R、Seurat、CellChatを使用してマウスの皮膚創傷治癒の単一細胞トランスクリプトミクスデータセットを解析

私たちの研究室では、システム生物学やバイオインフォマティクスのアプローチを備えた単一細胞および空間トランスクリプトミクスなどの新しいツールを使用して、異なる治癒結果の空間時間的細胞ダイナミクスを調査しています。近年、ヒトやマウスなどのモデル生物の創傷治癒の研究に単一細胞トランスクリプトミクスが急速に採用されています。単一細胞データセットの完全な分析は、バイオインフォマティクスの経験がほとんどまたはまったくないベンチサイエンティストにとっては法外なことです。これは、創傷治癒の分野の科学者によって単一細胞データセットが十分に活用されていないことがあまりにも多いことを意味します。これは、バイオインフォマティクスの経験がないことを前提とした最初の包括的なプロトコルであり、ユーザーはデータセットのダウンロードから創傷治癒研究の文脈での関連分析の出力までずっと行います。私たちのプロトコルは、創傷治癒研究者が独自の単一細胞データセットをより完全に分析し、公開されているデータセットから新しい洞察を抽出できるようにするためのテンプレートとして機能する必要があります。

[シャリン]まず、アクセッション番号GSE204777を使用して、遺伝子発現オムニバスリポジトリからデータセットファイルに移動します。GSM6190913 というタイトルの最初のデータセットをクリックします。GSM6190913ページの一番下までスクロールし、FTPまたはHTMLリンクを使用してリストされている3つのファイルをダウンロードします。コンピュータのファイル エクスプローラーを使用して、ダウンロードしたファイルを b1 という名前のディレクトリに移動し、作業ディレクトリ内にあることを確認します。ダウンロードされた単一セル・シーケンス・ファイルのディレクトリ・パス情報を取得します。次に、シングルセルシーケンシングファイルを作業環境にロードします。次に、遺伝子発現と多重化HTOデータを作業データセットから分離します。遺伝子発現データを使用して、5 つ未満の細胞で検出された遺伝子と 200 未満の遺伝子を持つ細胞を除外しながら、Seurat オブジェクトを作成します。HTOデータがないデータセットの場合は、同じフィルタリングパラメータでSeuratオブジェクトを作成し、遺伝子発現アッセイに切り替えます。各細胞のミトコンドリア遺伝子の割合を計算し、この値をメタデータ変数として割り当てます。すべての細胞にわたる遺伝子数、総RNA、およびミトコンドリア遺伝子の割合の分布を視覚化します。ミトコンドリア含有量が25%を超える細胞を閾値を使用して除去し、これらの低品質の細胞を除外した後、更新された分布を視覚化します。SCダブレットファインダー法を使用して、ダブレットの可能性を検出します。コマンドを使用して SC ダブレット ファインダー パイプラインを実行し、結果のダブレット スコアを新しいメタデータ変数として割り当てます。次に、すべてのセルにわたるダブレットスコアの分布を視覚化します。ダブレットスコアが0.25を超えるすべてのセルを削除し、クリーンアップされたSeuratオブジェクトをRDSファイルとして作業ディレクトリに保存します。データの正規化、スケーリング、および主成分分析を実行します。最初の 50 個の主要成分にわたる分散の寄与を視覚化します。最初の13の主成分と0.1のクラスタリング分解能を使用してセルをクラスタリングします。最初の 13 個の主成分を使用して、一様多様体の近似と射影、または近傍解析の UMAP 削減を実行し、シード番号を 123 に設定します。次に、UMAP プロットで細胞クラスタリングを視覚化し、続いて UMAP プロットで傷ついた時間と空間の注釈を視覚化します。次に、セルクラスターを巻いた時間と空間の注釈に関連付けるテーブルを生成します。すべてのクラスター間で差次的に発現する遺伝子を計算した後、主要な細胞型の同一性を決定し、結果のDEGリストを変数に割り当ててから、作業ディレクトリに区切り文字で区切られたテキストファイルとして保存します。次に、スプレッドシート アプリケーションでデータセット クラスター マーカー ファイルを開きます。テキストインポートウィザードを使用して、カンマを区切り文字として設定し、遺伝子名列をテキストとしてフォーマットして、遺伝子名が日付に自動的に変換されないようにします。スプレッドシートで、平均ログ 2 の FC 列を最大から最小にランク付けして、対数の 2 倍の変化値を減らして行を並べ替え、次にクラスター列を最小から最大に順に並べます。Seurat クラスター番号を増やして行を並べ替えるには、平均ログ 2 の FC 列をフィルター処理して 2.5 以上の値のみを含め、次に PCT 1 列をフィルター処理して 0.4 以上の値を含めます。次に、PCT 2列をフィルタリングして、0.2以下の値を含めます。最後に、P 値調整列をフィルタリングして、0.01 以下の値を含めます。次に、Enrichr Web ベースのエンリッチメント分析ツールを開きます。クラスターごとに、差次発現遺伝子のリストを別のエンリッチーウィンドウにコピーし、[分析]をクリックします。次に、分析出力の上にある「セル・タイプ」タブをクリックし、キュレーションされた 3 つのセル・マーカー・データベース内の上位 5 つのエンリッチメントに焦点を合わせます。エンリッチ分析の上位エンリッチメントに基づいて、考えられる ID を 8 つのクラスターに割り当てます。クラスター 2 と 6 を 1 つのアノテーションに結合し、線維芽細胞とラベル付けされ、これらのアノテーションを cell types という名前の新しいメタデータ変数として割り当てます。 次に、注釈付きの細胞型をUMAPプロットで視覚化し、太字で表示された上部クラスターマーカー遺伝子の局在を一連のUMAPプロットに表示します。元のクラスター番号でグループ化されたドットプロットで上位のクラスターマーカーが差次的に発現した遺伝子を視覚化し、次に上位のマーカー遺伝子をドットプロットで再び視覚化し、今回は注釈付きの細胞型でグループ化します。時系列解析の準備をするには、空間アノテーションを削除し、データセットを簡略化します。創傷の時間と空間のメタデータを、損傷後の日数のDPWという新しい変数に再割り当てします。UMAP プロットで新しい DPW タイム コース グループを視覚化し、各 DPW グループ内の各タイプのセル数を示すテーブルを生成します。次に、細胞数を比率に変換して、治癒中の細胞型組成の相対的な変化を評価し、各細胞型内の各DPWカテゴリの割合を視覚化します。最後に、各DPWグループ内の各セルタイプの割合を視覚化し、すべての注釈とフィルターを含む最終的なSeuratオブジェクトをRDSファイルとして作業ディレクトリに保存します。データセット内のすべてのセルは、UMAP プロット上で主要な色分けされた細胞型に明確にクラスター化され、強化された細胞型シグネチャに基づいて注釈が成功したことを確認しました。トップクラスターマーカー遺伝子の高発現は、UMAPプロット上のそれぞれの細胞型クラスター内に局在していました。ドットプロットの視覚化により、クラスターマーカー遺伝子の最高発現レベルが注釈付きの主要細胞型に限定されていることが確認されました。積み上げ棒プロットは、創傷後1日目に好中球とマクロファージが優勢であるのに対し、線維芽細胞、上皮細胞、および内皮細胞が後の時点でより普及し、創傷治癒の既知の細胞カスケードを反映していることを明らかにしました。