Name: ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学ぶヒト皮下脂肪組織由来微小血管内皮細胞の分離・培養法と脂肪細胞とのクロストーク解析。糖尿病患者における代謝性疾患の細胞基盤を解明し、心代謝疾患治療標的の探索に貢献する。

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<meta charset="utf8"></head><body>ヒトSATMVECs:単離と脂肪細胞クロストーク研究

<ol><li>Bierhansl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+metabolism+in+endothelial+cell+function+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease.</a> Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).</li>
<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li>
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<li>Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+role+of+the+endothelium+in+metabolic+homeostasis+in+health+and+nutrient+excess%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess.</a> Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).</li>
<li>Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf</a> (2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>170L CO2インキュベータ</td><td>ーGSバイオテック</td><td>170G-014</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG(2-(N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ)-2-デオキシグルコース)</td><td>Invitrogen</td><td>N13195</td><td></td></tr><tr><td>4% PARAFIX緩衝組織学的固定剤</td><td>VWRケミカルズ</td><td>PRC/R/38/1</td><td></td></tr><tr><td>Akt(tAkt)ウサギ&nbsp; 1:1000</td><td>細胞シグナル技術</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm、オレンジ、50個入り</td><td>Medisave</td><td>393230</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin solution、7.5%</td><td>Merck</td><td>A8412-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CD144&nbsp;(VE-Cadherin) 抗体、抗ヒト、PE、REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-495</td><td></td></tr><tr><td>CD31 抗体、抗ヒト、PerCP-Vio 700、REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-811</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit、ヒト、1 kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>CD45 抗体、抗ヒト、FITC、REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-769</td><td></td></tr><tr><td>細胞抽出Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>FNN0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5805000060</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Cell Proliferation Imaging kit</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase, 500 mg</td><td>Roche/Merck</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>354230</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>コーニング 100 mm TC 処理カルチャーディッシュ</td><td>コーニング&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Costar 24ウェルクリアTC処理マルチウェルプレート、個別包装、滅菌</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6ウェルクリアTC処理された複数のウェルプレート、個別に包装された滅菌</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S&ndash; 4レーザーフローサイトメーター</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>死細胞除去キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&プライム;S Phosphate Buffered Saline</td><td>Merck</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Cell Sieve for 50 mL tubes, 70 & micro;m メッシュ、ブルー、滅菌、50/個入り</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地 MV</td><td>PromoCell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ セーフロック マイクロ試験管</td><td>メルク</td><td>EP0030120094</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸溶液</td><td>メルク</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 24 ウェル TC 処理細胞ポリスチレン透過性サポート コンパニオンプレート、蓋付き、滅菌、1 /パック、50 /ケース</td><td>アップルトンウッズ</td><td>CF537</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン透過性サポート 24 ウェルプレート用 0.4 & マイクロ;m 透明 PET メンブレン、滅菌済み、1/パック、48/ケース</td><td>Appleton Woods</td><td>CF521</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Medium Cryo-SFM</td><td>PromoCell</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、2% 水</td><td>Merck</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)、100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570486</td><td></td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Select Enzyme (1x)、フェノールレッドなし</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>12563029</tr><tr><td>ハンクス&プライム;バランス塩溶液</td><td>メルク</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ヒト皮下前脂肪細胞</td><td>ロンザ</td><td>PT-5020</td><td></td></tr><tr><td>インキュサイトズーム</td><td>エッセンバイオサイエンス</td><td></td><td>生細胞分析システム</td></tr><tr><td>インスリン溶液 ヒト</td><td>メルク</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム、25/個入り</td><td>ミルテニー バイオテック</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS マルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS 組織保存ソリューション</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix チューブ ローテーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>チューブ ローテーター</td></tr><tr><td>MS カラム、25/個入り</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4&ndash;12% Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKit Lonza</td><td></td><td>PT-8002</td><td></td></tr><tr><td>Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9570</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Rabbit&nbsp; 1:1000</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>プレセパレーションフィルター30&micro;m, 50/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (PI)/RNase 染色液</td><td>細胞シグナル技術</td><td>4087</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>メス 使い捨て滅菌スタイル 10</td><td>VWRI</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ、15 ml、(Lx&Oslash;): 120 x 17 mm、PP、印刷付き</td><td>Sarstetd</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ、50 ml、(Lx&Oslash;):114 x 28 mm、PP、印刷付き</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ、50 ml、(Lx&Oslash;):114 x 28 mm、PP、印刷付き</td><td>Sarstetd</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Total eNOS Mouse 1:1000</td><td>BD Biosciences</td><td>610297</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100、BioUltra、分子生物学用</td><td>Merck</td><td>93443-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-アクチン(C4)マウス1:5000</td>サンタ<td>クルーズバイオテクノロジー</td><td>&nbsp;SC-47778</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト皮下脂肪組織における脂肪内皮細胞/脂肪細胞クロストークの研究

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

hSATMVECの純度と表現型 対照患者(心血管代謝疾患の既往歴がない人)から単離されたhSATMVECは、フローサイトメトリーで99.5%のCD31+CD144+CD45-でした(図2)。単離されたhSATMVECは、ECに典型的な丸石のような形態をしていました(図3A)。hSATMVECの平均集団倍加時間は56.6時間±8.1時間(平均±SEM、n = 10)であり(図3B)、hSATMVECでの活発なDNA複製は細胞増殖イメージングキットを使用して確認されました(図3C)。
hSATMVECは、機能しているMVECのように振る舞い、マトリゲル島でチューブを形成しました(図3D)。インスリンシグナル伝達Akt-eNOS経路に関与する主要なタンパク質の相対的発現を 図3Eに示します。eNOとAktはどちらも、β-アクチンに正規化されたリン酸化タンパク質/総タンパク質の比率として表されるインスリン誘導リン酸化の増加を示しました(図3E)。
hSATMVEC-脂肪細胞共培養 hSATMVEC-脂肪細胞共培養の実例となるモデルを 図4Aに示します。ヒトの皮下白色前駆脂肪細胞がより分化するにつれて、脂質液胞(図4B)の発達に気付くでしょう。これは、オイルレッドO染色(図4B)によって定量化できます。
図 4Cに示すのは、20μM 2-NBDグルコースと30分間インキュベートした後の分化脂肪細胞の分化した脂肪細胞の位相コントラストおよび蛍光イメージング(励起440-480 nm/蛍光504-544 nm)です。グルコースの取り込みは、全細胞面積に対する緑色の領域の割合を測定することで定量化できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig01v2.jpg"> 図1:hSATMVECの採取と処理を示す概略図 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig02.jpg"> 図2:培養hSATMVECのフローサイトメトリー解析の典型的な出力 (A)特定の細胞集団密度の周りの培養hSATMVECのゲーティング(赤枠)を示す側方散乱領域(SSC-A)と前方散乱領域(FSC-A)の散布図。(B)前方散布幅(FSC-Width)とFSC-Aの散布図(赤枠)は、特定の細胞集団密度の周りの培養hSATMVECのゲーティングを示しています。(C)CD45-FITCに対するゲート細胞の蛍光を示すヒストグラム。(D)CD144-PE(x軸)とCD31-PerCP(y軸)の蛍光強度の散布図。(E)CD144-PEに対する依存性細胞の蛍光を示すヒストグラム。(F)CD31-PerCPに対する依存性細胞の蛍光を示すヒストグラム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig03.jpg"> 図3:hSATMVECの表現型 (A)hSATMVECの合流点付近の光顕微鏡画像で、石畳のような外観を示す。(B) hSATMVEC doubling time - HATECの光学顕微鏡を24時間間隔で撮影し、細胞増殖の程度を実証。(C)hSATMVECの増殖。対照被験者からのヨウ化プロピジウムとEdU / Alexa-fluor 488を使用したhSATMVECの蛍光顕微鏡。(D)対照被験者からのhSATMVECチューブ形成(4倍拡大で撮影された画像)。(E)HATECのインスリン刺激 - リン酸化Akt(セリン473)から総Akt(左パネル)、リン酸化eNOS(セリン1177)から総eNOS(右パネル)への相対的発現を示し、インスリン濃度の増加とB-アクチンに標準化されたウェスタンブロット。データはSEM±平均として表示され、サンプルサイズは各パネルの下にあります。略語:5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)、ヒト皮下脂肪組織微小血管内皮細胞(hSATMVEC)、平均の標準誤差(SEM)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig04.jpg"> 図4:hSATMVEC-脂肪細胞共培養 (A)hSATMVEC-脂肪細胞共培養の模式図。(B)脂肪細胞の分化。左のパネルは0日目のプレアディポサイトを示し、右のパネルはPDMの添加後の10日目の分化した脂肪細胞を示しています。下の図は、オイルレッドO.(C)グルコース取り込みアッセイで染色した脂肪細胞および前駆脂肪細胞に保存された脂質の量を示しています。左のパネルは、20 μM の 2-NBD グルコースと 30 分間共培養およびインキュベーションした後の脂肪細胞の位相イメージングを示しています。右のパネルは、グルコースの取り込み量(全面積の緑の割合)を定量できる緑色のイメージングを示しています。±略語:10日目(D10)、ヒト皮下脂肪組織微小血管内皮細胞(hSATMVEC)、前脂肪細胞分化培地(PDM)この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig04large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:フローサイトメトリーのためのカクテルの染色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

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医学

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ここでは、MCS（Magnetic-Activated Cell Sorting）を用いた脈管内脂肪組織（PVAT）からの脂肪細胞前駆細胞（APC）集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。...

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