Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Sarah R. Amend; Kenneth C. Valkenburg; Kenneth J. Pienta

doi:10.3791/53936

JoVE Journal
Immunology and Infection

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JoVE Journal Immunology and Infection

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

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April 14, 2016

DOI: 10.3791/53936-v

Sarah R. Amend¹, Kenneth C. Valkenburg¹, Kenneth J. Pienta¹

¹Department of Urology,Johns Hopkins University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a protocol for the dissection of hind limb long bones from laboratory mice and a rapid technique for bone marrow isolation using centrifugation. The method aims to facilitate downstream analyses related to bone marrow biology and immunology.

Key Study Components

Area of Science

Bone marrow biology
Cancer metastasis
Immunology

Background

The dissection of long bones is crucial for studying bone-related diseases.
Bone marrow isolation is essential for various cellular analyses.
Standardized techniques improve reproducibility in research.
Quick procedures save time in experimental workflows.

Purpose of Study

To provide a systematic approach for long bone dissection.
To enable efficient bone marrow collection for analysis.
To maintain the integrity of bone and marrow for downstream applications.

Methods Used

Positioning the mouse and preparing for dissection.
Step-by-step dissection of femur and tibia.
Isolation of bone marrow using centrifugation.
Visual verification of marrow extraction.

Main Results

The technique can be completed in about seven minutes.
Bone marrow integrity is preserved for histological analysis.
Suitable for various downstream applications, including cell culture.
Standardized parameters allow for accurate quantitation in research.

Conclusions

This rapid dissection and isolation technique is effective and efficient.
It supports further studies on bone marrow cell populations.
Mastery of the technique enhances research capabilities in related fields.

Frequently Asked Questions

What is the main advantage of this dissection technique?

The main advantage is its speed and standardization, allowing for quick and reproducible results.

How long does the procedure take?

The entire procedure can be completed in about seven minutes when performed correctly.

What applications can the isolated bone marrow be used for?

The isolated bone marrow is suitable for various analyses, including histomorphometry and cell culture.

Is the procedure sterile?

Yes, the bone marrow isolation procedure is designed to be fairly sterile.

What should be done if the tibial epiphysis is intact?

If the tibial epiphysis is intact, scissors should be guided up the tibia shaft to remove the condyles and epiphysis.

Can this technique be used for other types of analyses?

Yes, after isolation, other methods like FACS can be performed to study bone marrow cell populations.

ここでは、実験用マウスから後肢の長骨(大腿骨と脛骨)を解剖するためのプロトコルを提示します。さらに、骨髄空間から骨髄を除去するために遠心分離を利用する、これらの骨からの骨髄分離のための迅速な技術について説明します。

この長骨解剖および骨髄分離手順の全体的な目標は、長骨を迅速かつ体系的に除去し、骨髄を採取してさらに下流の分析を行うことです。この方法は、骨髄生物学、がん転移、免疫学に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、解剖プロセスが迅速かつ標準化されていること、骨髄分離手順がかなり無菌であること、マウスを仰臥位に配置することから始めることです。

次に、足首関節の下に4つの足パッドをすべて固定し、マウスに70%エタノールをスプレーし、脚を完全に浸します。次に、股関節のすぐ上の下腹部の正中線の右側に小さな切開を行い、切開部を脚の下まで延長して足首の関節を過ぎます。皮膚を引き戻します。

次に、大腿骨の近位端に固定されている大腿四頭筋を切断して大腿骨の前面を露出させ、ボードから45度の角度でピンで脚から筋肉をピンで固定します。はさみを大腿骨の後側に当てて、ハムストリングスを膝関節から切り取ります。次に、大腿骨の近位端に固定されている皮膚とハムストリングの筋肉を引き戻して骨の後側を露出させ、ハムストリングの筋肉を脚からピンで固定し、ピンを45度の角度で配置します。

鉗子で、膝関節のすぐ上の大腿骨の遠位端をつかみます。次に、大腿骨シャフトの両側にあるシザーブレードを股関節に導きます。大腿骨頭に到達した後、はさみをひねり、トップブレードを大腿骨頭の真上に動かして大腿骨を脱臼させます。

次に、鉗子で大腿骨シャフトの上部をつかみ、軟組織を大腿骨頭から切り離して、大腿骨を寛骨臼から解放します。次に、大腿骨、膝、脛骨を含む脚の骨全体を上に引っ張って体から離し、脚を皮膚に付着させている結合組織と筋肉を慎重に切り取ります。結合組織をすべて取り除いたら、足首の関節を過度に伸ばし、ささみをひねって脛骨を脱臼させます。

脛骨の遠位端をつかみ、腱を切断しないように注意しながら、脛骨を引き上げ、体とピンボードから離します。次に、膝の長骨に付着している残りの結合組織と、大腿骨と脛骨に付着している追加の筋肉または結合組織をすべて取り除きます。骨髄分離のために長骨を準備するには、膝蓋骨を反対側に向け、大腿骨頭を下に向けて大腿骨をつかみます。

膝関節を過度に伸ばし、はさみをひねって脛骨を大腿骨から脱臼させます。次に、大腿骨と脛骨を一緒に保持している結合組織をすべて取り除きます。次に、大腿骨の前面を背にして大腿骨頭を下に向けて掴み、ハサミで大腿骨軸を顆まで誘導します。

はさみを前後にゆっくりと回転させて、顆、膝蓋骨、骨端を取り除き、骨端を露出させます。次に、鉗子、はさみ、キムワイプを使用して、大腿骨に付着している追加の筋肉または結合組織を取り除きます。次に、脛骨の前面を反対側に向け、足首の端を下に向けてつかみます。

脛骨骨端が損傷していない場合は、ハサミを脛骨シャフトから顆に導き、ハサミを前後にゆっくりと回転させて顆と骨端を取り除き、脛骨骨幹端を露出させます。次に、先ほど示したように、脛骨に付着している追加の筋肉または結合組織をすべて取り除きます。骨髄を採取するには、まず18ゲージの針を0.5ミリリットルの微量遠心チューブの底に押し込みます。

次に、長骨をチューブに入れ、膝の端を下にして蓋を閉めます。0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れ子にし、チューブを10,000倍以上のgでマイクロ遠心分離機で15秒間遠心分離します。骨髄が骨からスピンアウトしたことを目視検査で確認します。

骨は白く見え、大きなチューブに大きなペレットが見えるはずです。次に、0.5ミリリットルの微量遠心チューブに骨を捨て、骨髄を適切な溶液に懸濁して、目的の下流分析を行います。この迅速な解剖技術は、組織形態測定法や組織学など、多くのダウンストリーム分析に適しています。

実際、この代表的な組織形態組織測定マイクロCT 3D再構成で実証されたように、海綿骨と皮質殻の両方が維持されるため、骨組織形態測定の標準化された構造パラメータを正確に定量化できます。HおよびE染色された形式的および固定および脱灰した脛骨のこの代表的な組織学的切片では、組織学的分析のための石灰化した骨と細胞骨髄の両方の完全性の維持を観察することができます。さらに、この手順によって単離された骨髄は、破骨細胞または骨芽細胞の初代細胞培養を含む多くの下流アプリケーションに適しています。

一度習得すれば、長骨の解剖から骨髄の分離まで、適切に行えば、約7分で技術を完了することができます。手順を試みている間は、解剖を容易にするためにマウスの位置を忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、FACSや他のシングルセルプロセスなどの他の方法を実行して、骨髄細胞集団の変化に関する追加の質問に答えることができます。

このビデオを見た後、マウスの長骨をすばやく解剖する方法と、遠心分離によって骨髄を分離する方法をよく理解しているはずです。