究室の若くて才能のあるポスドク研究員であるチェルシー・フェイバーです。

フレームとマイクロマニピュレーターのキャリブレーションが完了したことを確認したら、センターハイトゲージをヘッドホルダーベースプレートのソケットにセットします。センタリングスコープをツールホルダーに固定し、スコープを見下ろします。十字線がゲージの十字線に位置合わせされ、焦点が合うまでマイクロマニピュレーターの位置を調整し、両側のインジケーターラインがゼロになるようにイヤーバーをホルダーに配置します。

ヘッドホルダーの内側外側および前後のノブを使用して、中央の高さゲージの十字線の上のX面とY面の耳のバーを中央に並べます。イヤーバーの位置をZ軸に合わせるには、イヤーバーをホルダーから取り外し、中央の高さゲージを取り外します。次に、イヤーバーを交換し、バーをゼロに再度センタリングします。

次に、スコープをもう一度見下ろし、垂直シフトノブとコロナルチルトノブをそれぞれ使用して、スコープの十字線がコロナル回転中にイヤーバーの中央に留まるまでイヤーバーを下げて回転させます。角度のある座標の回転の中心軸を揃えるには、センタリングスコープをツールホルダーに固定し、マイクロマニピュレータを計算された座標に配置します。角度付きインプラントの右/左座標は、サイドAの長さに対応していることに注意してください。

マイクロマニピュレーターを正中線上に再配置し、コロナルチルトノブを使用してヘッドを計算された角度に回転させます。スコープの十字線が基準マークと揃っていない場合は、垂直シフトノブを使用して、十字線がマークにできるだけ近づくまでZ軸のヘッド位置を調整します。この時点で、任意の回転点はステレオタックスの回転中心に揃える必要があります。

ヘッドを回転させてゼロ度の冠状位置に戻し、その後の穴あけおよびマイクロインジェクションステップに進みます。マイクロインジェクションを行った後、ヘッドをゼロ度レベル位置に戻し、ハンドドリルを使用して、前方に2つの穴を配置し、角度のある座標バリ穴から後方に2つの穴を配置して、頭蓋骨の上にある光ファイバーのフェルール部分を収容します。すべての穴を開けたら、小さなマイナスドライバーを使用して、骨のネジをできるだけ優しく挿入し、脳を貫通せずに頭蓋骨にしっかりと固定します。

clamp 光ファイバーカニューレをカニューレホルダーに差し込み、カニューレホルダーをツールホルダーに入れます。マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに注意してください、計算された角度にヘッドを回転させます。角度のついたバリ穴の中心を埋め込みターゲットとして使用します。

光ファイバーをバリ穴の中心内の硬膜にちょうど触れるまで下げ、Z軸のマイクロマニピュレーターをゼロにします。光ファイバーを背側腹側角度付き座標までゆっくりと下げてから、シアノアクリレートゲルを使用して光ファイバーフェルールを同側アンカースクリューに接続します。マイクロピペットチップを使用して促進剤を塗布します。

ゲルが完全に固まったら、カニューレホルダーをそっと緩めて、フェルールから離れるまで持ち上げます。2 番目の光ファイバーを反対側の角度付き座標に埋め込み、ヘッドを水平にします。安全性を高めるために、シアノアクリレートゲルと促進剤を使用して、2つの角度のついた光ファイバーカニューレの間に追加の接続を行い、頭蓋骨の表面に少量の比較的薄い歯科用セメントを塗布し、アンカースクリューと光ファイバーカニューレの基部を完全に覆うように注意します。

視床下部腹内側核ニューロンの役割を調査するために、この代表的な分析では、標準的な非角度の定位アプローチを使用して、抑制チャネルロドプシンウイルスの腹内側核への両側マイクロインジェクションを行いました。腹内側核が正中線に近いため、スペースの制約により、両側光ファイバーの非角度移植はできず、光ファイバーを斜めに正確に移植するための外科的戦略の開発が必要でした。覚えておくべき最も重要なことは、単に忍耐強く、時間をかけることです。なぜなら、座標の割り当てに一貫性と正確さを保つことが成功に不可欠だからです。

この手順は、化学遺伝学、光遺伝学、繊維測光アプローチなど、げっ歯類の脳へのマイクロインジェクションまたは移植を必要とするあらゆる神経科学的方法に適応して適用できます。