全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析
2021年9月18日
マウスの気道における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア(3μmの大きさ)の分布の定量分析方法について述べた。この方法は、様々な病理状態モデルにおける気道中の微粒子およびナノ粒子凝集分布の分析にも使用することができる。
我々のアプローチは、全体実装光学的にクリアされたマウス肺のアスペルギルス・フミガトゥス・コニディア分布の定量分析を行うことを可能にする。アスペルギルス・フミガトゥス・コニディアは、気道に浸透し、免疫不全患者に生命を脅かす疾患を引き起こす可能性があります。哺乳類の気道は、異なる世代の気道のシステムです。
各世代は、気道壁と免疫細胞集団の異なる構造によって特徴付けられます。気管支枝では、アスペルギルス・フミガトゥス・コニディアは粘膜クリアランスによって排除される。しかし、利用可能な空間では、粘膜クリアランスは機能せず、コニディアは肺胞マクロファージや好中球などの免疫細胞によってクリアされなければならない。
気道におけるコニディア分布の空間的時間的側面が重要である。しかし、疾患メカニズムを理解する上で問題を適切に調査しなかった。ここでは、感染したマウスの気道におけるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディア分布の定量分析のための実験セットアップを提示する。
標識されたアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアを50マイクロリットルのマウスに塗布します。6時間後、肺を収穫する。2%ホルムアルデヒドと染色に一晩固定し、ストレプトアビジンコンジュゲートを標識します。
その後、試料を光学的な清算に供する。50%メタノール水溶液を充填したガラス瓶に試料を入れ、室温でサンプルミキサーに1時間置きます。50%メタノールを100%メタノールに置き換え、サンプルミキサーの下に2時間置きます。
ベンジルアルコール1部とベンジル・ベンゾエートの2部からなる混合物を調製する。試料を24ウェルプレートに移し、ベンジル・ベンゾエート混合物で少なくとも30分間覆う。サンプルはイメージングの準備ができています。
サンプルホルダーにサンプルを置きます。そして、顕微鏡にホルダーを置きます。顕微鏡システムをオンにしてソフトウェアを開いた後、透過光を点灯してX目的を選択します。
サンプルを透過光の中で視覚的に見つけ、取得タブに進みます。共焦点レーザー顕微鏡ラムダモードを選択します。適切なレーザーをオンに切り替えます。
検出器のスペクトル範囲を設定し、二色性ミラーを選択します。検出器のゲインを調整し、ピンホールを1つのエリアユニットに絞ります。ピクセルの解像度を 512 x 512 に設定します。
zed-stack モードをオンにして、ライブイメージングを開始します。両方のサイコロが見える焦点面を見つけます。zed スタックパネルを展開します。
フォーカスホイールを使用して、サンプルの最も低い平面と最も高い平面を検索して選択します。サンプルの下部の横に焦点面を置きます。zed-stack モードをオフにして、スキャンモードをダイヤルします。
必要に応じて、X、Y の位置とタイルの数を調整します。zed-stack モードとダイヤルスキャンモードをオンにします。zed断面ステップを5ミクロンに設定します。
スキャン速度を設定します。実験を開始します。通常、イメージングは、土地のサイズとスキャン速度に応じて数時間かかります。
得られた画像は、次いでスペクトル的に混合されない。スペクトルのアンミックスには、線形アンミックスオプションを使用します。ストレプトアビジンとコニディアのラベルが付いた土地領域に対応する地域を選択します。
アンミックスを開始します。混合解除後、混合していないファイルを保存します。取得した画像からタイルをスティッチするには、画像を開きます。
方法、幾何学的ステッチを選択します。入力ウィンドウでイメージを選択します。ステッチオプションで、新しい出力とヒューズタイルオプションを選択します。
エアウェイ蛍光に対応する選択したチャネルで参照モードを使用します。余剰の 3D ビューでイメージを開きます。必要に応じて、プレゼンテーションに使用する色を変更します。
ここでは、灰色の色合いで気道チャンネルを表示し、紫色でコニディアチャンネルを表示します。気道マスクを作成するには、新しいサーフェスツールを追加を使用します。気道チャネルを選択し、10ミクロンのスムージングパラメータを選択します。
さまざまなフィルターを使用して、気道信号から除外できます。まず、サーフェスを視覚的に検査し、強度のしきい値を設定します。表面積のような追加のフィルターは、排他的に選択された気道にも適用できますが、胸膜や血管には適用されません。
次に、気道に属さない選択したサーフェスフラグメントを手動で削除します。これで、作成したサーフェスを観察し、不足しているパーツを調査して後で修正することができます。オプション編集とマスクをすべて使用して、気道サーフェスのマスクを作成します。
気道チャネルを選択し、サーフェスの外側にある作業セルを 0.001 に設定します。ここでは、結果のマスクをオレンジで示しました。コニディアチャンネルと気道マスクを2つの別々のフォルダに保存します。
エアーウェイマスクイメージを使用してファイルを開きます。イメージをバイナリにします。プロセスバイナリに従って、バイナリを作ります。
マスクの厚さに似た場合は、いくつかの拡張 3D 関数を適用します。プラグイン、プロセス、拡張3Dに従ってください。マクロ機能を使用してこれを行うこともできます。
数サイクルの拡張プロセスの後、穴の穴関数を使用します。プロセス、バイナリ、フィルホールに従ってください。マスクの残余穴を手動で埋めるには、関心のある領域マネージャを開きます。
分析、ツール、ROI マネージャーに従います。ポリゴン選択ツールを使用して、特定の投影で塗りつぶす領域を選択します。対象領域の形状を補間できるように、zed スタックの投影法に対して複数回実行します。
選択した図形を補間するには、すべての図形を選択し、さらに押して、ROI を補間します。その後、すべての ROI を白で塗りつぶします。穴の穴をもう一度使用します。
穴を埋めた後にマスクの厚さを元に戻す場合は、浸食 3D 関数を適用します。プラグイン、プロセス、侵食3Dに従ってください。これにはマイクロを使用することもできます。
浸食 3D と LA 3D の反復の数は等しい必要があります。コニディアカウントアプリケーションを起動します。ファイルの追加ボタンを押して、準備された気道マスクとConidia蛍光画像を持つDIFFファイルを持つフォルダを選択します。
カスタムしきい値を 0 から 1 の間で設定します。[OK] をクリックして結果を確認します。この手法を用いて、コニディア塗布から6時間後に、マウスの気管支樹の内外でコニディアの定量分析を行う。
データは、私たちの元のアプリケーションでは、Conidiaの大部分がアルファラ空間に浸透し、炎症性免疫応答の開始時にそこに割り当てられたことを示唆しています。共焦点レーザー走査顕微鏡によるマウス肺の3次元画像化により、気道内のアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアを同定できる。このプロトコルを用いた3次元画像の処理により、気管支の内外でのコニディア分布の定量分析を行うことができます。
我々のアプローチはまた、マウスの離れからコニディア排除の運動学を推定し、免疫担当および免疫不全マウスにおける解剖学的コニディア分布を比較するために利用することができる。さらに、このアプローチを使用して、気道に凝集した微粒子またはナノ粒子の分布を分析することができる。
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概要
この研究は、マウスの気道におけるアスペルギルス・フミガトゥスの分布の定量分析の方法を提示しています。この技術は、様々な病理学的条件下での微粒子およびナノ粒子凝集体の分布を分析するためにも適用できます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 微生物学
- 免疫学
背景
- アスペルギルス・フミガトゥスは、特に免疫機能が低下した個人において、重度の呼吸器疾患を引き起こす可能性があります。
- 呼吸器は、構造と免疫細胞の集団が異なる気道で構成されています。
- 粘液繊毛クリアランスは、吸入された分生子に対する主要な防御メカニズムです。
- 特定の領域では、肺胞マクロファージや好中球などの免疫細胞が分生子を除去する上で重要な役割を果たしています。
研究の目的
- マウスの肺におけるアスペルギルス・フミガトゥスの分生子の分布を分析する定量的方法を開発すること。
- 呼吸器系における分生子の挙動の理解を深めること。
- 吸入された病原体に対する免疫応答に関する洞察を提供すること。
使用された方法
- マウスの肺の全層光学クリアリング。
- 分生子分布の定量分析。
- 気道構造と免疫細胞相互作用の評価。
- この方法を微粒子とナノ粒子凝集体に適用すること。
主要な結果
- この方法は、気道における分生子の分布を効果的に視覚化し、定量化します。
- 結果は、呼吸器から分生子を除去する上での免疫細胞の役割を強調しています。
- この技術は、病理学的モデルにおける他の粒子の研究に適応できます。
- 結果は、呼吸器感染のダイナミクスの理解に貢献します。
結論
- 開発された方法は、呼吸器系の真菌感染を研究するための貴重なツールです。
- 得られた洞察は、リスクの高い集団のための治療戦略に情報を提供できます。
- 将来の研究は、呼吸器健康におけるより広範な適用のためにこの方法論を拡張できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative spatial analysis of pathogen distribution in whole-mount cleared tissues, supporting mechanistic de-risking in antifungal target validation. By providing 3D localization and kinetic data on conidia clearance, it informs predictive confidence in preclinical models of immunocompromised host defense. The approach enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation of host-directed or pathogen-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying conidia localization in bronchial versus alveolar compartments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by identifying spatial patterns of immune cell-pathogen interaction.
- Operational Value: Provides reproducible 3D imaging workflow for de-risking mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of conidia burden inside and outside bronchial trees for assay standardization.
- Operational Value: Enables scalable, multiplex-compatible imaging of fluorescently labeled pathogens in cleared whole organs.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility through standardized optical clearing, staining, and spectral unmixing steps.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links early immune response dynamics to pathogen elimination kinetics in immunocompetent versus immunocompromised models.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by correlating spatial conidia distribution with immune cell recruitment.
- Operational Value: Permits longitudinal tracking of conidia clearance to inform risk-adjusted advancement decisions in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatial hypothesis testing and pathway clarification in pulmonary infection models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune evasion mechanisms through quantitative 3D mapping of conidia distribution.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissue preparations with quantitative fluorescence readouts for compound or genotype screening.
- Analytics: Provides z-sectioned, spectrally unmixed 3D datasets enabling statistical comparison of conidia burden across experimental groups.
- Translational Research: Connects early innate immune responses to preclinical outcomes via spatial-temporal pathogen tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for analyzing particulate distribution (e.g., microparticles, nanoparticles) in respiratory disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in antifungal target validation through direct visualization of pathogen-immune interactions.
- Operational Value: Standardizes whole-mount lung processing for reproducible, high-content 3D imaging across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy data in immunocompromised host models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on anatomical compartment-specific pathogen clearance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, optical clearing, and 3D image analysis workflows.
- Dependent on laser scanning microscopy with spectral unmixing and tiling capabilities for whole-lung imaging.
- Necessitates cross-team standardization of staining, clearing, and masking protocols for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of clearing duration and refractive index matching.
- Practical limitations include imaging time scaling with lung size and scanning speed, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Aspergillus fumigatus Conidia Application & Specimen Preparation
1:22
Mouse Lung Lobe Optical Clearing
2:23
Mouse Lung Lobe Imaging with CLSM
6:50
Image Processing: Surface Rendering
9:23
Image Processing: Mask Correction
12:54
Conidia Quantitative Analysis
13:41
Representative Results
14:07
Conclusions
