Name: 骨組織の空間的トランスクリプトミクスを可能にする方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶ骨組織の脱灰処理によるRNA品質保持法とFFPE切片作成技術。空間的トランスクリプトミクスを用いて骨肉腫の転移メカニズムを解明し、治療標的となる重要遺伝子を同定する方法を紹介します。

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この研究は、Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) と Osteosarcoma Institute (OSI) からの資金提供によって支援されました。

以下に説明するすべての動物手順は、ピッツバーグ大学歯科医学部の実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して承認されています。
1. 脱灰が必要な骨組織サンプルのFFPEブロックの作製方法
<ol><li>試薬および材料の調製<ol><li>EDTA 20% pH 8.0を調製します。1Lの場合、200gのEDTAを800mLの超純水に溶かし、水酸化ナトリウム10NでpHを8.0に調整し、最後に超純水で容量を1Lにします。室温で保存してください。 注:常に新しく調製されたEDTA 20%pH 8.0を使用してください。水酸化ナトリウム(NaOH)10 Nは、400 gのNaOHを1 Lの超純水に溶解することによって調製されます。</li>
		<li>パラホルムアルデヒド(PFA)4%をドラフトで調製し、カルシウムとマグネシウムを含まない1x PBSを使用します。 注:ヒュームフード内の濃縮パラホルムアルデヒド溶液またはパラホルムアルデヒド固形物を扱うための領域を指定し、そのようにラベル付けします。露出を避けるために、コンテナはできるだけ閉じたままにしてください。実施する実験に必要な最小限の実用的な量で使用してください。パラホルムアルデヒド粉末の計量と計量スケールをドラフトで使用できない場合は、まず容器を取り、次にフードとカバーにPFA粉末を追加してから、スケールに戻って粉末を計量します。常に作りたての4%PFAを使用してください。</li>
		<li>各試験片に適した容器を使用してください。 注:たとえば、1 mgの骨組織の場合、少なくとも1 mLの溶液が骨に接触できる容器を使用します。</li>
		<li>解剖に必要なすべての手術器具を滅菌します。</li>
		<li>除染液ですべての領域を清掃し、RNaseを除去します。</li>
		<li>氷の容器、70%エタノールスプレーなどの残りの実験材料を収集し、オービタルシェーカーにアクセスできます。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスからの骨組織サンプルの単離<ol><li>CO2 曝露によってマウスを安楽死させ、次に頸部脱臼を行い、仰向けに置きます。マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーします。</li>
		<li>滅菌解剖ハサミを使用して、皮膚を開き、脚の筋肉を露出させます。脚に沿って筋肉を切って骨の位置をはっきりと見ることができ、骨を軽く離して損傷なく骨を取り除きます。 注:骨に付着しているすべての筋肉を完全に取り除く必要はありません。RNAの分解を制限するために、できるだけ早く行動するようにしてください。</li>
		<li>すぐに骨サンプルを4%PFAを含むチューブに入れ、チューブを氷の上に置きます。</li>
		<li>必要に応じて、手順を繰り返して他の骨サンプルを収集します。</li>
		<li>4% PFAを攪拌したサンプルを、140 rpm、4°Cのオービタルシェーカーに少なくとも24時間置いて、適切に固定します。</li>
	</ol></li>
	<li>骨組織サンプルの脱灰<ol><li>固定後、眼窩シェーカーから骨組織を回収します。</li>
		<li>骨組織を1x PBSで1x PBSで2回、140rpmのオービタルシェーカーで3分間洗浄し、残っているPFAを取り除きます。</li>
		<li>滅菌解剖ハサミを使用して、骨に付着している残りの筋肉をすべて取り除きます。</li>
		<li>骨組織をもう一度1x PBSで3分間洗浄します。</li>
		<li>骨組織を20%EDTAPH8.0の新しい容器に入れます。次に、容器を140rpmのオービタルシェーカーに室温(RT)で30分間置きます。</li>
		<li>溶液を廃棄し、容器に新しい20%EDTA pH 8.0を加え、140rpmのオービタルシェーカーにRTで30分間置きます。</li>
		<li>手順1.3.6を10回繰り返します。</li>
		<li>溶液を廃棄し、容器に新鮮な20%EDTA pH 8.0を加え、140 rpmのオービタルシェーカーの冷蔵室で4°Cに一晩置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>骨組織サンプルの脱水<ol><li>容器から骨組織サンプルを取り出します。</li>
		<li>組織を検査し、骨を静かに回してねじることにより、脱灰の効率を確認します。または、X線装置を使用して骨のX線撮影を行います。 注:試料が簡単に曲がる場合は、良好なグレードの脱灰が達成されています。そうでない場合は、脱灰パラメータ(時間、撹拌速度、20% EDTA pH 8.0の使用量など)を増やす必要があります。</li>
		<li>骨組織を1x PBSで3分間2回洗浄し、EDTAの残留物を取り除きます。</li>
		<li>骨組織を新しい容器に入れ、70%エタノールで脱水を開始します。140rpmで15分間インキュベートします。</li>
		<li>70%エタノール溶液を捨て、サンプルを90%エタノール溶液に入れ、140rpmで15分間インキュベートします。</li>
		<li>90%エタノール溶液を捨て、サンプルを100%エタノールに入れ、140rpmで15分間インキュベートします。</li>
		<li>100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで15分間インキュベートします。</li>
		<li>100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで15分間インキュベートします。</li>
		<li>100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで30分間インキュベートします。</li>
		<li>100%エタノールを捨て、サンプルを新しい100%エタノールに入れ、140rpmで45分間インキュベートします。 注:脱水症は、自動プロセッサを使用して実行することもできます。この場合は、手動脱水で報告されたのと同じ条件でプログラムを設定します。報告されている条件は、厚さが4 mm以下の標本(すなわち、マウスから得られた骨組織サンプル)に関するものである。厚さが4mmを超える試料の場合、脱水のタイミングを実験的に決定する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>骨組織サンプルの清澄化<ol><li>骨組織サンプルを新しい容器に入れ、キシレンを使用してクリアリングプロセスを開始します。140rpmで20分間インキュベートします。</li>
		<li>使用済みのキシレンを廃棄し、新しいキシレンを加え、140rpmでさらに20分間インキュベートします。</li>
		<li>使用済みのキシレンを廃棄し、新しいキシレンを加え、140rpmで45分間インキュベートします。 メモ: クリアは、自動プロセッサを使用して実行することもできます。この場合は、マニュアル消込でレポートされた条件と同じ条件でプログラムを設定します。報告されている条件は、厚さが4 mm以下の標本(すなわち、マウスから得られた骨組織サンプル)に関するものである。4mmより厚い試験片の場合、タイミングを実験的に決定する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>骨組織サンプルの浸潤と埋め込み<ol><li>クリアリング後、オービタルシェーカー/自動処理装置から骨組織サンプルを回収します。</li>
		<li>骨組織サンプルを埋め込みカセットに入れ、ワックスで浸潤を開始します( 材料の表を参照)。60°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>使用済みのワックスを廃棄し、新しいワックスを加えて、60°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>使用済みのワックスを廃棄し、新しいワックスを加え、60°Cで45分間インキュベートします。</li>
		<li>骨組織サンプルを希望の向きの型に慎重に置きます。</li>
		<li>試験片ブロックが冷たい表面で固化するのを待ちます。</li>
		<li>得られたFFPEは、切片化を開始する準備ができるまで4°Cで保存します。 注:FFPEブロックは、セクショニングが行われる前に何年も保管できます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 脱塩されていないFFPEサンプルの切片化に関するガイドライン
注:以下のガイドラインは、特に小さな未脱灰骨標本の場合にRNAの分解を回避しながら、組織切片の品質を大幅に向上させるのに役立つ貴重なヒントと指示を提供します。これらのガイドラインは、利用可能な場合は脱灰した骨標本にも適用できます。より大きな骨組織サンプルの場合、より高品質の切片を得るために脱灰を実施する必要があります。このような場合は、上記の方法に従い、それに応じてパラメータ(タイミング、溶液の量など)を調整する必要があります。以下のガイドラインは、FFPE骨組織がすでに処理されている場合(例:組織バンクや他のラボから採取したFFPEブロック)、または採取した切片を高品質のRNA、高品質の組織切片、またはその両方を必要とするあらゆるタイプの解析に利用する場合に適しています。
<ol><li>機器の準備<ol><li>すべての作業面と器具に除染液をスプレーして、RNaseを除去します。</li>
		<li>二重蒸留水でウォーターバスを準備し、温度を42°Cに設定します。</li>
		<li>ミクロトームブレードを取り、70%エタノールをスプレーして油の残留物を取り除き、次に除染液をスプレーしてRNaseを除去します。</li>
		<li>ブレードをミクロトームに固定します。クリアランス角度が10°に設定されていることを確認します。 注意: セクショニングには、常に新しいブレードを使用してください。</li>
		<li>氷のバケツを2つ用意します。</li>
		<li>ピンセット、ブラシ、プローブを用意し、除染液を噴霧してRNaseを除去し、2つのアイスバケツのいずれかに入れます。</li>
		<li>もう一方のアイスバケツに二重蒸留水を追加して、アイスバスを準備します。 注:FFPEブロックは、追加された水に浮かぶべきではありません。したがって、アイスバケツに加える水の量は、サンプルが浮かずに濡れるのに十分な量でなければなりません。</li>
	</ol></li>
	<li>セクショニング<ol><li>FFPEブロックを4°Cの保管庫から取り出し、ミクロトームに置きます。コマンドを Trimまたは スクロール厚さ14μmに設定し、組織が露出するまでサンプルのトリミングを開始します。 注:FFPEブロックがすでにトリミングされており、組織がすでに露出している場合は、手順2.2.1をスキップします。ブロックに穴や亀裂がないことを確認します。その場合は、手順 2.2.2 に直接進んでください。そうでない場合は、いくつかのセクションを切り取って表面を平らにし、穴や亀裂を避けてから、手順2.2.2に進みます。</li>
		<li>FFPEブロックを氷浴に置き、サンプルを水和させます。水分補給の時間は実験的に決定する必要があります。<ol><li>2分から始めて、水分補給が十分でない場合は時間を増やします。10分を超えないようにしてください。水分補給は組織を拡張し、「ベネチアンブラインド」とラインの形成を減らします。水分補給時間が長くなると、パラフィンブロックに亀裂が生じ、場合によっては組織が剥離する可能性があります。</li>
			<li>サンプルの水和に10分では不十分な場合は、10分以内に水和サイクルを実行し、再度切片化を試みます。</li>
			<li>亀裂や切り傷によりブロックの表面が滑らかできれいでない場合は、サンプルを再埋め込むことを検討してください。RNAの品質は、再埋め込みプロセスによって影響を受けません。</li>
		</ol></li>
		<li>ミクロトームの試料クランプに試料を入れ、ブレードに位置合わせして切片作製を開始します。スクロールの厚さを5μmに設定します。</li>
		<li>切片を採取し、冷たいピンセットとブラシを使用して42°Cのウォーターバスに入れます。 注:あるいは、組織切片のRNA単離を行う場合は、切片を遠心分離チューブに集め、RNA調製の製造仕様に従ってください( 材料の表を参照)。</li>
		<li>切片をウォーターバスでインキュベートして組織を伸ばし、残ったしわやひだを取り除きます。 注:各セクションのウォーターバスに浮かぶ時間は、実験的に決定する必要があります。組織の剥離の問題が発生した場合は、骨切片を1分余分に残すことを検討してください。浮いている時間が長いと組織が損傷する可能性があるため、切片を長時間浮かせたままにしないでください。</li>
		<li>切片をスライドガラスに置き、42°Cで3時間インキュベートします。</li>
		<li>スライドガラスをデシケーターまたはオーブンに室温で一晩置き、適切に乾燥させます。</li>
		<li>RTに取り付けられた部分のあるスライドガラスは、スライドボックスに保管します。 注:スライドはRTで長年保存できます。スライドガラスの代わりに空間的トランスクリプトームを行う場合は、メーカーが提供する空間的遺伝子発現スライドに切片を配置し、報告されている推奨事項に従ってください( 材料の表を参照)。</li>
	</ol></li>
</ol>

RNA完全性を備えた脱灰FFPE骨組織サンプルを調製するためのプロトコル 

<ol><li>Baig, M. A., Bacha, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaig%2C+MA+%22Histology.+Bone%22">Histology. Bone</a>. , StatPearls Publishing. (2024).</li>
<li>Currey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+variation+in+the+mineral+content+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone.</a> J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
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<li>Callis, G. M., Sterchi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+bone%3A+Literature+review+and+practical+study+of+various+decalcifying+agents.+methods%2C+and+their+effects+on+bone+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology.</a> J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).</li>
<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utilization+of+formalin+fixed-paraffin-embedded+specimens+in+high+throughput+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Genomics%22%5BJournal%5D)">The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies.</a> Int J Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
<li>Trinks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+clinically+relevant+features+in+single-cell+RNA+profiles+of+patient-matched+fresh+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Oncol+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue.</a> Cell Oncol (Dordr). , (2024).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single+nucleus+total+RNA+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues+by+snRandom-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq.</a> Nat Commun. 14 (1), 2734(2023).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visium+Spatial+Gene+Expression+Reagent+Kits+for+FFPE+-+User+Guide.%2C+Document+Number+C+CG000407+Rev+C%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C.</a> 10x Genomics. , (2021).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+Space+Ranger+Web+Summary+Files+for+Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE+F+FFPEAssay.%2C+Document+Number+CG000499+Rev+A%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A.</a> 10x Genomics. , (2022).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE-Tissue+Preparation+Guide.%2C+Document+Number+C+G+CG000408+Rev+D%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D.</a> 10x Genomics. , (2022).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

ここでは、脱灰した骨のFFPEブロックを調製し、シーケンシング(すなわち、次世代シーケンシング(NGS))または他のRNA関連技術(すなわち、 in situ ハイブリダイゼーション、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)など)のためにRNAの完全性を保持するための詳細な方法を提供します。
この方法では、EDTAを利用して骨組織サンプルを脱灰します。EDTAインキュベーションにより、サンプルのゆっくりとした細かい脱灰が可能になり、組織の組織学的特徴を最高の状態で維持できます。通常、骨の脱灰は、10% EDTA pH 7.0を使用して、少なくとも2週間、1日おきに溶液をリフレッシュすることにより行われます4。しかし、長時間の脱灰はRNAの分解に大きく寄与します6,7,8。この問題を解決するために、EDTA濃度を20%に増やし、pHを8.0に上げ、溶液交換の頻度を30分ごとに増やしました。これらの条件は、組織がさらされる大量の溶液、激しい攪拌、および高い容器/組織体積比と相まって、脱灰を最大化し、治療時間を短縮し、穏やかでありながら迅速な脱灰を可能にしました。注目すべきは、骨組織サンプルをトランスクリプトームシーケンシングに使用する場合、それらを完全に脱灰する必要がない場合があることに言及することが重要です。この場合、十分な脱灰と良好なRNA保存との間の最適な比率が見出されます。もう一つ重要なことは、サンプルがどのように処理されても、サンプルが固定されていれば、そのRNAは断片化されるということです。ここで報告した方法では、200ヌクレオチド(%DV200)を超えるサイズのRNAフラグメントの保持が可能であり(図2F)、これはRNA品質が高いことを示しています9,11。
この方法には、いくつかの制限があります。まず、骨組織サンプルの供給源はマウスのみであったため、この方法は比較的小さいマウスの骨でのみ検証されています。さらに、この方法は8週齢のマウスでのみテストされているため、8週齢または8週間未満のマウスに使用できるかどうかは不明です。8週齢のマウスを選んだのは、骨格的に成熟しているからです。加齢によって骨のミネラル含有量が変化するため、このアプローチの変更を実装する必要があるかもしれません。
さらに、ガイドラインは、例えば、組織バンクから直接採取される場合など、小さな脱灰されていない骨標本のFFPEサンプルを利用する場合に、組織切片の品質を向上させるのに役立つと報告されています。このような状況では、RNAが分解されても何もできませんが、切片の品質を向上させることができます。一方、ここに示されているようなRNA含量の良いサンプルについては、提供されたガイドラインに従えば、空間的トランスクリプトーム解析が可能です。注目すべきは、原発性骨肉腫標本では、腫瘍塊の存在によって骨構造が変化する可能性があり、実際のサンプルが弱くてもろくなり、切片化が容易になる可能性があります。したがって、Goldnerのトリクローム染色は、この染色技術で鉱化領域と非鉱化領域を識別できるため、これが当てはまるかどうかを評価するために利用されました(図3C)。
結論として、報告された方法は、骨組織サンプルを脱灰し、NGSまたはRNAの完全性を必要とする他の技術に効果的に使用できるFFPE切片を取得するための容易に適用可能な方法を表しています。さらに、パラフィン包埋前に脱灰されていない可能性のあるサンプル(組織バンクから得られたサンプルなど)の切片化に関するガイドラインが提供されています。空間トランスクリプトミクス解析の急速な発展を考えると、提案された方法とガイドラインは、骨研究全般、および骨腫瘍研究にも非常に役立つ可能性があります。

骨は、コラーゲン1型と無機塩1の繊維を主成分とする特殊な結合組織です。その結果、骨は非常に強くて硬いと同時に、軽くて外傷に強いです。骨の大きな強度は、そのミネラル含有量に由来します。実際、ミネラル含有量の割合が増加すると、剛性は5倍に増加します2。その結果、研究者は、組織学的切片化によって骨標本の生物学を分析する際に重大な問題に直面します。
脱灰していない骨組織学は実行可能であり、調査の種類によっては必要になる場合があります(たとえば、骨の微細構造を研究するため)。ただし、特に標本が大きい場合は、非常に困難です。これらの場合、組織学的目的での組織処理には、標準的なプロトコルと技術のいくつかの修正が必要です3。一般に、一般的な組織学的評価を行うために、骨組織は固定直後に脱灰されますが、そのプロセスは、組織のサイズと利用される脱灰剤に応じて、数日から数週間かかる場合があります4。脱灰切片は、骨髄の検査、腫瘍の診断などによく使用されます。脱灰剤には、主に強酸(硝酸、塩酸など)、弱酸(ギ酸など)、キレート剤(エチレンジアミンテトラセト酸(EDTA)など)の3種類があります5。強酸は骨を非常に急速に脱灰することができますが、組織に損傷を与える可能性があります。弱酸は非常に一般的で、診断手順に適しています。キレート剤は、この場合、脱灰プロセスが遅く穏やかであるため、多くの手順( in situ ハイブリダイゼーション、免疫染色など)で必要とされる高品質の形態の保持と遺伝子およびタンパク質情報の保存を可能にするため、研究用途に最も使用され、適切です。しかし、遺伝子発現解析など、トランスクリプトーム全体を保存する必要がある場合、ゆっくりとした穏やかな脱灰であっても、有害となる可能性があります。したがって、組織の形態学的解析を細胞の遺伝子発現解析と組み合わせる必要がある場合には、より優れたアプローチと方法が必要です。
近年のシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)および空間的トランスクリプトミクスの改良により、組織サンプルの保存にホルマリン固定パラフィン包埋法(FFPE)を使用した場合でも、組織サンプルの遺伝子発現を研究することが可能になりました6,7,8。この機会により、世界中の組織バンクに保存されているものなど、より多くのサンプルへのアクセスが可能になりました。scRNA-seqを使用する場合、RNAの完全性が最も重要な要件です。しかし、FFPEサンプルの空間的トランスクリプトミクスの場合、各組織切片の組織学的状況内で遺伝子発現を可視化するためには、高品質の組織切片と高品質のRNAの両方が必要です。これは軟組織では簡単に達成できますが、骨のような硬組織では同じことが言えません。実際、私たちの知る限りでは、空間トランスクリプトミクスを用いた研究は、FFPE骨サンプルに対して行われたことがありません。これは、FFPE骨組織のRNA含有量を維持しながら効果的に処理できるプロトコルがないためです。ここでは、RNAの分解を避けながら、新たに得られた骨組織サンプルを処理および脱灰する方法が最初に提供されます。次に、世界中の組織バンクで収集されたFFPEサンプルのトランスクリプトミクス分析の必要性を認識し、脱灰されていない骨のFFPEサンプルを適切に処理するためのガイドラインも提示されます。

<table><tbody><tr><td>アドバンスドオービタルシェーカー</td><td>VWR</td><td>76683-470</td><td>インキュベーション中に組織を攪拌状態に保つために使用します。</td></tr><tr><td>キャメルヘアブラシ</td><td>テッドペラ</td><td>11859</td><td>ガイドラインで報告されているように、FFPEセクションを処理するために使用します。</td></tr><tr><td>デュアルインデックスキット TS Set A 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000251</td><td>空間トランスクリプトミクスの実行に使用します。</td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>デコン ラボ Inc</td><td>2701</td><td>方法の説明書に記載されているように、組織の脱水を行うために使用します。</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物(EDTA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S312-500</td><td>EDTA 20%pH 8.0の調製に使用します。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド湾曲ミディアムポイント汎用鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-100-110</td>ガイドライン<td>で報告されているFFPEセクションを処理するために使用します。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドファインプレシジョンプローブフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-000-153</td>ガイドライン<td>で報告されているFFPEセクションの取り扱いに使用します。</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>ガイドラインに記載されているように、セクション化されたスクロールを添付するために使用します。</td></tr><tr><td>ハイプロファイルダイヤモンドミクロトームブレードCL</td><td>Sturkey</td><td>D554DD</td><td>ガイドラインに記載されているFFPEブロックの切片に使用します。</td></tr><tr><td>Novaseq 150PE</td><td>Novogene</td><td>N/A</td><td>シーケンサー。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA) 32% 水溶液 EMグレード</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714-S</td><td>1x PBS&nbsp;で最終濃度4%に希釈し、組織固定を行います。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010-049</td><td>すぐに使用できます。PFAを希釈し、分析法の説明書に記載されている洗浄を行うために使用します。</td></tr><tr><td>プレミアティッシュフローティングバス&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A84600061</td><td>ガイドラインで報告されているように、FFPEセクションのしわを取り除くために使用します。</td></tr><tr><td>RNase AWAY 表面除染剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>7002</td><td>メソッドを使用して、メソッドの説明書に記載されているすべての表面を清掃します。</td></tr><tr><td>RNeasy DSP FFPEキット</td><td>Qiagen</td><td>73604</td><td>ガイドラインで報告されているように、FFPE切片が生成されたら、そのRNAを単離するために使用します。</td></tr><tr><td>半自動ロータリーミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>RM2245</td><td>ガイドラインに記載されているFFPEブロックの切片に使用します。</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S8045-500</td><td>ミリQ水1リットルに400gをゆっくりと溶解して10N溶液を調製します。</td></tr><tr><td>Space Ranger</td><td>10X Genomics</td><td>2.0.1</td><td>シーケンシングデータ出力の処理に使用します。</td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>方法の説明書に記載されているように、組織のインプリレーションと埋め込みを行うために使用します。</td></tr><tr><td>Visiumアクセサリーキット</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000194</td><td>空間トランスクリプトーム実験を行うために使用します。</td></tr><tr><td>Visium Human Transcriptome プローブキット 小&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000363</td><td>空間トランスクリプトーム実験を行うために使用します。</td></tr><tr><td>Visium Spatial Gene Expression スライドキット 4 rxns&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000188</td><td>空間トランスクリプトーム実験を行う場合に切片を配置するために使用します。</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>3803665</td><td>メソッドの説明書に記載されている組織の透明化を行うために使用します。</td></tr></tbody></table>

骨組織の空間的トランスクリプトミクスを可能にする方法

Methods to Enable Spatial Transcriptomics of Bone Tissues

細胞と各組織内の細胞の位置との関係を理解することは、正常な発生と疾患の病理に関連する生物学的プロセスを明らかにするために重要です。空間的トランスクリプトミクスは、組織サンプル内のトランスクリプトーム全体の分析を可能にする強力な方法であり、細胞の遺伝子発現と細胞が存在する組織学的状況に関する情報を提供します。この方法は多くの軟組織に広く利用されていますが、骨などの硬組織の分析への応用は困難でした。主な課題は、切片化のために硬組織サンプルを処理しながら、高品質のRNAと組織の形態を保持できないことにあります。したがって、ここでは、新たに得られた骨組織サンプルを処理して空間的トランスクリプトミクスデータを効果的に生成する方法について説明する。この方法により、サンプルの脱灰が可能になり、RNAの分解を回避しながら、形態学的詳細が保存された組織切片が成功裏に得られます。さらに、組織バンクから採取したサンプルなど、以前に脱灰せずにパラフィン包埋したサンプルについて、詳細なガイドラインが提供されています。これらのガイドラインを使用して、骨骨肉腫の原発腫瘍および肺転移の組織バンクサンプルから生成された高品質の空間トランスクリプトミクスデータを示します。

ここで紹介する方法では、新たに分離した骨を処理して、RNAの完全性を維持しながらミクロトームで簡単に切片化できる脱灰FFPEサンプルを取得する方法について説明します(図1)。この方法はマウスの大腿骨に採用され、成功を収めていますが、同様の寸法の他の骨組織サンプルにも適用できますし、すべてのパラメータ(タイミング、溶液の量など)を増やすことで、より大きな骨標本(ヒトサンプルなど)にも適応させることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概略図。 RNAの完全性が保持された脱灰骨組織のFFPEブロックを取得する方法の概略図(ポイント1および2)。FFPEブロックをセクションするためのガイドラインの概略図(ポイント3)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
脱灰の正しいタイミングを検証するために、脱灰していない大腿骨、大腿骨を3時間脱灰(EDTAを30分ごとに合計6回交換)、大腿骨を24時間脱灰(EDTAを30分ごとに合計10回交換し、その後EDTAに一晩放置)を比較する時間経過を実施しました(図2).次に、得られたFFPEブロックを上記のガイドラインに従って切片化し、得られた切片の組織学的品質とRNAの完全性を検証しました。そのために、組織切片の構造的完全性と形態は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色とそれに続く顕微鏡検査(図2A、C、E)によって評価され、RNAの品質は、200ヌクレオチド(200 nt)を超えるサイズのRNAフラグメント分布値(DV200スコアとして知られています)4(図2B、D,F)です。H&amp;E画像は、脱灰されていない大腿骨切片と3時間脱灰した大腿骨切片にいくつかの骨折、穴、および損傷が見られ(図2A、C)、24時間脱灰された大腿骨の切片が良好な組織学的品質を示したことを示しました(図2E)。すべてのサンプルは、scRNA-seqまたは空間的トランスクリプトーム解析を行うための最小値と考えられている50%を超えるDV200スコアを示しました4。EDTAを毎日4°Cで交換し、小さな容器でより穏やかに攪拌することで、より長いインキュベーション時間もテストされましたが、これらの条件を使用すると、サンプルのRNA完全性が劇的に低下するため、推奨されません(図2H)。したがって、インキュベーション時間は24時間に短縮され、脱灰の頻度、攪拌、および量が増加して脱灰が促進されました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig02.jpg"> 図 2.脱灰後の8週齢マウス大腿骨の切片およびRNA完全性品質管理(QC)。&amp;E染色によって行い&amp;E染色&amp;E染色&amp;E染色&amp;E染色&amp;E<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig02large.jpg" target="_blank"></a>&amp;Eで染色<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig03.jpg"> &amp;E染色<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig03large.jpg" target="_blank"></a>

ここでは、新たに得られた骨組織の脱灰と高品質なRNAの保存を可能にする方法について述べます。また、脱灰されていない骨のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルを切片化して、新鮮な組織が利用できない、または採取できない場合に高品質の結果を得る方法も示されています。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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