Name: 3日間発生した雛胚を用いたフック虚血再灌流モデルの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 学ぶ虚血再灌流モデルの作成法。3日齢の鶏胚を用いて、低コストで再現性の高い虚血再灌流障害の研究モデルを構築し、血流変化のリアルタイムモニタリングや治療介入の評価を行う手法を解説します。

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ビデオ撮影と編集中の彼の批判的なインプットに対するハリ・シャンカール、ナレーションのためのバケル・フセイン氏、ビデオ編集のためのアスガル・リズヴィ氏、ビデオ撮影のためのモハマド・ハイダー氏、実験中の支援のためのモハマド・デンマーク・シディキ氏に感謝したいと思います。

Eraのラクナウ医科大学と病院の制度的動物倫理委員会は、動物実験の管理と監督を目的とした委員会(CPCSEA)に従ってこれらの実験を行うための正式な承認は必要ないという書面による免除を発行しました。しかし、胚性苦痛の可能性を最小限に抑えるために、標準的な操作手順に従った。
1. バッファ調製(表1)
<ol><li>リンガーのソリューションを準備する<ol>
<li>リンゲルの溶液を調製するには、NaCl(123 mM)の0.72 g、CaCl2 (1.53 mM)の0.017 g、70mLのKCl(4.96 mM)の0.037 gを無菌蒸留H2Oの70 mLに溶解し、最終体積は100mLです。pH を 7.4 に調整します。完全に溶解し、オートクレーブしましょう。その後、0.22 μmフィルターを通してフィルターし、アリコートを一回使用量(約10 mL)にして室温で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通常の生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム、NaCl)を準備します。<ol>
<li>70 mLの無菌蒸留H2Oに、NaCl(154 mM)の0.9 gを溶解する。音量を100mLにします。121 °Cで15分間オートクレーブ。 必要に応じて、pHを 0.1 N HCl で 7.4 に調整するか、必要に応じて 0.1 N NaOH に調整します。15 mLの無菌遠心分離機チューブで10 mLのアリコートを作り、室温で保管します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>70%エタノール(v/v)を準備します。<ol>
<li>70 mLの純粋なエタノール(Mol. 46.07 g/L)を30 mLの無菌H2Oに混ぜ合わせます。殺菌の必要性がない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1xリン酸緩衝液生理食塩分(1x PBS)を準備します。<ol>
<li>1x PBSの100 mLを、Na2HPO4·7H2O(5.37mM)、0.8gのNaCl(136.8 mM)、0.2gのKCl(26.8 mM)、0.2gのKH2PO4(14.6mM)の70mLに蒸留水の70mLを加えて調製します。 121 °Cで15分間、100mLとオートクレーブに溶解し、ボリュームを構成します。 pH を 7.4 に持ち込み、必要に応じて 0.1 N HCl または 0.1 N NaOH のドロップを 2、3 ドロップ追加します。15 mLの無菌遠心分離管で10 mLのアリコートを作り、室温で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 1日目
<ol><li>卵の殺菌に必要なすべてのツール(70%エタノール、クリーニングワイプ、卵ラック、OHPマーカー)を配置します。</li>
	<li>ティッシュペーパーワイプを使用して70%エタノールで0日の卵をきれいにします。古い卵は胚を生じないかもしれないので、0日の卵だけを使用してください。</li>
	<li>OHPマーカーを持つ卵に現在の日付を書きます。</li>
	<li>卵を36~37°Cの温度と湿度60%~65%に設定した卵インキュベーターに入れます。次の24時間の卵をインキュベートします。</li>
</ol>3. 2日目
<ol><li>アルブミン(シャープエッジはさみ、5 mLシリンジ、18G針、注射器の廃棄、および粘着テープ)の撤退に必要な機器を配置します。</li>
	<li>70%エタノールで手術用はさみを拭くか、70%エタノールで拭いた後、オートクレーブを使用して滅菌します。</li>
	<li>今、重ねるために37°Cの卵インキュベーターから卵を取ります。</li>
	<li>きれいな卵のラックの上に卵を置きます。</li>
	<li>小さな粘着テープ(サイズ:長さ約1インチ×幅)を卵の端に取り付けます。</li>
	<li>鋭利な尖ったエッジはさみを使用して、卵殻の端に小さな穴を作ります。5 mL のシリンジをおよそ 75° の角度で挿入します。 注意:5 mLの注射器は24 G x 1針(無菌)が付属していますが、24 G x 1針を18 G x 1.5針(滅菌)に交換することは良いことです。18 G x 1.5針は幅1.25 x 38 mmです。したがって、アルブミンの除去を容易にする。</li>
	<li>卵黄嚢に針を挿入した後、アルブミンの5〜6 mLをゆっくりと引き出す。 注:これは、それが成長することができるベッドを胚に提供します。アルブミンを撤回すると、ウィンドウを確立しながらアルブミンのオーバースピルを防ぐことができます。最後に、5-6 mLのアルブミンを排除することで、窓の間に胚が損傷するリスクを軽減します。</li>
	<li>アルブミンを取り除いた後、粘着テープで開口部を再密封し、卵を残して37°Cで48時間インキュベートします。</li>
</ol>4. 4日目
<ol><li>プロトコルのセクション 1 で説明されているように、リンガーの溶液、通常の生理液0.9%、PBS 1x を準備します。次に、3つのソリューションをオートクレーブします。オートクレーブ処理に続いて、それぞれの溶液を室温に置きます。</li>
	<li>37°Cの卵インキュベーターから卵を取り出し、殻を円形に切ります。卵殻を切る前に、粘着テープで切る部分を覆います。 メモ:窓の領域を粘着テープで覆うと、卵殻が望ましくない場所に壊れないようにします。ただし、不要な場所に侵入した場合は、粘着テープでエリアを密封してください。粘着テープで切る場所を覆うと、殻片が黄身嚢に落ちるのを防ぎます。</li>
	<li>窓が望まれる場所に鋭く尖ったエッジはさみで卵殻に小さな穴を作成し、円形の開口部を切断し始めます。このプロセスはウィンドウと呼ばれます。 注:円形カットは、任意の方向から胚に簡単にアクセスできるように十分な大きさであることを確認してください。必要に応じて、胚の位置に合わせて卵の位置を変更します。</li>
	<li>次に、ステレオズーム手術用顕微鏡を使用して、右ビテリン動脈(RVA)を見つける。 注意:鶏の胚は通常、72時間の段階で頭の左側が黄身に対して起こるように、発達するにつれて胸部の胸部の胸部(子宮頸部屈曲などと共に)を受ける。より大胆には、ビテリン動脈が体を出るところでは、胚はあまりねじれず、体のこの部分は黄身に向かって腹側にある。だから、直接見て、胚の右は研究者の右側にあります。</li>
	<li>RVA が配置されたら、26 G 針を使用して RVA の左側と右側に 2 つの小さな穴を作成します(図 2)。</li>
	<li>ドップラー血流イメージングプローブをRVAの上に置きます。ドップラー血流イメージングプローブは、虚血部位からRVAの遠位端に向かって5±1mmに配置されていることを確認します。2分と30 s(または必要に応じて長く)のフラックスの読み取りを取ります。これは規範的な相の読み取りになります。</li>
	<li>その間、鼻のペンチと歯付き鉗子を使用して、脊髄針の端をフックの形に手動で成形します(図3)。これは、脊髄の端を約1mm曲げて行います。サイズが大きいほど、I/R手順中に脊髄針を挿入したり取り外したりすることが難しくなります。</li>
	<li>マイクロマニピュレーターを使用して、右のビテリン動脈のすぐ下に脊髄針を挿入します。 注:RVAまたは隣接する動脈を損傷しないように細心の注意を払って脊髄針を挿入してください。最適な技術は、RVAホールの右側のすぐ上に脊髄針のカスタム設計されたフックを調整し、続いて右穴を通してステレオズーム手術顕微鏡の指導の下でマイクロマニピュレータの助けを借りて、徐々に脊髄のカスタム設計されたエッジを黄身嚢に挿入することです。脊髄針のフックが黄身嚢に入ったら、RVAの下のフックを徐々に調整して、その端が左穴の下に正確に配置されるようにします。今が脊髄針を持ち上げる時です。</li>
	<li>さて、マイクロマニピュレーターの助けを借りて、ドップラー血流フラックスが動脈流量の最低80%の減少を示すまで徐々に動脈を持ち上げる。</li>
	<li>ドップラーフラックスで80%以上のドロップダウンが達成されたら、脊髄の針を持ち上げて(動脈を上に引っ張る)5分間放置します。これはRVAにおける虚血の期間になります。 注: 虚血の期間中にドップラーフラックスを監視することが重要です。かなりの変動が見つかった場合は、テストを終了します。</li>
	<li>5分の虚血期間の後、徐々に正常な血流レベルを回復するために動脈を解放する。ドップラー血流計の読み取り値は、ノルモキシア中に得られたものと同等の値を表示することを確認します。これはRVAにおける再灌流の期間になります(図4)。</li>
	<li>I/R手順の後、1x PBSの数滴(2〜3)を胚に塗布し、2〜3分間監視します。 注:1x PBSを使用すると、胚が乾燥するのを防ぐことができます。</li>
	<li>最後に、粘着テープで窓を再密封し、卵を卵インキュベーターに5時間55分間戻します。</li>
	<li>5時間と55分後に卵を卵インキュベーターから取り出し、卵ラックの上に置き、窓を開け直し、下流の処理プロトコルに従ってください。</li>
</ol>5. 治療
<ol><li>薬物、活性化剤、または阻害剤による動脈の治療のために、I/Rプロセスの1時間後にRVAを物品切りする。</li>
	<li>下流の研究では、まず胚を無菌90mmペトリ皿に置いて卵殻から取り除きます。</li>
	<li>胚がペトリ皿に放出されたら、ステレオズーム手術顕微鏡の指導の下で眼の虹彩を使用してRVAを切除する。</li>
	<li>RVAの切除寸法が最大15±1mm(幹からの遠位)、動脈の左右に5±1mm、トランクに向かって2±1mmであることを確認します。 注: ルーラーを使用して、切除する領域を測定できます (省略可能)。</li>
	<li>RVAを切除した後、1x PBSを含む滅菌ペトリ皿で1x PBSで洗浄します。</li>
	<li>所望の処置のために、リンガーの溶液の500 μLで満たされた1.5 mL遠心分離管(殺菌)に動脈を置く。RVAを遠心分離管に入れ、37°Cインキュベーターに5時間55分間置きます。 注:治療に応じて、何の治療もせずにRingerの溶液を使用するか、または薬物、アクチベーター、または阻害剤の所望の体積と濃度での治療を行ってください。</li>
	<li>5時間及び55分のインキュベーション後、37°Cの実験室インキュベーターからRVAを取り出し、所望の処置を進める。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

虚血再灌流研究の目的は、細胞死を予防し、回復を促進する治療戦略を作成することです29,30.I/R研究における現在の制約を克服するために、我々は信頼性の高い、再生可能なI/Rモデルを作り出すためにフックI/Rのひよこ胚モデルを設計した。私たちの知る限りでは、私たちの知る限りでは、ストレス信号(酸化ストレスや炎症ストレスなど)を研究する以外に、ルーチンI/R実験のために3日間のひよこ胚で作成された最初のI/ Rモデルです。開発31日目のサイズとアクセシビリティの利点を考えると、ひよこ胚は、モデルの高出力、採用の簡易性、およびルーチン分析32の適応性のために、72時間の発達段階で使用された。簡単に言えば、発達3日目に、ovoひよこは、正常な生理学、疾患病理、および実験的治療の効果を視覚化するために使用することができる卵内の高度に制御され、まだアクセス可能で合理的に透明なモデルです。その巨大なサイズは、正常な生理学...

虚血再灌流組織損傷は、心臓発作、虚血性脳卒中、外傷、および末梢血管疾患を含む多くの病理に関連している1、2、3、4,5。これは主に、疾患の進行に関する包括的な理解の欠如と効果的な研究モデルの欠如によるものです。虚血性損傷は、組織の特定の領域への血液供給が遮断されたときに起こる。その結果、虚血性組織は最終的に壊死するが、速度は組織によって異なる。したがって、血液供給を回復することは、損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。しかし、再灌流は虚血単独で6,7,8よりも多くの組織損傷を引き起こすことが観察されている。したがって、効果的な治療介入を開発するためには、虚血再灌流の分子および細胞機構を理解することが必要である。現在、I/R傷害に対する有効な治療法は知られていない。この格差により、in vitroからin vivoモデルに至るまで、既存の問題9,10,11,12,13に対処するための新しい実験モデルが作成されました。
ひよこ胚(ガルス・ガルス・ドメスティックス)は、アクセスの容易さ、倫理的受容性、比較的大きなサイズ(他の胚と比較して)、低コスト、および急速な成長のために研究に広く使用されています14。72時間の発達でひよこ胚を使用して、脊髄の助けを借りて右ビテリン動脈を閉塞して放出することで、ovo I/Rの中に胚を作り出しました。フックI/R虚血再灌流モデルと命名しました(図1)。本研究で利用されたモデルは、I/R損傷15,16,17に頻繁に関連する酸化および炎症経路を含むすべての下流プロセスを正確にシミュレートすることができる。

<table><tbody><tr><td>(-80°C;C)冷凍庫</td><td>ハイアール、中国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL遠心分離管</td><td>ターソンズ、インド</td><td>500010X100mm</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(滅菌)</td><td>ターソンズ、インド</td><td>460050</td><td></td></tr><tr><td>18G針(18G&times;1.5 (1.25&times;38mm)</td><td>Ramsons, India</td><td>13990</td><td></td></tr><tr><td>1mLシリンジ</td><td>DISPO VAN-26G</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>針 (26G&times;1/2 (10.45x13mm)</td><td>ディスポバン、インド</td><td>30722D</td><td></td></tr><tr><td>37&deg;湿度調整可能なパーセンテージのCエッグインキュベータ</td><td>ーGentek、インド</td><td>GL-100</td><td></td></tr><tr><td>37&deg;C ラボラトリーインキュベーター</td><td>SCIENCE TECH, India</td><td>CB 101-14</td><td></td></tr><tr><td>3-Methyladenine (3-MA)</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>M9281</td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasture Pipette</td><td>TARSONS, India</td><td>940050</td><td></td></tr><tr><td>50mL Beaker</td><td>TARSONS,</td> <td>India-5mL</td><td></td></tr> <tr><td>Syringe</td><td>DISPO VAN, India</td><td>IP53</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Merck Millipore, United States</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>粘着テープ/チェロテープ</td><td>Sunrise,</td> <td>India-Ambra1</td><td></td></tr> <tr><td>primers</td><td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td><td>Hs00387943_m1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories, USA</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Atg7</td><td>R&D Systems, USA</td><td>MAB6608</td><td></td></tr><tr><td>Atg7 primers</td><td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td><td>Hs00893766_m1</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Bag</td><td>Tarsons, India</td><td>550022</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Machine</td><td>Local made, Lucknow,</td><td></td> India-Beclin-1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Proteintech, USA</td><td>66665-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>Beta Actin</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>ITT07018</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンハイ</td><td>メディア、ムンバイ、インド</td><td>TC194</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ヒメディア、ムンバイ、インド</td><td>GRM534</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>イムノタグ、アメリカ</td><td>ITT5155</td><td></td></tr><tr><td>クリーニングワイプ</td><td>キンバリークラーク、インド</td><td>370080</td><td></td></tr><tr><td>Cleaved Caspase3</td><td>ImmunoTag、アメリカ</td><td>ITT07022</td><td></td></tr><tr><td>ジナトリウムリン酸水素七水和物</td><td>Himedia, Mumbai, India</td><td>GRM39611</td><td></td></tr><tr><td>Doppler blood flowmeter</td><td>Moors instrument, United Kingdom</td><td>moorVMS-LDF1</td><td></td></tr><tr><td>Egg rack</td><td>-</td><td>-</td>Egg rack--<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>M1000110</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH primers</td><td>Applied Biosystems, Foster city, USA</td><td></td><td></td>Hs02758991_g1</tr><tr><td>Glycine Himedia</td><td>, Mumbai, India</td><td>MB013</td><td></td></tr><tr><td>Kidney tray</td><td>HOSPITO-LC3A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>/B</td><td>Cell Signaling Technology, USA</td><td>4108S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Rankem laboratories, Mumbai, India</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>成茂, 日本</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン(NAC)</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Naringenin</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>67604-48-2</td><td></td></tr><tr><td>NF-k&beta;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国</td><td>51-0500</td><td></td></tr><tr><td>NLRP3</td><td>ImmunoTag、米国</td><td>ITT07438</td><td></td></tr><tr><td>ノーズプライヤー</td><td>ローカル製、ラクナウ、インド</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>眼鉗子</td><td>Stoelting、ドイツ</td><td>52106-40</td><td></td></tr><tr><td>眼虹彩</td><td>Tufft 手術器具、ジャイプール、インド</td><td>ハードエイジ Vannas マイクロはさみ 角度付き 8CM / 3 1/8"</td><td></td></tr><tr><td>OHPマーカーペン</td><td>Camlin,</td><td></td> India-ORP-150 <td></td></tr><tr><td></td><td>ImmunoTag, USA</td><td>ITT08329</td><td></td></tr><tr><td>Pointed sharp edge scissor</td><td>Stoelting, Germany</td><td>52132-11</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Himedia, Mumbai, India</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>Himedia, Mumbai, India</td><td>MB050</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor</td><td>Abcam, United States</td><td>Ab65621</td><td></td></tr><tr><td>SOD-1</td><td>ImmunoTag, USA</td><td>ITT4364</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific, Mumbai, India</td><td>27605</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Himedia, Mumbai, India</td><td>GRM886</td><td></td></tr><tr><td>Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm)</td><td>Ramson, India</td><td>GS-2029</td><td></td></tr><tr><td>ステレオズーム手術用顕微鏡</td><td>オリンパス、日本</td><td>SZ2-STU3</td><td></td></tr><tr><td>シリンジディスカード</td><td>BIOHAZARD</td><td>882210</td><td></td></tr><tr><td>歯付き鉗子</td><td>Stoelting、ドイツ</td><td>52102-30</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>G Biosciences、米国</td><td>RC1217</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochloric Acid</td><td>Himedia、ムンバイ、インド</td><td>MB030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>G Biosciences、米国</td><td>RC1227</td><td></td></tr><tr><td>ホワイトレグホーンチキン0日卵</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK</td><td>MP Biomedicals、LLC、アメリカ</td><td>FK009</td><td></td></tr></tbody></table>

3日間発生した雛胚を用いたフック虚血再灌流モデルの生成

Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患などの虚血および再灌流(I/R)障害は、病気や死亡の主要な原因の一部です。イン ビトロ および インビボ モデルの多くは、現在、疾患または損傷した組織におけるI/Rメカニズムを研究するために利用可能です。しかし、現在までに 、ovo I/Rモデルには報告されておらず、I/Rメカニズムのより良い理解と薬物スクリーニングの迅速化を可能にする。この論文では、3日間のひよこ胚に脊髄をカスタマイズしたフックを用いてI/Rの発達と治療メカニズムを理解するI/Rモデリングについて説明する。このモデルは、DNA、RNA、およびタンパク質レベルの異常を調査するために使用できます。この方法は、簡単で、迅速で、安価です。現在のモデルは、独立して、または既存 のin vitro および in vivo I/Rモデルと組み合わせて使用することができます。

ドップラー血流イメージング技術は、当社のモデルの有効性を評価するために使用されました。つまり、コントロールグループのデータと RVA グループのデータを比較して、作成の成功を判断しました。 図4Aは 、制御動物に関連する代表的なフラックスを示し、 図4B はRVAから得られた結果を示している。数値 1 から 8 は、I/R フェーズに関連付けられたさまざまなイベントを表します。簡単に言えば、数値1-3はノルモキシアの相に対応し、点3および4での流束の急激な減少はRVAにおける血流の減少に関連する事象を表す。80%以上のドロップダウンが達成されると、RVAは次の5分間上昇したままでした。これは虚血の相(数値4-5)であった。RVAの5分の持ち上げの後、RVAは、数値6と7で表されるリリースされました。ポイント7以降のフラックスは、RVAが正常な血流レベルを達成した後に起こる再灌流期を表し、これは再灌流の段階であった。この特定の実験は、3日間開発されたひよこ胚におけるI/Rモデリングの有効性を実証した。
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本論文では、I/Rの発達と治療をよりよく理解するために、脊髄カスタマイズフックを用いた3日間のひよこ胚における虚血再灌流(I/R)モデリングについて述べている。このモデルは、シンプルで迅速で、安価です。

Ischemia and reperfusion (I/R) disorders, such as myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease, are a few of the leading causes of ...

こんにちは、私はインドのラクナウにあるエラ大学キャンパスのバイオテクノロジー学科にある幹細胞修復神経学研究所の主任研究者であるSyed Shadab Raza博士です。私の研究室では、虚血再灌流障害の根底にある病態生理学的メカニズムと、その過程を逆転させる介入を理解するよう努めています。この文脈では、虚血性脳卒中のインビトロおよびインビボモデルを頻繁に採用する。最近、3日間でひよこ胚を発症する虚血再灌流傷害モデルを作成しました。だから今、私の学生は、ひよこ胚を開発する3日間で虚血再灌流傷害を複製する方法を紹介するつもりです。今、私たちは3日間のひよこ胚で虚血再灌流を作成する方法を紹介するつもりです。当社のモデルは、費用対効果が高く、時間効果が高く、非常に再現性が高い。それでは、始めましょう。1日目。初日の要件。プロシージャ。ティッシュペーパーワイプを使用して70%エタノールでゼロデーエッグをきれいにします。次に、OHPマーカー付きの卵に現在の日、日付を書き、摂氏36〜37度の温度と湿度60〜65%の卵インキュベーターに卵を入れます。次の24時間卵をインキュベートします。2日目。2 日目の要件。プロシージャ。手術用はさみを70%エタノールで拭くか、オートクレーブを続ける。24時間のインキュベーションの後、卵をインキュベーターから取り出して重ねます。次に、セロテープの小片を卵の端に約1インチの長さと幅に取り付け、鋭利な尖ったエッジハサミを使用して卵殻の端に小さな穴を開け、その後、約75度の角度で5 mLシリンジを挿入します。卵黄袋に針を挿入した後、ゆっくりとアルブミンの5〜6 mLを引き出します。アルブミンを取り外した後、セロテープで穴を再シールし、次の48時間、37度の摂氏卵インキュベーターに卵を戻します。4日目。4日目の要件。プロシージャ。リンガーの溶液、0.9%正常生理食塩水、1つのXリン酸緩衝液生理食塩水を、この原稿に記載されている表に従って準備します。その後、3つのソリューションをオートクレーブします。オートクレーブの後、それぞれの溶液は室温で置かれてもよい。次に、37度の卵インキュベーターから卵を取り出します。シェルを切断する前に、Sellotapeで窓の領域をカバーします。そして今、卵の殻に小さな穴を作り、円形の開口部を切断し始めます。このプロセスはウィンドウと呼ばれます。卵の位置を胚の位置に合わせて調整する必要があるため、胚が任意の方向から容易にアクセスできるように、円形カットが十分に大きかっていることを確認してください。さて、ステレオズーム手術顕微鏡を使用して、右のバイタルライン動脈またはRVAを見つける。ここでは、矢印は胚の3日間の発達段階を示す。RVAが配置されると、26 G針を使用して、RVAの左右に2つの小さな穴を作ります。次に、ドップラー血流イメージングプローブをRVAに調整します。ドップラー血流イメージングプローブは、虚血部位から5プラスマイナス1ミリメートル、RVAの遠位端の3分の2を配置する必要があります。必要に応じて、30秒から2分間のフラックス読み取りを行います。これはノルモキシア相の読み取りを行います。今手動で手動で歯の鉗子に続く鼻のペンチの助けを借りてフックの形を与えるために脊髄の端を成形します。さて、マイクロマニピュレーターを使用して、右のバイタルライン動脈のすぐ下に脊髄針を挿入する。あなたは、脊髄針を持ち上げる準備ができています。今、マイクロマニピュレータの助けを借りて、ドップラー血流フラックスが動脈流量の最低80%の減少を示すまで、ゆっくりと動脈を持ち上げる。ドップラーフラックスで80%以上のドロップダウンが達成されたら、脊髄針を上に持ち上げ、動脈を5分間引っ張ります。これは虚血の期間になります。5分のこの虚血タイミングの後、正常な血流レベルを回復させるためにマイクロマニピュレーターの助けを借りてゆっくりと動脈を解放する。今、ドップラー血流メーターは、ノルモキシア中に観察されたものと同様の測定値を示す必要があります。これはRVAの再灌流の期間になります。I/Rプロセス後、胚に2滴、3滴の1XPBSを塗布する。最後にセロテープで窓を再シールし、卵を卵インキュベーターに5時間55分間戻します。5時間55分後、卵インキュベーターから卵を取り出し、卵トレイに置き、窓を開け直します。治療要件。プロシージャ。薬物、活性化剤または阻害剤による動脈の治療のために、RVAはI/ Rプロセスの1時間後に切除されるべきである。胚をシェルから無菌100 mmペトリ皿に取り出して取り除きます。胚がペトリ皿で放出されたら、ステレオズーム手術顕微鏡の指導に眼虹彩を使用してRVAを切除する。RVA の切除寸法は、トランクから 15 + マイナス 1 ミリメートル、トランクに向かって 2 プラスマイナス 1 ミリメートルにする必要があります。RVAを切除した後、新しい滅菌ペトリ皿で1X PBSで洗浄します。所望の処置のために、リンガーの溶液の500マイクロリットルで満たされた殺菌された1.5ミリリットル遠心管に動脈を入れる。遠心分離管に動脈を入れた後、37度の摂氏検査室のインキュベーターに5時間入れる。5時間のインキュベーションの後、37°Cの実験室のインキュベーターからRVAを取り出し、所望の処置のために進む。そして今、結果を提示する。虚血性動脈における虚血再灌流研究におけるモデルの有用性を検証するために、まず酸素調節タンパク質150またはORP150、細胞質スーパーオキシドジスムターゼ1またはSOD1およびカタラーゼの活動を調えた。I/R処理RVAは、対照群と比較するとORP150、細胞質SOD1およびカタラーゼの活性が増加したが、現在の図で明らかなように、N-アセチル-L-システイン、またはNAC、ROSクエンチャー、I/R群の酸化ストレスの減少を補った。炎症調査のためにこのモデルの有用性を確立するために、I/R処理RVA対対照RVAにおけるI/R-1ベータおよびTNF-αの発現を調べた。インターロイキンはいずれも対照群と比較してフックI/R群で過剰発現していることが判明した。抗炎症薬であるナリンゲンの補充は、Il1-βとTNF-αのレベルを有意に低下させた。次に、ウェスタンブロッティングを介したNLRP3およびNF-κベータの発現を調べた。この分析は、RVAで産生されたI/Rに応答して、NLRP3インフラマソームの活性化の証拠と、NF-κベータの証拠を発見した。以前の結果と同様に、ナリンゲンはNLRP3およびNF-κベータの発現を減少させた。これらの結果は、我々のモデルが炎症変化を調査するために使用できることを実証した。次に、アポトーシスおよびオートファジー経路に対するI/Rの効果を検討した。まず、図Aでは、切断カスパーゼ-3の式にアクセスしました。コントロール群と比較してI/R群における切断カスパーゼ-3の発現が増強され、ZVADFMKを受けているI/R群はカスパーゼ-3の発現の減少を示した。オートファジーの場合も同様に、I/R群はLC3の高いタンパク質レベルを示し、哺乳類細胞におけるオートファジーの主要な調節因子であるオートファゴソームマーカーBeclin-1、およびATG-7は、対照群よりも基底オートファジーに必要なタンパク質であり、オートファジー阻害剤である3-maを受けているグループは、上記の3つのオートファジー阻害剤の発現の減少を示した。 図BからD.までの明らかなように図Eは、アンブラ-1およびATG-7 mRNAレベルに対するフック媒介I/Rの効果を示している。これらの結果は、以前の結果と一致した、すなわち、I/R処理されたRVAにおけるアンブラ-1およびATG-7に対するmRNA発現の増強が、それぞれの対照と比較して観察された。しかし、I/Rグループに3-maを追加すると結果が逆転した。現在の図は、DNAの変化を研究するためのモデルの有効性を表しています。コントロール群と比較して、I/R処理群に強いDNA塗抹標本を観察した。しかし、I/R RVAグループへのNACの補充は結果を逆転させた。他のモデルと比べてモデルの効果を調べるには、今回の実験でフックI/RモデルとMCAOモデルで生成したデータを比較しました。簡単に言えば、アポトーシスタンパク質の発現は、切断カスパーゼ-3、オートファジータンパク質、ベクリン-1およびATG-7、および炎症性インターロイキン、TNFおよびIFNにおいて、コントロールRVAよりも高くなるはずだった。興味深いことに、Hook-I/Rモデルは、炎症性ストレスや細胞死経路の分析であったかどうかにかかわらず、MCAOモデルによって得られたものと非常によく似た結果を得た。我々のモデルは、既存のモデルに単独または平行のいずれかのルーチン虚血再灌流実験に使用することができます。しかし、虚血再灌流を模倣する際には、RVAの左右の穴を開ける際、また、動脈や静脈を損傷しないようにRVAを閉塞または放出する際に、最も高い予防措置を講じるべきである。ウエスタンブロッティング、QRT-PCR分析装置、化学酸、イメージング技術などの日常的な分子生物学では、3日間で核血症再灌流に関連する病態生理学を関連付けるために即興でひよこ胚を発症する可能性があります。このモデルは、DNA、RNA、タンパク質レベルで分子力学を効率的に研究するために使用できます。私たちが示したように、ひよこ胚を開発する3日間のI/Rモデリングは、私たちのモデルがI / R研究の分野で新しい道を開くと信じています。この作品で、私はあなたの実験のためにあなたにすべてのベストを願っています。ありがとうございました。

generation-hook-ischemia-reperfusion-model-using-three-day-developing

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ虚血再灌流モデルの作成法。3日齢の鶏胚を用いて、低コストで再現性の高い虚血再灌流障害の研究モデルを構築し、血流変化のリアルタイムモニタリングや治療介入の評価を行う手法を解説します。

3日間発生した雛胚を用いたフック虚血再灌流モデルの生成

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