げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム
2020年7月16日
血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。
びまん性内因性橋グリオーマなどの高悪性度グリオーマは、死亡率が高い高浸潤腫瘍です。長年にわたる広範な研究にもかかわらず、化学療法は効果的に脳に到達できないため、血液脳関門は重要な側面です。幸いなことに、集束超音波は、効果的な治療のために血液脳関門を一時的および局所的に開くことができます。
私たちは、血液脳関門の破壊のための小型で費用対効果の高い神経ナビゲート式集束超音波システムを開発しました。このシステムは、市販のコンポーネントで構築され、高度な自動化により、前臨床の医薬品評価研究を可能にします。プレシジョン・メディシンとは、適切な薬剤を適切な用量で、適切な患者に、適切なタイミングで提供することと定義されています。
これを達成するためには、事前に選択された多くの薬剤をスクリーニングする必要があります。血液脳関門破壊のためのコンパクトなハイスループット集束超音波システムにより、まさにそれが可能になります。この手順を実演するのは、私の研究グループの博士課程の学生であるRianne HaumannとElvin t Hartです。
画像誘導定位ニューロナビゲーション焦点超音波のワークフローには、超音波プラットフォームでのソノポレーションのためのインターベンショナルイメージングと音響結合が含まれます。その後、フォローアップイメージングを行うことができます。設計された実験の要件に基づいて、適切なトランスデューサーを選択します。
それを脱気水で満たされた3Dプリントコーンに入れ、音響的に透明なマイラーメンブレンで底を閉じます。トランスデューサをファンクションジェネレータとパワーアンプに接続します。トランスデューサーを電動リニアステージに取り付けて、自動垂直位置決めを行い、パワーアンプに接続します。
温度調節された加熱、バイトバーとイヤーバー、麻酔、マルチモダリティフィデューシャルマーカーを含む取り外し可能な定位固定プラットフォームを使用します。プラットフォームを2Dリニアステージに取り付けます。FUSシステムを使用する前に、FUSシステムを校正し、トランスデューサーの焦点を決定します。
フォーカスポイントは、定位プラットフォーム上の動物の垂直位置に対応します。到着後少なくとも1週間は動物を施設に順応させ、定期的に体重を量ります。実験当日は、FUS治療の30分前にブプレノルフィンを皮下注射で投与します。
マウスに麻酔をかけた後、ドライアイを防ぐために眼軟膏を塗布します。必要に応じて、かみそりと脱毛クリームで動物の頭のてっぺんの毛を取り除きます。皮膚を水で洗って残留物を取り除きます。
BLI腫瘍モデルを用いた実験では、29ゲージのインスリン注射器を用いて150マイクロリットルのD-ルシフェリンを腹腔内に注入します。BBB開口部用のマイクロバブルの投与には、26〜30ゲージの尾静脈カテーテルを挿入し、少量のヘパリン溶液で静脈を洗い流します。カテーテルをティッシュテープで固定し、脱落を防ぎます。
カテーテル挿入が成功した場合は、血液凝固を避けるためにカテーテルにヘパリン溶液を充填します。低体温症を避けるために、動物を温度調節された定位プラットフォームに置きます。バイトバーとイヤーバーを使用して動物の頭を固定し、尾とカテーテルをプラットフォームにテープで固定します。
マウスの本体をストラップで固定します。マウスを装着した定位プラットフォームをイメージングモダリティに置き、動物の画像を撮影します。動物がプラットフォームに正しく配置されているかどうかを確認します。
マルチモダリティ基準マーカーと画像処理パイプラインを組み合わせて、トランスデューサーの焦点に応じて動物の位置をマークします。取得したX線画像の上に脳の輪郭を配置するか、BLI画像を使用して腫瘍の中心を決定することにより、ターゲット領域を決定します。トランスデューサーを配置する前に、超音波ゲルが呼吸を妨げるのを防ぐために、動物の鼻孔と口をテープで保護してください。
マウスの頭の上に超音波ジェルを塗布して、適切な音の伝導を実現します。後頭骨のすぐ近くに配置された針ハイドロフォンでマイクロバブルキャビテーションを記録します。校正値に基づいて、トランスデューサーを動物の上の正しい位置に導きます。
接続されているすべてのデバイスに事前構成された設定を適用して、関心のある脳の領域をターゲットにします。トランスデューサーを正しい位置に配置した後、メーカーの説明に従ってマイクロバブルを溶解して活性化します。マイクロバブル注入の前に、尾静脈カテーテルを生理食塩水で洗い流し、尾静脈へのアクセスを確認します。
超音波処理軌道を開始し、同時にマイクロバブルを注入します。同時に、ニードルハイドロフォンはマイクロバブルキャビテーションをリアルタイムで検出し、検証します。必要に応じて、超音波投与後に血管内造影剤または薬物を投与します。.
所定の時点まで動物を監視します。マイクロバブルと組み合わせた機械指数0.4の音圧は、マイクロバブルを注入しなかった場合にサブハーモニックを検出しなかったり、MIが0.6のときに慣性キャビテーションを観察したりした場合と比較して、安定したキャビテーション検出の非常に感度が高く信頼性の高い手段を提供しました。MIが0.6までの音圧では巨視的な損傷は得られませんでしたが、MIが0.6の組織学的に微視的な損傷が証明されました。
MIが0.8の圧力振幅は、より大きな血管の巨視的な脳出血と赤血球の血管外漏出を伴う広範な組織溶解をもたらしました。エバンス ブルーの静脈内注射を注入して、橋領域の BBB の開口部を確認しました。エバンスブルー標識アルブミンの血管外漏出は、FUSおよびマイクロバブルで処理したマウスの橋および小脳のレベルで観察され、関心領域の正確な標的化を示しています。
このプロトコルの最も重要なステップは、尾静脈カテーテルの正しい配置、動物の位置決めとターゲティング、およびキャビテーション検出を伴う集束超音波によるマイクロバブル注入です。この自作の集束超音波システムは、複数の研究課題に適応し、再設計することができますが、これは費用対効果が高く、自動化されたワークフローを備えているため、比較的経験の浅い研究者に適しています。
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概要
この研究は、モジュール式集中超音波（FUS）システムを使用した血液脳関門（BBB）の一時的な破壊のための高スループットプロトコルを提示します。マイクロバブルを介したソノポレーションを活用することで、この技術はBBBによって妨げられるグリオーマのような状態の治療薬の効果的な送達を促進します。この方法論は、専門家でない人でもin vivoでBBBを開くことができるように設計されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物医学工学
- 治療薬の送達
背景
- 高悪性度グリオーマは、BBBにより治療オプションが限られた非常に侵襲性の高い腫瘍です。
- 集中超音波は、BBB破壊の有望な方法として浮上しています。
- 非専門家でも簡単に操作できる費用対効果の高いデバイスの必要性があります。
- ここで概説されているプロトコルは、前臨床薬評価研究を強化することを目指しています。
研究目的
- BBB破壊のための高スループットFUSシステムを開発する。
- 精密医療応用の事前選択された薬物のスクリーニングを促進する。
- 自動化されたシステムを用いて手順を効果的に実証する。
使用された方法
- in vivo実験にはモジュール式集中超音波システムが使用されました。
- BBB破壊と治療薬の送達の研究にはマウスモデルが用いられました。
- このプロセスには介入イメージングとソノポレーションのための音響結合が含まれます。
- 重要なステップには、動物の順応、麻酔投与、カテーテル挿入、超音波トランスデューサーの精密な位置決めが含まれます。
主な結果
- この手順は、BBBを通じた薬物送達を強化できる能力を信頼性高く実証しました。
- マイクロバブルのキャビテーション検出は、治療効果のモニタリングに不可欠でした。
- 定量的結果は、BBB破壊の正確な局在化を確認しました。
- 超音波の適用後に全身的影響を測定し、安全性と有効性を示しました。
結論
- この研究は、BBB破壊のための実用的で効果的な方法を確立し、より強化された治療介入を可能にします。
- カスタマイズ可能なFUSシステムは、薬物送達と中枢神経系疾患の治療におけるさらなる研究の基盤を提供します。
- 得られた洞察は、神経学的状態における精密医療と治療標的の理解を進めることができる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This high-throughput focused ultrasound system enables precise, reproducible blood-brain barrier opening in rodent models, directly supporting preclinical drug evaluation for CNS therapeutics. By integrating image-guided stereotactic navigation with automated cavitation monitoring, the system reduces variability and enhances data reliability in high-volume screening campaigns. Its cost-effective, modular design facilitates scalable implementation across discovery workflows targeting glioma and other brain diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of blood-brain barrier permeability for target validation in glioma models.
- Operational Value: Supports standardized, automated workflows that reduce intra-group variability and improve reproducibility in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cavitation detection as a biomarker for successful blood-brain barrier opening.
- Operational Value: Enables high-throughput screening of preselected drug compounds through automated transducer positioning and microbubble delivery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Validated in patient-derived xenograft models of glioblastoma and diffuse midline glioma, ensuring disease-relevant preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by confirming precise, localized drug delivery across the blood-brain barrier.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling image-guided, reproducible blood-brain barrier disruption for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of blood-brain barrier modulation in glioma models through precise, stereotactic targeting.
- Screening: Delivers assay readiness via automated workflows, standardized microbubble injection, and real-time cavitation monitoring for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cavitation signals, Evans blue extravasation, and histological confirmation of barrier opening.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through validation in patient-derived glioma models, supporting biomarker-aligned therapeutic assessment.
- Enterprise Reuse: Built from commercially available components with a modular design, enabling adaptation across multiple research questions and repeated use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in blood-brain barrier penetration data, reducing mechanistic ambiguity in CNS drug delivery.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation and image-guided targeting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative blood-brain barrier opening data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS drug candidates based on confirmed, localized barrier disruption and drug delivery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, ultrasound physics, and microbubble handling.
- Needs instrumentation including function generator, power amplifier, motorized linear stage, needle hydrophone, and imaging modalities (X-ray, bioluminescence).
- Demands cross-team standardization of animal preparation, catheterization, and transducer calibration procedures.
- Involves adaptation considerations for different transducer frequencies, targeting coordinates, and model systems (e.g., rat vs. mouse).
- Practical limitations include the need for surgical skill in tail vein catheterization and potential variability in skull thickness affecting ultrasound transmission.
