土壌中の不安定な植物、無機植物の栄養素および汚染物質の二次元可視化と定量化
September 1st, 2020
このプロトコルは、質量分析イメージングと組み合わせた薄膜(DGT)の拡散勾配を用いた複数の不安定な無機栄養素および汚染物質溶質種のサブmm2D視覚化のワークフローを提示する。地表植物の根層圏における溶質の定量的マッピングについては、溶質サンプリングおよび高解像度の化学分析について詳細に説明します。
土壌中の元素のバイオから化学への循環は、環境システムにおいて重要な役割を果たします。このプロトコルでは、DGT質量分析イメージングを使用して、植物で利用可能な元素画分の分布を2Dでイメージングできます。この方法は、溶質界面における複数の無機溶質種の超微量レベルを可視化および定量する能力において独特であり、他の方法の空間分解能を大幅に超えています。
この方法は、土壌や堆積物中の労働フラックスや溶質フラックスの調査に加えて、植物の根が栄養素や汚染物質の要素をどのように取り込むかを調査するために適用できます。DGTゲル製造では、まずポリウレタンベースの混合陰イオンおよび陽イオン結合ゲル懸濁液の薄膜をガラスプレートにコーティングし、プレートをオーブンに入れて溶媒蒸発によるゲル形成を開始します。塗布と蒸発を3回繰り返した後、得られたトリプルコーティングガラスプレートを水浴で水和させ、0.1ミリメートルの薄さの引裂き防止、混合陰イオンおよび陽イオン結合ゲルを得る。
根粒を組み立てるには、2つのクランプを使用して、プレートが内側に曲がらないように、クランプの圧力を根茎フレームに向けながら、根粒の上昇の下部に1つの小さなアクリルブレードを取り付けます。根茎を小さなプラスチックプレートに向かって少し傾け、根茎をあらかじめ湿らせた土で約4センチメートルの高さまで満たします。根茎をわずかに攪拌して土壌を均等に分散させ、圧縮ツールを使用して土壌を数ミリメートル穏やかに圧縮します。
リゾトロンが土で満たされ、上部に3センチメートルの隙間が残るまで、充填と圧縮を繰り返します。テープを使用して、13 x 22 cmのPTFEホイルを一度に1つの角で根粒フレームに慎重に固定し、張力を加えてホイル表面が平らになるようにします。PTFEホイルが平らで土壌表面と隣接している場合は、根茎の下端に2枚目のホイルを取り付け、同じように上部のPTFEホイルピースを1センチメートル重ねます。
2枚目が固定されたら、保護用のプラスチックホイルカバーを貼ります。土で満たされ、ホイルで覆われた根茎の上にフロントプレートを置き、根茎の両側に1本のレールを配置します。次に、ネジを手で締めて、フロントプレートのレールを根茎に固定し、ネジを根茎の閉じた側に向けて位置付けます。
土壌に水をやるには、ピペットの先端を水飲み場に押し込み、重力によって水を土壌に流します。植物を育てるには、最大2本の苗木を根圏トロンに植え、苗木に直接5ミリリットルの水を加えて成長をサポートします。植え付け後の最初の2日間は、根茎の上部の開口部を透明な保湿フィルムで覆い、根茎をアルミホイルで包んで微生物の成長を防ぎます。
次に、植えた根茎を、特定の植物の要件に設定された環境条件で成長室に置き、根茎を25度から35度傾けて、重力療法によってフロントプレートに沿って根が発達することを確認します。作製したDGTゲルを塗布するには、孔径が0.2ミクロンの厚さ10ミクロンのポリカーボネートメンブレンを、ゲルの各辺の幅と長さが少なくとも1cm以上になるように切断し、メンブレンをゲルの上に置きます。水を適用してスタックから気泡を取り除き、ビニール電気テープを使用して、ゲルの4つの端すべてに沿ってメンブレンをプレートに固定します。
フロントプレートと保護箔を取り外した後、マクロレンズを搭載したデジタル一眼レフカメラのファインダーをゲルの関心領域の中心に合わせ、画像にスケールバーを含めて関心領域の直交写真を取得します。次に、ゲルメンブレンスタックを装備したプレートの一方の端を、開いた根茎の縁に合わせます。プレートを土に向かってそっと曲げ、レールとネジを使用してプレートを根茎に取り付けます。
ソリチュードサンプリング期間の後、フロントプレートを根圏トロンからゲル膜スタック面を上にして層流フードに移し、テープとゲルを覆っているポリカーボネート膜を慎重に取り外します。土壌接触面を上にしてプレート上の薄い水膜にゲルが自由に浮かぶように水を適用し、0.45ミクロンの細孔サイズと吸い取り紙支持体を備えたポリエーテルスルホン膜にゲルを転写します。ゲルスタックを保護ホイルで覆った後、スタックを真空ゲルドライヤーに入れます。
ゲルが完全に乾いたら、両面粘着テープを使用して、ドライゲルを他のゲルサンプルと一緒にガラスプレートに固定します。ドライDGTゲルのレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析ラインスキャン分析を実行するには、まずサンプルブランクと標準をレーザーアブレーションサンプルステージに固定し、レーザーステージをレーザーアブレーションシステムのアブレーションセルにロックします。レーザーアブレーションソフトウェアでは、ゲル表面上の関心領域を移動させ、ゲル標準液の表面を横切る約1ミリリットルの長い線を1本引きます。
スキャンパターンウィンドウで線を右になめて、レーザーアブレーションパラメータが設定されて採用されていることを確認し、重複スキャンツールを使用して、スポット直径よりも大きい線間距離でこの線を4回複製します。各ゲル標準キャリブレーションブランクとメソッドブランクごとにこの線を繰り返した後、分析するゲルサンプルの長方形領域の上端に沿って1本の線を引き、その線を複製して、示されているように、300〜400マイクロメートルのインターライン距離を使用して、サンプル領域全体に平行線を作成します。各ラインの各始点と終点がゲル表面に適切に焦点を合わせていることを確認し、[バッチの分析]をクリックして、誘導結合プラズマ質量分析計でサンプルシーケンスを開始します。
レーザーエネルギーウィンドウで発光をクリックして、レーザーヘッドを再充電します。[実行] をクリックして実験の実行ウィンドウを開き、選択したパターンのみを選択します。ウォッシュアウト遅延を 20 秒から 30 秒に設定します。
[スキャン中にレーザーを有効にする]ボックスを選択し、レーザーのウォームアップ時間を10秒に設定します。次に、[実行]と[OK]をクリックしてラインスキャン分析を開始し、誘導結合プラズマ質量分析計で各同位体の生の信号強度をカウント/秒でリアルタイムに監視します。各行はガスブランクで始まり、ガスブランクで終わる必要があります。
分析後、アブレーションされた各行の生データファイルをスプレッドシートにインポートします。生データテーブルには、各同位体の誘導結合プラズマ質量分析の測定値(1秒あたりのカウント数)と、対応する時間ポイント(秒)が表示されます。すべての行を互いに並べて異なる列にリストします。
ラインアブレーションの前に記録されたすべてのガスブランク値から各同位体の平均ガスブランクを計算し、各同位体の対応する生強度から平均ガスブランクを差し引いて、バックグラウンド信号を補正します。内部正規化を適用するには、各同位体のガスブランク補正信号強度を、各データポイントの内部標準炭素13のガスブランク補正信号強度で除算して、アブレーションされた材料の量と機器ドリフトの変動を補正します。各アブレーションされたラインの開始前と終了後にデータをトリミングしてガスブランクの背景信号を削除し、データテーブルを転置して、各行がアブレーションされたラインに対応し、各列が正規化された同位体強度値に対応するグリッドマトリックスを取得します。
次に、ゲルスタンダードの分析から得られたキャリブレーション機能を適用し、キャリブレーションされたデータマトリックスをテキストファイルとして保存します。画像を生成するには、キャリブレーションされたサンプルデータマトリックスをテキスト画像として画像解析ソフトウェアにインポートし、アスペクト比補正係数とルックアップテーブルを適用して溶質画像の化学勾配を視覚化します。画像のカラーバランスを調整して表示範囲の下限と上限を制御し、キャリブレーションバーを追加して、溶質画像をTIFファイルとして保存します。
「システムにコピー」コマンドを使用して、ソリッド画像をコピーし、その画像をデスクトップパブリッシングソフトウェアに貼り付けます。次に、固体画像をスケールマッチ、整列、および関心領域の写真と他の溶質画像で構成します。溶質画像と関心領域の写真画像の位置合わせにより、さまざまな元素のサブミリメートルの2D固体フラックス分布は、土壌構造と根の形態によって大きく変動することがわかります。
例えば、炭酸塩を含まない土壌で栽培し、硝酸アンモニウムを施肥した若いソバの根のこの分析では、サブミリメートルの溶質分布は、根の取り込みにより古い根の部分と並んでアルミニウム、リン、鉄のフラックスが減少するゾーンを示し、局所的な栄養素の動員プロセスにより、根の頂点でのマグネシウム、アルミニウム、リン、マンガン、鉄のフラックスが大幅に増加しました。この分析では、亜鉛、カドミウム、鉛の明確な枯渇が直接の根の位置で観察でき、金属耐性のあるヤナギ種であるSalix smithianaの根が、汚染された土壌中の不安定な微量金属の局所的な吸収源として機能していることを示しています。この分析では、Salix smithianaの根と並ぶ不安定な微量金属の分布を、単層平面オプトード-DGT陽イオン結合ゲルを組み合わせて、pHの分布と共局在化させました。
この分析法の組み合わせにより、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、鉛の溶質フラックスの増加が約 1 単位の pH 低下と関連していることが明らかになり、pH が金属の可溶化を誘発することを示唆しています。DGTツールと固体表面との間に密接で安定した接触を確保することは、分析アーチファクトを避けるために重要です。疑わしい場合は、ゲル塗布手順を繰り返してください。
この方法は、平面オプトードなどの他の拡散ベースの固体イメージング技術と組み合わせて、植物元素の取り込みに関与するさまざまなパラメーターを同時に評価できます。
概要
このプロトコルは、薄膜拡散勾配法（DGT）と質量分析イメージングを組み合わせた方法で、複数の不安定な無機栄養素や汚染物質の溶質種の亜ミリ単位の2D可視化のワークフローを提示します。この方法により、陸生植物の根圏における溶質の定量的マッピングが可能になります。
主要な研究要素
科学分野
- 環境科学
- 土壌化学
- 植物生理学
背景
- 土壌における生物から化学への元素循環は、環境システムにとって重要です。
- 植物が利用可能な元素分画の分布を理解することは、栄養管理にとって重要です。
- 従来の方法では、詳細な分析に必要な空間分解能が得られない可能性があります。
- このプロトコルは、拡張された可視化のためにDGT質量分析イメージングを利用します。
研究の目的
- 溶質界面における複数の無機溶質種の超微量レベルの可視化と定量化を行なう。
- 土壌と沈殿物における労働と溶質のフローを調査する。
- 植物の根がどのように栄養素と汚染物質の元素を吸収するかを探求する。
使用された方法
- ポリウレタンベースの混合アニオンおよびカチオン結合ゲルを使用したDGTゲルの製造。
- 土壌と植物の成長のためのリゾートロンの組み立て。
- 溶質サンプリングのためのDGTゲルの適用。
- DGTゲルの分析のためのレーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析法。
主要な結果
- 2Dでの栄養素と汚染物質の溶質種のイメージングに成功。
- 根圏における溶質の定量的マッピングを実現。
- 代替手法と比較して空間分解能が向上。
- 植物の根による栄養吸収メカニズムの洞察。
結論
- DGT質量分析イメージング法は、土壌-植物相互作用の研究に効果的です。
- このプロトコルは様々な環境研究に適用可能です。
- 将来の研究では、この方法を土壌化学のより広範な応用のために発展させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables sub-millimeter 2D visualization and quantification of labile inorganic nutrients and contaminants in the rhizosphere, providing high-resolution spatial data on solute fluxes at the soil-plant interface. It supports mechanistic de-risking in early discovery by revealing localized nutrient mobilization and trace metal uptake patterns, which can inform target validation for agrochemical or phytoremediation strategies. The quantitative, multi-element imaging capability enhances predictive confidence in modeling plant-environment interactions for translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping labile nutrient and contaminant fluxes in plant-root systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of solute distribution changes associated with root morphology and soil chemistry.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying localized zones of elemental depletion or accumulation linked to plant physiological processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (rhizotrons with DGT gels) for downstream compound screening by establishing baseline solute flux profiles.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal normalization using 13C and external calibration with matrix-matched gel standards.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation through quantitative 2D imaging of multi-element solute fluxes at sub-millimeter resolution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase rhizosphere imaging to preclinical validation by co-localizing solute fluxes with physiological markers such as pH.
- Mechanistic De-risking: Reveals pH-induced metal solubilization patterns, reducing ambiguity in trace metal uptake mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking root-mediated solute fluxes to environmental contamination or nutrient mobilization phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical work, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in soil-plant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing spatial relationships between root morphology and solute fluxes of nutrients and contaminants.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible DGT gel deployment and LA-ICP-MS line-scan imaging for quantitative solute mapping.
- Analytics: Provides normalized, calibrated isotope intensity data enabling cross-condition comparison of labile solute species.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating solute fluxes with environmental parameters like pH, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-element rhizosphere imaging across diverse plant species and soil conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nutrient and contaminant uptake pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sub-millimeter 2D solute flux measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in agrochemical or phytoremediation development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, spatially resolved solute flux data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DGT gel fabrication, rhizotron assembly, and LA-ICP-MS operation.
- Depends on access to laser ablation systems, mass spectrometers, and clean lab environments for gel preparation and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation, deployment, and imaging protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations across plant species, soil types, and contaminant profiles to maintain solute flux accuracy.
- Practical limitations include the need for close and stable DGT gel-soil contact to avoid analytical artifacts, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) Gel Fabrication and Rhizotron Preparation
3:06
Plant Cultivation
3:47
Solute Distribution Sampling
4:48
Gel Retrieval and Chemical Analysis Preparation
5:38
Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Line Scan Analysis
7:39
Data Processing and Calibration
9:03
Image Generation
9:48
Results: Representative Sub-mm 2D Solute Flux Distribution of Multiple Nutrients and Contaminants Across Different Soil-Root Interfaces
11:24
Conclusion
