多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ
2020年5月7日
ここでは、角度付きコロナアプローチを使用して(空間的な制限のために)困難で到達しにくい脳領域を標的にすることができる定位的手順を説明します。このプロトコルは、マウスおよびラットモデルの両方に適応可能であり、カニューレ移植およびウイルス構築物のマイクロインジェクションを含む多様な神経科学的用途に適用することができる。
このプロトコルは、マウスとラットの両方で利用でき、多くの新しい神経科学技術に適用できる適応可能な定位手術であるため、重要です。この適応可能な定位手術の主な利点は、脳の困難で到達しにくい領域を標的にするために使用できることです。この手順を実演するのは、研究室の若くて才能のあるポスドク研究員であるチェルシー・フェイバーです。
フレームとマイクロマニピュレーターのキャリブレーションが完了したことを確認したら、センターハイトゲージをヘッドホルダーベースプレートのソケットにセットします。センタリングスコープをツールホルダーに固定し、スコープを見下ろします。十字線がゲージの十字線に位置合わせされ、焦点が合うまでマイクロマニピュレーターの位置を調整し、両側のインジケーターラインがゼロになるようにイヤーバーをホルダーに配置します。
ヘッドホルダーの内側外側および前後のノブを使用して、中央の高さゲージの十字線の上のX面とY面の耳のバーを中央に並べます。イヤーバーの位置をZ軸に合わせるには、イヤーバーをホルダーから取り外し、中央の高さゲージを取り外します。次に、イヤーバーを交換し、バーをゼロに再度センタリングします。
次に、スコープをもう一度見下ろし、垂直シフトノブとコロナルチルトノブをそれぞれ使用して、スコープの十字線がコロナル回転中にイヤーバーの中央に留まるまでイヤーバーを下げて回転させます。角度のある座標の回転の中心軸を揃えるには、センタリングスコープをツールホルダーに固定し、マイクロマニピュレータを計算された座標に配置します。角度付きインプラントの右/左座標は、サイドAの長さに対応していることに注意してください。
マイクロマニピュレーターを正中線上に再配置し、コロナルチルトノブを使用してヘッドを計算された角度に回転させます。スコープの十字線が基準マークと揃っていない場合は、垂直シフトノブを使用して、十字線がマークにできるだけ近づくまでZ軸のヘッド位置を調整します。この時点で、任意の回転点はステレオタックスの回転中心に揃える必要があります。
ヘッドを回転させてゼロ度の冠状位置に戻し、その後の穴あけおよびマイクロインジェクションステップに進みます。マイクロインジェクションを行った後、ヘッドをゼロ度レベル位置に戻し、ハンドドリルを使用して、前方に2つの穴を配置し、角度のある座標バリ穴から後方に2つの穴を配置して、頭蓋骨の上にある光ファイバーのフェルール部分を収容します。すべての穴を開けたら、小さなマイナスドライバーを使用して、骨のネジをできるだけ優しく挿入し、脳を貫通せずに頭蓋骨にしっかりと固定します。
clamp 光ファイバーカニューレをカニューレホルダーに差し込み、カニューレホルダーをツールホルダーに入れます。マイクロマニピュレータの座標が新しいツールに適用されないことに注意してください、計算された角度にヘッドを回転させます。角度のついたバリ穴の中心を埋め込みターゲットとして使用します。
光ファイバーをバリ穴の中心内の硬膜にちょうど触れるまで下げ、Z軸のマイクロマニピュレーターをゼロにします。光ファイバーを背側腹側角度付き座標までゆっくりと下げてから、シアノアクリレートゲルを使用して光ファイバーフェルールを同側アンカースクリューに接続します。マイクロピペットチップを使用して促進剤を塗布します。
ゲルが完全に固まったら、カニューレホルダーをそっと緩めて、フェルールから離れるまで持ち上げます。2 番目の光ファイバーを反対側の角度付き座標に埋め込み、ヘッドを水平にします。安全性を高めるために、シアノアクリレートゲルと促進剤を使用して、2つの角度のついた光ファイバーカニューレの間に追加の接続を行い、頭蓋骨の表面に少量の比較的薄い歯科用セメントを塗布し、アンカースクリューと光ファイバーカニューレの基部を完全に覆うように注意します。
視床下部腹内側核ニューロンの役割を調査するために、この代表的な分析では、標準的な非角度の定位アプローチを使用して、抑制チャネルロドプシンウイルスの腹内側核への両側マイクロインジェクションを行いました。腹内側核が正中線に近いため、スペースの制約により、両側光ファイバーの非角度移植はできず、光ファイバーを斜めに正確に移植するための外科的戦略の開発が必要でした。覚えておくべき最も重要なことは、単に忍耐強く、時間をかけることです。なぜなら、座標の割り当てに一貫性と正確さを保つことが成功に不可欠だからです。
この手順は、化学遺伝学、光遺伝学、繊維測光アプローチなど、げっ歯類の脳へのマイクロインジェクションまたは移植を必要とするあらゆる神経科学的方法に適応して適用できます。
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概要
この記事では、角度付きの頭頂部アプローチを利用した立体視手順を説明し、マウスとラットの両モデルにおいて、手の届きにくい脳領域をターゲットとします。この適応可能なプロトコルは、カニューレの埋め込みやウイルス構造体のマイクロインジェクションなど、様々な神経科学的応用に適用できます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経外科技術
- 動物モデルにおける実験的介入
背景
- この手順により、手の届きにくい脳領域を正確にターゲットとすることができます。
- 神経科学における複数の技術に適応可能です。
- マウスとラットの両モデルに適用できるため、適用範囲が拡大します。
- マイクロインジェクションや埋め込みを必要とする技術の進歩を支援します。
研究目的
- 手の届きにくい脳領域へのアクセスと操作のための信頼できる方法を開発すること。
- オプトジェネティクスやケモジェネティクスなど、神経科学における様々な応用を促進すること。
- 同様の技術を実装しようとする研究者向けの詳細なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- この方法には、ターゲットとなる脳手順のための立体視手術が含まれます。
- カニューレ埋め込みなどの手順には、マウスとラットの両モデルが使用されます。
- マルチオミクスのワークフローは言及されていません。
- 主要なステップには、マイクロマニピュレーターの調整と正確な埋め込みのための座標の調整が含まれます。
- プロトコルは、成功的な結果を得るための座標割り当ての精度を重視しています。
主要な結果
- このプロトコルは、角度付き埋め込みとマイクロインジェクションに必要なステップを正確に概説しています。
- 重要な手順の詳細により、特定の脳領域を正確にターゲットとすることの正確性が確保されています。
- 空間的制約にもかかわらず、両側性ファイバーオプティックインプラントを実行する能力を示しています。
- 神経外科的介入における慎重な計画と実行の重要性を強調しています。
結論
- このプロトコルは、手の届きにくい脳領域にデバイスを埋め込む方法を示しています。
- 様々な神経科学的方法を促進し、研究能力を向上させます。
- ターゲット領域内での行動および生理学的反応の理解に影響を及ぼします。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Targeting deep brain structures with precision remains a critical bottleneck in neuroscience-driven target validation, particularly for midline-adjacent nuclei where conventional stereotactic approaches fail due to vascular and ventricular constraints. This adaptable angled approach enables reliable access to otherwise inaccessible regions, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses in preclinical models. By facilitating consistent hardware implantation for optogenetics, chemogenetics, and fiber photometry, it enhances predictive confidence in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutically relevant nuclei such as the hypothalamic ventromedial nucleus in glucose homeostasis models.
- Operational Value: Supports bilateral viral vector delivery and fiberoptic implantation in spatially constrained brain regions.
- Strategic Value: Reduces failure rates in target modulation experiments due to inaccurate targeting.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible surgical platforms for downstream neuromodulation assays.
- Operational Value: Ensures consistent electrode or cannula placement across animals, reducing variability in readouts.
- Strategic Value: Enables scalable implementation of intracranial techniques in discovery screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains anatomical fidelity when modeling human brain circuits in rodent systems.
- Operational Value: Supports longitudinal studies requiring stable intracranial hardware.
- Strategic Value: Improves reproducibility of behavioral and physiological endpoints in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery biology phase, enabling precise target engagement before progressing to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via targeted neuronal inhibition or activation in disease-relevant circuits.
- Screening: Delivers assay-ready models with verified intracranial targeting for compound or modulator evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable neural activity or behavioral outputs linked to precise anatomical targeting.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation through consistent target modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable surgical framework applicable across multiple neuroscience techniques and brain targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by minimizing off-target effects from misplaced implants.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized coordinate systems and angle-adjusted implantation.
- Strategic Value: Reduces resource waste from failed experiments due to inaccurate targeting.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on reliable target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery and coordinate system calibration.
- Dependent on precise micromanipulator alignment and angle adjustment capabilities.
- Necessitates validation of implantation accuracy via histological or imaging confirmation.
- Must account for species-specific brain anatomy when adapting between mouse and rat models.
- Relies on meticulous procedural execution to avoid tissue damage during angled tract insertion.
