Name: げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶ 集中超音波を用いた血液脳関門開口法。マウスモデルでマイクロバブル媒介ソノポレーションにより薬物送達を実現し、神経膠腫治療の前臨床評価に応用可能。自動化システムで非専門家も操作できる。

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このプロジェクトは、KWF-STW(小児びまん性特異性ポンチングリオーマと高級グリオーマにおけるソノポレーションによる薬物送達)によって資金提供されました。イリャ・スカチコフとチャールズ・ムーゲトがシステム開発に参加してくれたことに感謝します。

すべてのin vivo実験は、オランダの倫理委員会(ライセンス許可番号AVD114002017841)と、オランダのアムステルダム大学の動物福祉団体によって承認されました。研究者は、動物の不快感を最小限に抑えるためにFUSシステムの基礎訓練を受けました。
1. 集中超音波システム
注:記載されているセットアップは、市販のコンポーネントに基づいて社内構築されたBBBディスラプションシステムであり、3Dプリントされたカスタムメイドのコーンと取り外し可能な立体戦術プラットフォームが含まれています。システムは、利用可能な機器と特定の用途に応じて変更を容易にするモジュラー設計されています。プロトコルは、マウス脳のポンチン領域におけるより大きな領域のソノポレーションの手順を記述する。ターゲットの位置を調整することにより、脳の異なる部分を標的とすることができます。この研究では、焦点距離75mmの1MHz単元素トランスデューサ、60mmの絞り、1.5 x 1.5 x 5mm(ピーク圧力のFWHM)の焦点領域を使用しました。トランスデューサの焦点面は、耳の棒と交差する水平面で動物の頭蓋骨を通って配置されます。
<ol><li>げっ歯類のBBBの開口部のための適切なトランスデューサを選択してください。 注:マイクロバブルの特性と採用周波数に基づいて、音響設定、特に機械的指数(MI)は、13、38に変更される場合があります。</li>
	<li>3D プリントされたコーンにトランスデューサを置きます。</li>
	<li>ビーム伝搬経路の音響結合を達成するために、コーンの底端に音響的に透明なマイラー膜を使用し、脱気水でコーンを満たす。</li>
	<li>図1に示すように、トランスデューサを動物の上に取り付け、トランスデューサの自動垂直位置を設定します。</li>
	<li>図 1および図 2に示すように、温度調節された加熱、咬傷および耳棒、麻酔およびマルチモダリティ受託マーカーを含む、研究の要件に基づいて取り外し可能な立体性プラットフォームを設計する。立体的プラットフォームの取り付けは、ビームの下で動物の正確な自動位置決め(<0.1mm)を可能にする2D線形段階システムで構成されています。</li>
	<li>トランスデューサを、トランスデューサ、ファンクションジェネレータ、パワーアンプからなる 図1 に示す音響発光チェーンに接続します。</li>
	<li>画像処理パイプラインを考案して、針ハイドロフォンによって検出された脳領域の正確なソノポレーションターゲティングとキャビテーションデータの収集を可能にするマルチモダリティ受託マーカーを検出します。</li>
	<li>システムを較正し、立体性プラットフォーム上の動物の垂直位置に対応してトランスデューサの焦点点を決定する。</li>
</ol>2. 動物の準備
注: 次のプロトコルは、マウスに対して指定されていますが、ラットに適合させることができます。これらの実験のために、雌の高胸腺ヌードFoxn1--マウス(6-8週齢)が使用された。
<ol><li>動物施設で少なくとも1週間順応し、定期的に動物の重量を量ることを許可します。</li>
	<li>FUS治療を開始する30分前に皮下(.c)注射を介してブプレノルフィン(0.05mg/kg)を投与する。</li>
	<li>3%のイソフルラン、2 L/分O2 で動物を麻酔し、動物が深く麻酔されていることを確認します。動物を全手順中に麻酔を付け、呼吸頻度と心拍数を監視してイオブルランの濃度を必要に応じて調整します。</li>
	<li>ドライアイを防止し、可能な怪我を避けるために、眼軟膏を適用します。</li>
	<li>かみそりと脱毛クリームで頭の上の髪を取り除き、皮膚への刺激を避けるために任意の残留物を取り除くために水で後で洗います。</li>
	<li>BLI腫瘍モデルの実験では、BLI画像誘導用に29Gインスリン注射器を用いて、D-ルシフェリン(30mg/mL)腹腔内(i.p.)を150μL注入します。</li>
	<li>26-30 Gの尾静脈カテーテルを挿入し、少量のヘパリン溶液(5 UI/mL)でカテーテルと静脈を洗い流します。血液凝固を避けるためにヘパリン溶液でカテーテルを充填します。 注意:カテーテルに血液が還流すると、良好なカテーテル法が見られます。塞栓を防ぐためにカテーテルの気泡を避けてください。過度の射出圧力を避けるために、カテーテルの長さができるだけ短くしてください。</li>
	<li>低体温症を避けるために、温度調整された立体性プラットフォーム上に動物を置きます。 注:低体温は、マイクロバブルの注射/循環および薬物の薬物動態に影響を与える血液循環を減少させる39。</li>
	<li>イヤーバーと一口バーを使用して、立体性プラットフォーム上で動物の頭を固定し、固定します。ストラップで体を固定し、プラットフォームに動物の尾をテープ。</li>
</ol>3. 生体内画像誘導集中超音波
注:このプロトコルでは、10 msの持続時間を持つトーンバーストパルスを備えた1MHzのモノ要素トランスデューサ、0.4のMI、240秒の40サイクルの1.6 Hzのパルス繰り返し周波数が使用されました。このプロトコルは、硫化物六フッ化物(SF6)を含むリン脂質を無害なガスとして安定化させたマイクロバブルに最適化されており、それによって平均気泡径は2.5μm、泡の90%以上が8μm未満である。
<ol><li>取り付けられた動物と一緒に立体性プラットフォームをイメージングモダリティ(例えば、BLI またはX線)に配置し、動物の画像を撮ります。</li>
	<li>画像処理パイプラインと組み合わせてマルチモダリティの受容マーカーを使用して、トランスデューサのフォーカスポイントに従って動物の位置をマークします。</li>
	<li>獲得したX線画像の上に脳の輪郭を配置するか、BLI画像を使用して腫瘍の中心を決定することによって、ターゲット領域を決定する(図2)。脳の特定の部分の位置は、頭蓋骨のマーキングブレグマとラムダを基準点として使用して、パキシノス脳アトラス40 で指定されます。例えば、ポンはラムダからx=-1.0、y=-0.8、z=-4.5の位置にあります。</li>
	<li>動物の鼻孔と口を粘着テープで保護し、超音波ゲルが呼吸を妨げるのを防ぎます。</li>
	<li>動物の頭の上に超音波ゲルを適用します。</li>
	<li>動物の首の皮膚を引き込み、針ハイドロフォンを超音波ゲルで潤滑し、針ハイドロフォンを後頭骨の直接近傍に置く。</li>
	<li>画像処理パイプラインとフォーカスポイントを使用して、トランスデューサを正しい位置に導きます。</li>
	<li>あらかじめ構成された設定を接続されているすべてのデバイスに適用し、対象となる脳領域をターゲットにします。 注: 研究の質問に応じて、腫瘍または脳領域は、単一の焦点として、または容積形状としてソノポポできます( 図2を参照)。</li>
	<li>メーカーの説明に従ってマイクロバブルをアクティブにします。120 μL (5.4 μg) のマイクロバブルを 1 個注入します。</li>
	<li>尾静脈カテーテルを生理食い物で洗い流し、カテーテルの開口部を確認します。</li>
	<li>マイクロバブルを注入し、インソネーションを開始します。</li>
	<li>針ハイドロフォンでマイクロバブルキャビテーションを記録します。</li>
	<li>血管内造影剤または薬物を、ソノポレーション後に投与する。用量, タイミングと計画は、研究の目的と薬に依存します。 注:エヴァンスブルーはBBBの開口部41を評価するための一般的なカラーエージェントです。</li>
	<li>所定の時間ポイントまで、または人道的エンドポイントの前まで動物を監視します。</li>
</ol>4. マイクロバブルキャビテーションの解析
注:ここでは、MDannoldらが最初に示唆したように、1MHzの周波数で10msの持続時間のバーストトーンパルスで励起された平均直径2.5μm(8μm以下の気泡の80%)を有するSF6-リン脂質微小気泡の生体内実験に適した適用手順を説明する。
<ol><li>フーリエは、記録されたPCD信号を時間領域から周波数領域に変換します。</li>
	<li>図 3 (2 MHz と 3 MHz の緑色のボックス) に示すように、得られたスペクトルパワーを統合して、2番目と 3番目の高調波 (± 50 kHz) の周囲で安定したキャビテーション検出を行います。</li>
	<li>図3(赤いボックス)に示すように、慣性キャビテーション検出のためのスペクトルパワーを、主周波数、2番目、3番目の高調波、第1および第2の超高調波および第1の低調波(±150kHz)の間に統合します。</li>
	<li>従来取得した PCD 信号の両方の正規化のために、原理周波数(1 MHz ± 50 kHz)の周囲にスペクトルパワーを統合します。 注:PCDシグナルは、1MHzでの生体内実験におけるSF6-リン脂質微小気泡の場合、 図3に示すように、慣性キャビテーションが設定される前に超高調波またはサブハーモニクスを表示しない。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究では、脳のパレンチマへの薬物送達増加のための一過性BBB破壊のための費用対効果の高い画像誘導ベースのFUSシステムを開発した。このシステムは、主に市販のコンポーネントとX線およびBLIと組み合わせて構築されました。提案された設計のモジュール性は、高スループットワークフローでの計画と評価のためのいくつかのイメージングモダリティの使用を可能にします。このシステムは、高解像度MRIやマイクロCTなど、より包括的な高解像度3Dイメージングモダリティと組み合わせることができ、研究の大部分では2D X線やBLIなどの2Dイメージングモダリティが使用されます。2D X線および/またはBLIは、それぞれの短い取得時間による大量の研究に最適なだけでなく、かなり費用対効果が高い。ここで説明するトランスデューサは、脳のより深い部分(f数1.25)でより大きな領域(マウス脳のスケールで)でBBBDを生成するのに適しています。我々は、ポンチン領域43、44において腫瘤成長のためのシステムを使用してきた。これらの領域では、より大きな体積は、ポ...

血液脳関門(BBB)は、脳のパレンチマへの薬物送達のための主要な障害です。開発されたほとんどの治療薬は、その物理化学的パラメータ(例えば、親油性、分子量、水素結合アクセプターおよびドナー)のためにBBBを横断しないか、または脳内の流出輸送体に対する親和性のために保持されない1、2。BBBを横断できる薬物の小さなグループは、典型的には小さな親油性分子であり、これは限られた数の脳疾患1,2にのみ有効である。その結果、大多数の脳疾患では、薬理学的治療の選択肢が限られており、新しい薬物送達戦略が3,4に必要である。
治療超音波は、BBB破壊(BBBD)、神経変調、およびアブレーション4、5、6、7などの異なる神経学的用途に使用することができる新たな技術である。頭蓋骨を介して体外超音波エミッタを有するBBB開口部を達成するために、集中超音波(FUS)は、マイクロバブルと組み合わされる。マイクロバブル媒介FUSは、脳のパレンチマ5、8、9における薬物の生物学的利用能の増加をもたらす。音波の存在下では、マイクロバブルがBBBの内皮細胞間の緊密な接合部の開始と破壊を開始し、より大きな分子10の細胞内輸送を可能にする。これまでの研究では、音響放射の強度とBBB開口部11、12、13、14に及ぼす生物学的影響との相関が確認された。FUSは、マイクロバブルと組み合わせて、化学療法剤としてテモゾロミドまたはリポソームドキソルビシンを用いた神経膠芽腫の治療、またはアルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症5、9、15、16の治療に対する臨床試験で既に使用されている。
超音波は、薬物療法のための全く新しい可能性のBBB開口部を介して仲介するので、臨床翻訳のための前臨床研究は、選択された薬物候補の治療応答を評価するために必要とされる。通常、高空間精度の高スループット ワークフローと、高い再現性を備えたターゲット BBB 開口部の監視用の統合キャビテーション検出が必要です。可能であれば、これらのシステムは、研究規模に応じてスケーラブルにするために、初期投資とランニングコストの両方でコスト効率が高い必要があります。ほとんどの前臨床FUSシステムは、画像誘導および治療計画15、17、18、19のためにMRIと組み合わされる。MRIは腫瘍の解剖学と容積に関する詳細な情報を提供するが、それは一般的に訓練を受けた/熟練したオペレータによって行われる高価な技術である。さらに、高精細MRIは、常に前臨床施設の研究者が利用できるとは限らず、動物1匹あたりのスキャン時間が長く必要であり、高スループットの薬理学的研究にはあまり適していません。注目すべきは、神経腫瘍学の分野における前臨床研究、特に浸潤性腫瘍モデルのために、腫瘍を可視化し標的にする可能性が治療の成功20に不可欠である。現在、この要件はMRIまたは光タンパク質を導入した腫瘍によってのみ満たされ、光タンパク質基質の投与と組み合わせて生物発光イメージング(BLI)による可視化を可能にする。
MRI誘導FUSシステムは、多くの場合、経頭蓋適用のための超音波の伝播を確実にするために水浴を使用し、それによって動物の頭部は部分的に水中に沈み、いわゆる'ボトムアップ'システム15、17、18。これらの設計は一般的に小さな動物実験でうまく機能しますが、使用中の動物の準備時間、移植性、現実的に維持可能な衛生基準の間の妥協点です。MRIの代替として、立体的ナビゲーションのための他の誘導方法は、げっ歯類解剖学的アトラス21、22、23、レーザーポインタ支援視覚目撃24、ピンホール支援機械スキャン装置25、またはBLI26の使用を包含する。これらの設計のほとんどは、トランスデューサーが動物の頭の上に置かれ、動物が自然な位置に置かれる「トップダウン」システムです。'トップダウン'のワークフローは、水浴22、25、26または水で満たされたコーン21、24のいずれかで構成されています。閉じたコーンの内部のトランスデューサーを使用することの利点は、よりコンパクトなフットプリント、セットアップ時間の短縮、簡単な除染の可能性がワークフロー全体を簡素化することです。
マイクロバブルとの音響場の相互作用は圧力依存性であり、低振幅振動(安定キャビテーションと呼ばれる)から過渡的な気泡崩壊(慣性キャビテーションと呼ばれる)27,28に及ぶ。超音波BBBDは、BBBDを成功させるために安定キャビテーション閾値をはるかに上回る音響圧力を必要とするが、慣性キャビテーション閾値を下回るが、一般的に血管/神経損傷29に関連しているという確立されたコンセンサスがある。監視および制御の最も一般的な形態は、McDannoldらが示唆する(バック)散乱音響信号の分析である受動的キャビテーション検出(PCD)である。PCDは、安定キャビテーションの特徴(高調波、低調波、超高調波)と慣性キャビテーションマーカー(ブロードバンド応答)の強度と外観をリアルタイムで測定できるマイクロバブル放出信号のフーリエスペクトルの分析に依存しています。
精密な圧力制御のためのPCD解析は、マイクロバブル製剤の多分散性(振動振幅はバブル径に強く依存する)、ブランド間の気泡殻特性の違い、および音響振動の周波数と圧力30、31、32に強く依存する音響振動のために、正確な圧力制御のためのPCD分析が複雑である。その結果、多くの異なるPCD検出プロトコルが提案されており、これらのすべてのパラメータの特定の組み合わせに適応し、様々なアプリケーションシナリオ(小動物プロトコルを介したインビトロ実験から臨床用PCDまで)で使用され、堅牢なキャビテーション検出、さらには圧力11、14、30、31、32、33、34の遡及フィードバック制御に使用されています。本研究の範囲で用いられるPCDプロトコルはMcDannoldら12に直接由来し、慣性キャビテーション検出のための安定キャビテーションおよび広帯域ノイズの存在のために高調波放出を監視する。
脳のパレンチマへの薬物送達を増加させるBBBの一過性開口のための画像誘導神経ナビゲーションFUSシステムを開発しました。このシステムは、市販のコンポーネントに基づいており、動物施設で利用可能なイメージング技術に応じて、いくつかの異なるイメージングモダリティに容易に適応することができます。高スループットのワークフローが必要なため、画像誘導と治療計画にはX線とBLIを使用することを選択しました。光タンパク質を用いてトランスニューされる腫瘍細胞(例えば、ルシメラーゼ)はBLIイメージング20に適している。光タンパク質基質の投与後、腫瘍細胞は生体内でモニタリングすることができ、腫瘍の成長および位置は20,36と判定することができる。BLIは、低コストのイメージングモダリティであり、経時の腫瘍の成長に従うことを可能にし、高速なスキャン時間を有し、MRI36、37で測定された腫瘍増殖と良好に相関する。私たちは、げっ歯類が取り付けられているプラットフォームを自由に動かすための柔軟性を可能にするために、トランスデューサーに取り付けられた水で満たされたコーンで水浴を置き換えることを選びました8,24.この設計は、X線と光学画像の両立性(III)急速着脱可能な麻酔マスク、および(IV)統合された温度調節された動物加熱システムを備えた(I)小動物立体立体性プラットフォーム(II)受託者マーカーの統合を備えた取り外し可能なプラットフォームに基づいています。麻酔の最初の誘導の後、動物は全体のプロシージャの間に残るプラットホームの精密な位置に取付けられる。その結果、プラットフォーム全体が、正確で再現可能な位置決めと持続麻酔を維持しながら、介入全体のワークフローのすべてのステーションを通過します。この制御ソフトウェアは、受託者マーカーの自動検出を可能にし、すべてのタイプの画像と画像モダリティ(マイクロCT、X線、BLIおよび蛍光イメージング)を、立体的プラットフォームの基準フレームに自動的に登録します。自動較正手順の助けを借りて、超音波トランスデューサの焦点距離は正確に内部に知られており、介入計画、音響送達およびフォローアップ画像分析の自動融合を可能にする。図 1と図 2に示すように、このセットアップは、専用の実験ワークフローを設計する高い柔軟性を提供し、さまざまなステーションでの動物のインターリーブ処理を可能にし、ハイスループット実験を容易にします。我々は、この技術を用い、びまん性正中神経膠腫などの高悪性神経膠腫のマウス異種移植片における薬物送達に成功した。

<table><tbody><tr><td>1 mLルアーロックシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>19 G針</td><td>テルモ・アガーニ</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>23 G針</td><td>テルモ・アガーニ</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>3M トランスポア手術用テープ</td> 生命<td>7000032707</td><td>または類似</td><td>の生命に適用される科学</td></tr><tr><td>任意波形発生器</td><td>Siglent</td><td>n.a.SDG1025</td><td>, 25 MHz,125 Msa/s</td></tr><tr><td>自動定位法</td><td>社内で製造された</td><td>n.a.</td><td>すべての要素を持つ立体</td></tr>視法は、社内で製造された <tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.Includes</td> <td>software</td></tr><tr><td>Buffered NaCl solution</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine hydrochloride</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.0.324</td> <td>mg</td></tr><tr><td>ケージ濃縮:紙パルプスマートホーム</td><td>バイオサービス</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>カーボンフィルター</td><td>ビックフォード</td><td>NC0111395</td><td>オムニコン f/air</td></tr><tr><td>セラミックスプーン</td><td>n.a</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>n.a.n.a.D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VUmc 薬局</td><td>n.a.70</td><td>%</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.NaCl</td> <td>0.9 %, 1000 mL</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>n.a.Histoacryl</td> <td>0.5 mL</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.Insulin</td><td></td></tr> <tr><td>syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0.5 mL and 0.3</td></tr><tr><td>mL Isoflurane</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>アルファサン</td><td>n.a.10</td> <td>%, 10 mL</td></tr><tr><td>マウス フード: Teklad グローバル 18% タンパク質げっ歯類ダイエット</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>ネオフロン カテーテル</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>391349</td><td>26 GA 0.6 x 19 mm</td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>キーサイト テクノロジー</td><td>ズ n.a.InfiniiVision</td> <td>DSOX024A</td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>パワーアンプ</td><td>エレクトロニクス&イノベーション株式会社</td><td>210L</td><td>モデル210L</td></tr><tr><td>プリアンプDCカプラー</td><td>精密音響n</td><td>。</td><td>シリアルナンバー:DCPS94</td></tr><tr><td>はさみ</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S3146-1EA</td><td>または同様の</td></tr><tr><td>セダジン</td><td>ASTファーマ</td><td>n.a.2</td><td>%</td></tr><tr><td>SonoVueマイクロバブル</td><td>ブラッコ</td><td>n.a.8</td><td>&マイクロ;l/ml</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>フレゼニウス・カビ</td><td>n.a.1000</td> <td>mL</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>n.a.n.a.various</td><td></td> <td>シリンジは、</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.0.3</td> <td>mg/ml</td></tr><tr><td>トランスデューサ</td>ー <td>精密音響</td><td>n.a.1</td> <td>MHz</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F4142-1EA</td><td>または類似</td></tr><tr><td>の超音波ゲル</td><td>パーカーラボラトリーズ株式会社</td><td>01-02</td><td>アクアソニック 100</td></tr><tr><td>ビジシックジェル</td><td>バウシュ+ロム</td><td>n.a.10</td> <td>g</td></tr></tbody></table>

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

血液脳関門(BBB)は、様々な脳疾患の治療のための主要なハードルとなっています。狭い接合によって連結された内皮細胞は、大きな分子(>500 Da)が脳組織に入るのを防ぐ生理的障壁を形成する。マイクロバブル媒介型集中超音波(FUS)は、一過性の局所BBB開口部を誘導するために使用することができ、より大きな薬物が脳の気質に入ることを可能にする。
臨床翻訳のための大規模な臨床装置に加えて、薬剤候補の治療応答評価のための前臨床研究は、標的BBB開口部のための専用の小動物超音波セットアップを必要とする。これらのシステムは、高空間精度と統合キャビテーションモニタリングの両方でハイスループットのワークフローを可能にする一方で、初期投資コストとランニングコストの両方でコスト効率が良いものです。
ここでは、市販成分に基づき、前述の要件を満たす生物発光及びX線誘導体系小型動物FUSシステムを提示する。特に、大量の前臨床薬物評価研究で一般的に遭遇する課題を促進する高度な自動化に重点が置かれている。これらの課題の例として、データの再現性を確保し、グループ内変動を低減し、サンプルサイズを削減し、倫理的要件に準拠し、不要な作業負荷を軽減するために標準化が必要です。提案されたBBBシステムは、多形性神経膠芽腫およびびまん性正中性神経膠腫の患者由来異種移植片モデルに対するBBB開封促進薬物送達試験の範囲で検証された。

記載のFUSシステム(図1 および 図2)および関連ワークフローは100匹以上の動物に使用され、健常マウスおよび腫瘍軸受マウスの両方で再現可能なデータを生成した。マイクロバブルボーラス噴射のピークモーメントにおける記録キャビテーションと高調波におけるスペクトル密度に基づいて、各周波数のスペクトルパワーは、プロトコルのステップ4で説明されているようにフーリエ解析を用いて計算することができる。マイクロバブルと組み合わせて0.4のMIを有する音響プロトコル(1MHz、10msパルス持続時間)に基づいて、2番目 および3番目 の高調波における正規化された一体型パワースペクトルは、 図3で観察された励起周波数の一体化されたパワースペクトルを正規化した。これは、マイクロバブルが注入されなかった場合の低調波の検出や、MI 0.6が適用されたときに慣性キャビテーションの観察を行っていないのと比較して、安定したキャビテーション検出の非...

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

びまん性内因性橋グリオーマなどの高悪性度グリオーマは、死亡率が高い高浸潤腫瘍です。長年にわたる広範な研究にもかかわらず、化学療法は効果的に脳に到達できないため、血液脳関門は重要な側面です。幸いなことに、集束超音波は、効果的な治療のために血液脳関門を一時的および局所的に開くことができます。私たちは、血液脳関門の破壊のための小型で費用対効果の高い神経ナビゲート式集束超音波システムを開発しました。このシステムは、市販のコンポーネントで構築され、高度な自動化により、前臨床の医薬品評価研究を可能にします。プレシジョン・メディシンとは、適切な薬剤を適切な用量で、適切な患者に、適切なタイミングで提供することと定義されています。これを達成するためには、事前に選択された多くの薬剤をスクリーニングする必要があります。血液脳関門破壊のためのコンパクトなハイスループット集束超音波システムにより、まさにそれが可能になります。この手順を実演するのは、私の研究グループの博士課程の学生であるRianne HaumannとElvin t Hartです。画像誘導定位ニューロナビゲーション焦点超音波のワークフローには、超音波プラットフォームでのソノポレーションのためのインターベンショナルイメージングと音響結合が含まれます。その後、フォローアップイメージングを行うことができます。設計された実験の要件に基づいて、適切なトランスデューサーを選択します。それを脱気水で満たされた3Dプリントコーンに入れ、音響的に透明なマイラーメンブレンで底を閉じます。トランスデューサをファンクションジェネレータとパワーアンプに接続します。トランスデューサーを電動リニアステージに取り付けて、自動垂直位置決めを行い、パワーアンプに接続します。温度調節された加熱、バイトバーとイヤーバー、麻酔、マルチモダリティフィデューシャルマーカーを含む取り外し可能な定位固定プラットフォームを使用します。プラットフォームを2Dリニアステージに取り付けます。FUSシステムを使用する前に、FUSシステムを校正し、トランスデューサーの焦点を決定します。フォーカスポイントは、定位プラットフォーム上の動物の垂直位置に対応します。到着後少なくとも1週間は動物を施設に順応させ、定期的に体重を量ります。実験当日は、FUS治療の30分前にブプレノルフィンを皮下注射で投与します。マウスに麻酔をかけた後、ドライアイを防ぐために眼軟膏を塗布します。必要に応じて、かみそりと脱毛クリームで動物の頭のてっぺんの毛を取り除きます。皮膚を水で洗って残留物を取り除きます。BLI腫瘍モデルを用いた実験では、29ゲージのインスリン注射器を用いて150マイクロリットルのD-ルシフェリンを腹腔内に注入します。BBB開口部用のマイクロバブルの投与には、26〜30ゲージの尾静脈カテーテルを挿入し、少量のヘパリン溶液で静脈を洗い流します。カテーテルをティッシュテープで固定し、脱落を防ぎます。カテーテル挿入が成功した場合は、血液凝固を避けるためにカテーテルにヘパリン溶液を充填します。低体温症を避けるために、動物を温度調節された定位プラットフォームに置きます。バイトバーとイヤーバーを使用して動物の頭を固定し、尾とカテーテルをプラットフォームにテープで固定します。マウスの本体をストラップで固定します。マウスを装着した定位プラットフォームをイメージングモダリティに置き、動物の画像を撮影します。動物がプラットフォームに正しく配置されているかどうかを確認します。マルチモダリティ基準マーカーと画像処理パイプラインを組み合わせて、トランスデューサーの焦点に応じて動物の位置をマークします。取得したX線画像の上に脳の輪郭を配置するか、BLI画像を使用して腫瘍の中心を決定することにより、ターゲット領域を決定します。トランスデューサーを配置する前に、超音波ゲルが呼吸を妨げるのを防ぐために、動物の鼻孔と口をテープで保護してください。マウスの頭の上に超音波ジェルを塗布して、適切な音の伝導を実現します。後頭骨のすぐ近くに配置された針ハイドロフォンでマイクロバブルキャビテーションを記録します。校正値に基づいて、トランスデューサーを動物の上の正しい位置に導きます。接続されているすべてのデバイスに事前構成された設定を適用して、関心のある脳の領域をターゲットにします。トランスデューサーを正しい位置に配置した後、メーカーの説明に従ってマイクロバブルを溶解して活性化します。マイクロバブル注入の前に、尾静脈カテーテルを生理食塩水で洗い流し、尾静脈へのアクセスを確認します。超音波処理軌道を開始し、同時にマイクロバブルを注入します。同時に、ニードルハイドロフォンはマイクロバブルキャビテーションをリアルタイムで検出し、検証します。必要に応じて、超音波投与後に血管内造影剤または薬物を投与します。.所定の時点まで動物を監視します。マイクロバブルと組み合わせた機械指数0.4の音圧は、マイクロバブルを注入しなかった場合にサブハーモニックを検出しなかったり、MIが0.6のときに慣性キャビテーションを観察したりした場合と比較して、安定したキャビテーション検出の非常に感度が高く信頼性の高い手段を提供しました。MIが0.6までの音圧では巨視的な損傷は得られませんでしたが、MIが0.6の組織学的に微視的な損傷が証明されました。MIが0.8の圧力振幅は、より大きな血管の巨視的な脳出血と赤血球の血管外漏出を伴う広範な組織溶解をもたらしました。エバンス ブルーの静脈内注射を注入して、橋領域の BBB の開口部を確認しました。エバンスブルー標識アルブミンの血管外漏出は、FUSおよびマイクロバブルで処理したマウスの橋および小脳のレベルで観察され、関心領域の正確な標的化を示しています。このプロトコルの最も重要なステップは、尾静脈カテーテルの正しい配置、動物の位置決めとターゲティング、およびキャビテーション検出を伴う集束超音波によるマイクロバブル注入です。この自作の集束超音波システムは、複数の研究課題に適応し、再設計することができますが、これは費用対効果が高く、自動化されたワークフローを備えているため、比較的経験の浅い研究者に適しています。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

血液脳関門（BBB）のマイクロバブル媒介集束超音波の乱れは、脳の非侵襲的な標的薬物送達のための有望な技術です。...

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊

このビデオでは、マイクロバブル媒介集束超音波(FUS)を使用して一時的な開口部を作成することにより、血液脳関門(BBB)を一時的に破壊する方法について説明しています。これらの一過性の局所BBB開口部は、最終的には、より大きなサイズの薬物分子を脳実質に直接送達するために使用できます。...

フォーカス超音波を用いたマイクロバブル媒介血液脳関門開口:超音波処理によりマウスの血液脳関門に局在性一過性開口を作製する技術

マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI...

ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

このプロトコルは、集束超音波血液脳関門(BBB)の開口部、結果として生じる遺伝子発現の評価、および組織学的検査による化学遺伝学的受容体の神経調節活性の測定による遺伝子送達に必要なステップを描写します。...

脳構造を標的とし、化学遺伝学的神経調節を評価するための集束超音波誘発血液脳関門開口部

このプロトコルは、血液脳関門透過性を高めるために、焦点を合わせて超音波およびマイクロバブル治療中にげっ歯類脳の生体 内...

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

この研究では、頸静脈カテーテル法を受けた生きたラットを利用して血液脳関門(BBB)の開口部を監視する、磁気共鳴画像法(MRI)と低強度パルス焦点式超音波(FUS)を組み合わせたプロトコルについて説明しています。...

前臨床焦点式超音波システムによるラットの血液脳関門開口部のモニタリング

ゲインまたは機能研究の損失のいずれかを実行する目的のためのマウス網膜細胞へのプラスミドDNAの取り込みのための方法...

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

本稿では、同時に複数の認知行動をテストし、げっ歯類のために神経活動を記録することができる完全に自動化された汎用性の高いシステムを提案する。...

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

技術が広くマイクロバブルと超音波を用いたマウスにおける血液脳関門を開くために記述されています。このテクニックを使用して、マンガンは、マウスの脳に投与することができる。マンガンは脱分極の神経細胞に蓄積するMRI造影剤であるため、このアプローチは、神経活動のイメージングを可能にします。...

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。...

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

学ぶ 集中超音波を用いた血液脳関門開口法。マウスモデルでマイクロバブル媒介ソノポレーションにより薬物送達を実現し、神経膠腫治療の前臨床評価に応用可能。自動化システムで非専門家も操作できる。

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

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