3日間発生した雛胚を用いたフック虚血再灌流モデルの生成
February 19th, 2022
本論文では、I/Rの発達と治療をよりよく理解するために、脊髄カスタマイズフックを用いた3日間のひよこ胚における虚血再灌流(I/R)モデリングについて述べている。このモデルは、シンプルで迅速で、安価です。
こんにちは、私はインドのラクナウにあるエラ大学キャンパスのバイオテクノロジー学科にある幹細胞修復神経学研究所の主任研究者であるSyed Shadab Raza博士です。私の研究室では、虚血再灌流障害の根底にある病態生理学的メカニズムと、その過程を逆転させる介入を理解するよう努めています。この文脈では、虚血性脳卒中のインビトロおよびインビボモデルを頻繁に採用する。
最近、3日間でひよこ胚を発症する虚血再灌流傷害モデルを作成しました。だから今、私の学生は、ひよこ胚を開発する3日間で虚血再灌流傷害を複製する方法を紹介するつもりです。今、私たちは3日間のひよこ胚で虚血再灌流を作成する方法を紹介するつもりです。
当社のモデルは、費用対効果が高く、時間効果が高く、非常に再現性が高い。それでは、始めましょう。1日目。
初日の要件。プロシージャ。ティッシュペーパーワイプを使用して70%エタノールでゼロデーエッグをきれいにします。次に、OHPマーカー付きの卵に現在の日、日付を書き、摂氏36〜37度の温度と湿度60〜65%の卵インキュベーターに卵を入れます。
次の24時間卵をインキュベートします。2日目。2 日目の要件。プロシージャ。
手術用はさみを70%エタノールで拭くか、オートクレーブを続ける。24時間のインキュベーションの後、卵をインキュベーターから取り出して重ねます。次に、セロテープの小片を卵の端に約1インチの長さと幅に取り付け、鋭利な尖ったエッジハサミを使用して卵殻の端に小さな穴を開け、その後、約75度の角度で5 mLシリンジを挿入します。
卵黄袋に針を挿入した後、ゆっくりとアルブミンの5〜6 mLを引き出します。アルブミンを取り外した後、セロテープで穴を再シールし、次の48時間、37度の摂氏卵インキュベーターに卵を戻します。4日目。
4日目の要件。プロシージャ。リンガーの溶液、0.9%正常生理食塩水、1つのXリン酸緩衝液生理食塩水を、この原稿に記載されている表に従って準備します。その後、3つのソリューションをオートクレーブします。
オートクレーブの後、それぞれの溶液は室温で置かれてもよい。次に、37度の卵インキュベーターから卵を取り出します。シェルを切断する前に、Sellotapeで窓の領域をカバーします。
そして今、卵の殻に小さな穴を作り、円形の開口部を切断し始めます。このプロセスはウィンドウと呼ばれます。卵の位置を胚の位置に合わせて調整する必要があるため、胚が任意の方向から容易にアクセスできるように、円形カットが十分に大きかっていることを確認してください。
さて、ステレオズーム手術顕微鏡を使用して、右のバイタルライン動脈またはRVAを見つける。ここでは、矢印は胚の3日間の発達段階を示す。RVAが配置されると、26 G針を使用して、RVAの左右に2つの小さな穴を作ります。
次に、ドップラー血流イメージングプローブをRVAに調整します。ドップラー血流イメージングプローブは、虚血部位から5プラスマイナス1ミリメートル、RVAの遠位端の3分の2を配置する必要があります。必要に応じて、30秒から2分間のフラックス読み取りを行います。
これはノルモキシア相の読み取りを行います。今手動で手動で歯の鉗子に続く鼻のペンチの助けを借りてフックの形を与えるために脊髄の端を成形します。さて、マイクロマニピュレーターを使用して、右のバイタルライン動脈のすぐ下に脊髄針を挿入する。
あなたは、脊髄針を持ち上げる準備ができています。今、マイクロマニピュレータの助けを借りて、ドップラー血流フラックスが動脈流量の最低80%の減少を示すまで、ゆっくりと動脈を持ち上げる。ドップラーフラックスで80%以上のドロップダウンが達成されたら、脊髄針を上に持ち上げ、動脈を5分間引っ張ります。
これは虚血の期間になります。5分のこの虚血タイミングの後、正常な血流レベルを回復させるためにマイクロマニピュレーターの助けを借りてゆっくりと動脈を解放する。今、ドップラー血流メーターは、ノルモキシア中に観察されたものと同様の測定値を示す必要があります。
これはRVAの再灌流の期間になります。I/Rプロセス後、胚に2滴、3滴の1XPBSを塗布する。最後にセロテープで窓を再シールし、卵を卵インキュベーターに5時間55分間戻します。
5時間55分後、卵インキュベーターから卵を取り出し、卵トレイに置き、窓を開け直します。治療要件。プロシージャ。薬物、活性化剤または阻害剤による動脈の治療のために、RVAはI/ Rプロセスの1時間後に切除されるべきである。
胚をシェルから無菌100 mmペトリ皿に取り出して取り除きます。胚がペトリ皿で放出されたら、ステレオズーム手術顕微鏡の指導に眼虹彩を使用してRVAを切除する。RVA の切除寸法は、トランクから 15 + マイナス 1 ミリメートル、トランクに向かって 2 プラスマイナス 1 ミリメートルにする必要があります。
RVAを切除した後、新しい滅菌ペトリ皿で1X PBSで洗浄します。所望の処置のために、リンガーの溶液の500マイクロリットルで満たされた殺菌された1.5ミリリットル遠心管に動脈を入れる。遠心分離管に動脈を入れた後、37度の摂氏検査室のインキュベーターに5時間入れる。
5時間のインキュベーションの後、37°Cの実験室のインキュベーターからRVAを取り出し、所望の処置のために進む。そして今、結果を提示する。虚血性動脈における虚血再灌流研究におけるモデルの有用性を検証するために、まず酸素調節タンパク質150またはORP150、細胞質スーパーオキシドジスムターゼ1またはSOD1およびカタラーゼの活動を調えた。
I/R処理RVAは、対照群と比較するとORP150、細胞質SOD1およびカタラーゼの活性が増加したが、現在の図で明らかなように、N-アセチル-L-システイン、またはNAC、ROSクエンチャー、I/R群の酸化ストレスの減少を補った。炎症調査のためにこのモデルの有用性を確立するために、I/R処理RVA対対照RVAにおけるI/R-1ベータおよびTNF-αの発現を調べた。インターロイキンはいずれも対照群と比較してフックI/R群で過剰発現していることが判明した。
抗炎症薬であるナリンゲンの補充は、Il1-βとTNF-αのレベルを有意に低下させた。次に、ウェスタンブロッティングを介したNLRP3およびNF-κベータの発現を調べた。この分析は、RVAで産生されたI/Rに応答して、NLRP3インフラマソームの活性化の証拠と、NF-κベータの証拠を発見した。
以前の結果と同様に、ナリンゲンはNLRP3およびNF-κベータの発現を減少させた。これらの結果は、我々のモデルが炎症変化を調査するために使用できることを実証した。次に、アポトーシスおよびオートファジー経路に対するI/Rの効果を検討した。
まず、図Aでは、切断カスパーゼ-3の式にアクセスしました。コントロール群と比較してI/R群における切断カスパーゼ-3の発現が増強され、ZVADFMKを受けているI/R群はカスパーゼ-3の発現の減少を示した。オートファジーの場合も同様に、I/R群はLC3の高いタンパク質レベルを示し、哺乳類細胞におけるオートファジーの主要な調節因子であるオートファゴソームマーカーBeclin-1、およびATG-7は、対照群よりも基底オートファジーに必要なタンパク質であり、オートファジー阻害剤である3-maを受けているグループは、上記の3つのオートファジー阻害剤の発現の減少を示した。 図BからD.までの明らかなように図Eは、アンブラ-1およびATG-7 mRNAレベルに対するフック媒介I/Rの効果を示している。
これらの結果は、以前の結果と一致した、すなわち、I/R処理されたRVAにおけるアンブラ-1およびATG-7に対するmRNA発現の増強が、それぞれの対照と比較して観察された。しかし、I/Rグループに3-maを追加すると結果が逆転した。現在の図は、DNAの変化を研究するためのモデルの有効性を表しています。
コントロール群と比較して、I/R処理群に強いDNA塗抹標本を観察した。しかし、I/R RVAグループへのNACの補充は結果を逆転させた。他のモデルと比べてモデルの効果を調べるには、今回の実験でフックI/RモデルとMCAOモデルで生成したデータを比較しました。
簡単に言えば、アポトーシスタンパク質の発現は、切断カスパーゼ-3、オートファジータンパク質、ベクリン-1およびATG-7、および炎症性インターロイキン、TNFおよびIFNにおいて、コントロールRVAよりも高くなるはずだった。興味深いことに、Hook-I/Rモデルは、炎症性ストレスや細胞死経路の分析であったかどうかにかかわらず、MCAOモデルによって得られたものと非常によく似た結果を得た。我々のモデルは、既存のモデルに単独または平行のいずれかのルーチン虚血再灌流実験に使用することができます。
しかし、虚血再灌流を模倣する際には、RVAの左右の穴を開ける際、また、動脈や静脈を損傷しないようにRVAを閉塞または放出する際に、最も高い予防措置を講じるべきである。ウエスタンブロッティング、QRT-PCR分析装置、化学酸、イメージング技術などの日常的な分子生物学では、3日間で核血症再灌流に関連する病態生理学を関連付けるために即興でひよこ胚を発症する可能性があります。このモデルは、DNA、RNA、タンパク質レベルで分子力学を効率的に研究するために使用できます。
私たちが示したように、ひよこ胚を開発する3日間のI/Rモデリングは、私たちのモデルがI / R研究の分野で新しい道を開くと信じています。この作品で、私はあなたの実験のためにあなたにすべてのベストを願っています。ありがとうございました。
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概要
この研究は、虚血再灌流（I/R）障害の基礎メカニズムと潜在的な介入法を探るために、3日目の鶏の胚を使用した費用効果が高く再現可能なモデルを導入します。
主要な研究構成要素
研究分野
- 虚血再灌流障害
- 鶏の胚モデル
- 脳卒中の病態生理学的メカニズム
背景
- I/R障害を理解することは、効果的な治療法を開発するために重要です。
- 既存のモデルは費用がかかり、時間がかかる可能性があります。
- シンプルで効率的なモデルは研究能力を向上させることができます。
使用された方法
- I/R生成のための改良された脊髄針の利用
- 生物学的システムとしての鶏の胚
- 血流とI/R効果のモニタリングのためのin vivo技術
主要な結果
- 虚血時における血流の著しい減少と再灌流時の回復を実証しました。
- 虚血再灌流障害の研究のためのモデルの有効性を検証しました。
- 動脈組織に対する治療介入のテストの可能性。
結論
- このモデルはI/R障害を効果的に再現し、治療オプションに関する洞察を提供します。
- 心血管研究における鶏の胚モデルの重要性を強調します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The Hook Ischemia-Reperfusion model in a 3-day chick embryo provides a cost-effective, reproducible system for studying I/R injury mechanisms at DNA, RNA, and protein levels. It enables early-stage target validation and mechanistic de-risking by replicating key pathophysiological features observed in mammalian models. This supports predictive confidence in lead identification and preclinical screening for cardiovascular and neuroprotective therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in I/R pathways through quantifiable changes in oxidative stress and inflammatory markers.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by validating target engagement in a living vascular system with real-time blood flow monitoring.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by demonstrating conserved responses to known interventions like N-acetyl-L-cysteine and Naringenin.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantifiable outputs including protein activity assays (ORP150, SOD1, catalase) and gene expression analysis (LC3, Beclin-1, ATG-7).
- Operational Value: Enables assay readiness for high-reproducibility screening of cytoprotective, anti-inflammatory, and autophagy-modulating compounds.
- Scalability: Simple, inexpensive procedure allows parallel testing across multiple embryos for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrates molecular responses analogous to mammalian MCAO models, supporting cross-species extrapolation of I/R mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows investigation of DNA damage, apoptosis (cleaved caspase-3), autophagy flux, and inflammasome activation (NLRP3, NF-kappa beta) in a single integrated workflow.
- Biomarker Alignment: Enables evaluation of translational biomarkers such as ORP150 and cytokine profiles (IL-1 beta, TNF-alpha) for target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing to preclinical validation, enabling seamless transition from mechanistic insight to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through modulation of I/R-induced oxidative and inflammatory cascades.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for compound screening via Doppler flux normalization and biochemical assays.
- Analytics: Generates multi-omic data (DNA smear, RNA expression, protein activity) enabling systems-level analysis of I/R injury and repair.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work by modeling human-relevant I/R responses in a vertebrate embryo system.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective, cardioprotective, and vasculoprotective agents.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling multi-parametric assessment of I/R injury at molecular, cellular, and functional levels.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined ischemia duration (5 minutes), reperfusion window (5h55m), and controlled embryo staging (HH10).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early efficacy signals for cytoprotective and anti-inflammatory interventions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on conserved target modulation across I/R models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, embryo handling, and Doppler flow imaging for precise arterial occlusion.
- Dependent on sterile technique, temperature-controlled incubation (36–37°C), and specialized tools (spinal needle, micro manipulator, stereo microscope).
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, ischemia timing, and tissue excision protocols (RVA length: 15±1 mm distal, 2±1 mm proximal).
- Adaptation considerations include species-specific vascular anatomy and scaling of drug concentrations for ex vivo artery incubation.
- Practical limitations include embryo viability constraints post-I/R and the need for rapid tissue processing to preserve labile biomarkers.
