Name: 哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぼう 液滴バーコードベースの単一細胞RNAシーケンス法を用いた哺乳類組織のトランスクリプトーム解析。皮膚や神経組織から高生存率の単一細胞を分離し、細胞集団の機能的動態を解明する包括的なプロトコルです。

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我々 はカルガリーの大学で動物実験施設スタッフだけでなく、UCDNA サービス施設でのサポート スタッフを認めます。バイオインフォマティクスの彼のサポートのためのマットの Workentine と彼のテクニカル サポートのイェンス Durruthy に感謝しますこの作品はバトンとアルバータ子供の健康研究所フェローシップ (バッハ) 機構の新しい賞機構助成金 (r. m. と j. b.) によって資金を供給します。

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</ol>

このプロトコルは、どのように単一細胞の適切な準備できる単一細胞の何千もの転写の不均一性を明らかにし、差別の機能の状態や、組織内で一意の携帯 id を示します。プロトコル蛍光レポーター蛋白質や遺伝子組換えのツールは必要ありませんし、人間からのそれらを含むさまざまな組織の単一細胞の分離に適用できます。各組織を念頭、ユニークで、このプロトコルの調整/修正の程度が必要になります。
細胞内の多様な非常にダイナミックな転写プログラムは、ゲノムの単一セルの値を強調しています。別に高品質の RNA を隔離する、質の高いデータセットに必要な重要な試料前処理は確実に細胞が組織から完全に解放されるおよび細胞、健康かつそのままであります。これは容易に細胞を収集公開、循環細胞など、細胞の保持は、組織でリンパ組織などでは比較的まっすぐ進む。しかし、これは大規模な距離、周辺の細胞外マトリックスと細胞構造を維持することに関与する多くの場合堅い細胞骨格タンパク質にまたがる高度細胞アーキテクチャのための他の成体組織のために挑戦することができます。セルの完全なリリースの技法の適切な解離とも必要な厳格なと多くの場合時間のかかる処理が mRNA の品質とセルの整合性を変更可能性があります。さらに、酵素による分解に使用される高温転写署名29,30にも影響します。プロトコルの目的は、品質管理にチェック、最適化はこれらの障害を克服するために助けることができる方法を実証する有髄の大人の神経や細胞外マトリックスの豊富な大人の皮膚などの組織を使用です。
ScRNA Seq 実験を設計する際の主要な考慮事項は、シーケンスの深さの選択です。シーケンスを高度に多重化して読み取ることがされて非常に低いドロップ Seq2最大 500 万読み取り/セル14スマート シーケンスなどフルレングス RNA シーケンスのメソッドを使用してを使用してから深さがありますほとんどの scRNA Seq 実験は、細胞型分類41,42通常十分であるシーケンス 10,000 読み取り/セル、低中程度の高式成績証明書を検出できます。浅いシーケンスの深さは、細胞の何千も特殊な集団のせいにする自信を持ってする必要があります複雑な組織で、稀な細胞集団を検出しようとしたときに、シーケンシング コストを保存する値のことです。しかし、遺伝子発現と微妙な転写署名に関連付けられたプロセスに関する詳細な情報が必要な場合、浅い深さシーケンスが不十分。現在、500,000 の読み取り/セルでセルに遺伝子の大多数が検出されたが、プロトコルによって異なりますが、組織型43,44と推定されます。フルレングスのトラン スクリプトのシーケンスがアセンブリの必要性を回避、小説や珍しいスプライスバリアントを検出できます、したがって、シーケンス コストは多くの場合複雑な組織システムを構成する細胞の数を調べて、このようなアプローチをスケーリングを制限します。対照的に、3' タグ付きの単一セル ライブラリ通常このプロトコルで記述されているものより低い複雑さと浅くシーケンスを必要とします。5 つのサポートされているシーケンサーの 1 つで説明されているプロトコルを使用して生成されたライブラリをシーケンス処理できることに注意してくださいすることが重要です: NovaSeq 1)、2) HiSeq 3000/4000、3) HiSeq 2500 急速な実行と高出力、4) NextSeq 500/550、MiSeq 5)。
繊細な組織とまだ処理セルの必要性を削減する単一細胞 RNA シーケンスへの代替アプローチは単一細胞 RNA シーケンスの利点のいくつかを維持、単一核45から RNA の解析です。このアプローチは、RNA の劣化と核の適切なリリースを確保するためより多くの極端な措置の削減より迅速な処理を可能に、したがって可能性が高い特定の組織内のすべてのセルを表す転写プロファイルのもっと自信を持って捕獲のためことができます。もちろん、転写活性の実験的な目的がこのアプローチ可能性がありますまたは適さない場合があります興味あるものによって従って特定のセル内の一部のみ提供だろう、これ。
特定組織内の細胞のアイデンティティの完全な特性評価、ほか scRNA Seq データセットの最も貴重な分析の 1 つは '定義' 細胞集団間で中間転写状態の評価です。これらの中間の状態は、伝統的な一括 RNA シーケンスのアプローチでは不可能でした特定の集団内のセル間の系列リレーションシップへの洞察力を伝えることができます。これを明らかにするいくつかの scRNA Seq bioinformatic ツールを開発されている今。このようなツールは、たとえば、がん細胞の多様な端末の運命や、静止状態との間の往復の免疫細胞に成熟幹細胞の発癌性/転移状態に移行に関与するプロセスを評価できます。細胞のトランスクリプトームの微妙な違いは、FateID のような最近開発された bioinformatic ツールが47を推論できること、血統バイアスを示す場合もあります。移行細胞の区別が難しいことができますので微妙かもしれない特定の転写の違いを確認するため、深いシーケンスが必要な46あります。幸いなことに、別のフロー ・ セルでライブラリを再実行してさらにデータセットを調査に興味がある場合、浅くシーケンスされたライブラリをカバーは増やすことができます。
一緒に取られて、このプロトコルは、発現プロファイルの 1 つの実験内の単一セルの何千もの何百もすることができます簡単に適応するためのワークフローを提供します。ScRNA Seq データセットの最終的な品質は、最適化された細胞の隔離、フローサイトメトリー、cDNA ライブラリを生成、および生遺伝子バーコード行列の解釈に依存しています。この目的のためには、このプロトコルは、多様な組織の種類の研究を有効にする簡単に変更することができますすべての重要なステップの包括的な概観を提供します。

高スループット単一のセル技術1,2の最後の十年3以上のユーザーフレンドリーなバイオインフォマティクス ツールの進歩発展に伴い、高解像度遺伝子発現解析の新しい分野を浮上している-単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA)。単一細胞の遺伝子発現の研究を幹細胞やがん細胞のように定義された細胞集団内の不均一性を識別するためにまたは使用不可能であったセル4、5、特殊な集団を識別するために最初に開発されました従来のばら積み RNA の配列解析技術。Bioinformatic ツールが新規のサブ集団 (スーラ)2, psuedotime スペース (モノクル)6、アクティブのシグナリング ネットワーク内または集団 (間の定義に沿って細胞の可視化の識別を有効にしています。風光明媚な)7、人工 3 D 空間 (スーラなど) の単一セルのアセンブリの予測8。新しくて刺激的な分析科学のコミュニティに利用可能、scRNA Seq は高速-なっている遺伝子発現解析のための新しい標準的なアプローチ。
ScRNA Seq の広大な潜在性にもかかわらずきれいなデータセットを生成し、結果を正確に解釈するために必要な技術的なスキルセットは新人に挑戦することができます。ここでは、基本的なしかし、包括的なプロトコル、可視化する全体主組織から単一セルの隔離およびパブリケーションのデータの提示から始まってされます (図 1)。まず、健康な単一細胞の分離とみなすことが困難な酵素消化とその後の機械的解離に対する感度の度合いで変わるさまざまな組織として。このプロトコルは分離手順のガイダンスを提供し、プロセス全体を通して品質管理の重要なチェックポイントを識別します。第二に、互換性および単一のセル技術と次世代シーケンサーと要件を理解することは混乱することができます。このプロトコルは、ユーザーフレンドリーな液滴を用いた単一細胞のバーコード プラットフォームを実装して、シーケンス処理の実行するためのガイドラインを提供します。最後に、コンピュータ ・ プログラミングは単一細胞トランスクリプトームのデータセットを分析するための重要な前提条件です。このプロトコルは、R のプログラミング言語を使うにあたってのリソースを提供し、2 つの人気 scRNA-Seq 固有の R パッケージの実装について説明します。一緒に、このプロトコルは、分析 scRNA Seq クリア、解釈の結果を取得するために初心者を導くことができます。このプロトコルはマウスのほとんどの組織に調整することができます、重要なの組織の人間を含む他の有機体で使用するために変更することが。組織とユーザーに応じて調整が必要になります。
この議定書に従いながら、留意すべきいくつかの考慮事項があります。正確な合計のセル番号のカウント (図 2 に要約を確保しながら興味のサンプル内のすべてのセルの実行可能な単一細胞懸濁液を確実に推奨は 1) 手順 1 ですべての品質管理の指針とこのプロトコルの 2 次など).これが実現すると、最適化のすべての条件に従っている場合品質管理手順で削除できます (に短縮 - RNA の品質を維持し、細胞の損失)。確認する興味の組織から高い生存率単一細胞の分離を成功させる高い下流より前に、お勧め処理しています。2) ある細胞のタイプはストレスを他の人よりも敏感なので、過剰解離手法が人口、したがって下流解析を交絡バイアスは誤って。不要な携帯電話せんと消化せず穏やかな解離が高利回り細胞および組織組成の正確な表現を実現するため重要です。巻き上がり、FACS 製粉段階でせん断力が発生します。3) として任意の RNA の作品とはそれの準備中にできるだけサンプルに少し追加 RNase として取り入れるが最善。高品質の RNA を維持に役立ちます。リボヌクレアーゼ阻害剤のソリューションを使用しクリーン ツールとではない機器を洗浄 RNase フリーが、DEPC 処理製品を避けてください。4) できるだけ早く準備を実行します。これは高品質の RNA を維持し、細胞死を削減を助けます。組織郭清の長さと動物の数、に応じて、同時に複数の解剖/準備を開始を検討します。5) 高品質 RNA を維持、細胞死を軽減し低速可能な細胞シグナル伝達と転写活性とき氷の上のセルを準備します。とはいえ、冷たい処理は、ほとんどの種類の細胞に最適です、室温で処理されるときは、ある細胞のタイプ (例えば、好中球) の方がパフォーマンスが向上します。6) セルの準備中にカルシウム、マグネシウム、EDTA、DEPC 処理製品を避けてください。

<table><tbody><tr><td>Products</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse out</td><td>Biosciences</td><td>786-70</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital ナトリウム</td><td>ユータニル</td><td></td><td>50mg/kg</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 5U/ml</td><td>StemCell Technologies</td><td>7913</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ-4 125 CDU/mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td>10mg/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>15 ml ナローボトムチューブ VWR&reg;高性能遠心分離管</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Orange Viability Dye</td><td>Molecular Probes</td><td>11320972</td><td>1.3 nM/&micro;l</td></tr><tr><td>Nuc Blue Live ReadyProbes</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer 高感度DNA試薬</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Kapa DNA定量キット</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4844</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' Reagents</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザープラットフォーム</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina&reg;HiSeq 4000</td><td>イルミナ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イルミナ&reg;MiSeq SR50</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X コントローラー + アクセサリー</td><td>10x Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Cell Ranger</td><td>10x GENOMICS support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loupe Cell Browser</td><td>10x GENOMICS</td><td></td><td></td>support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest</tr><tr><td>R</td><td></td><td>https://anaconda.org/r/r</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

組織や微小環境の内で個々 の細胞の何千もの単一細胞遺伝子発現の解析は識別の細胞組成、機能状態と分子経路観測組織の差別のための貴重なツール関数は、動物の行動。ただし、以降の下流の単一細胞分子解析成体哺乳類組織からそのままに、健康的な単一セルの隔離は挑戦することができます。このプロトコルは、一般的なプロセスを説明し、品質管理は神経系から高品質大人の単一細胞製剤を入手するか、皮膚に必要な有効その後公平な単一細胞 RNA シーケンスと解析をチェックします。下流のバイオ情報解析のためのガイドラインも提供されます。

ScRNA Seq のデータセットを分析するために設計されたオープン ソース パッケージのレパートリーは40 R ベースの言語3使用のこれらのパッケージの多数で劇的に増加しています。ここでは、これらのパッケージの 2 つを使用して代表的な結果が表示されます: の教師のグループを評価する単一の遺伝子発現に基づくセルとセルの不均一性を解決するために軌道に沿って単一セルを順序し生物を分解処理します。
図 4は、スーラの処理前の品質チェックおよび下流のバイオインフォマティクス解析の使用法を示します。まず、分析から逸脱した細胞をろ過して除去は、品質チェックは欠かせません。これは、ミトコンドリア遺伝子、遺伝子 (nGene) の数と海 (nUMI) 細胞ダブレットと外れ値を特定の数の割合を可視化する (図 4 b) をプロット ヴァイオリン (図 4 a) と散布図を使用します。明確な外れ値数の遺伝子、海、またはミトコンドリア遺伝子の割合で任意のセルは、スーラの FilterCells 関数を使用して削除されました。スーラは、主成分 (PC) を使用するので、クラスター細胞、統計的に有意な Pc を含めることを決定する分析スコアは重要なステップです。肘プロット (図 4 c) は、PC の選択、' PC の標準偏差」の高原を越えて Pc で軸が除外されたため使用されました。クラスタ リングの解像度は 4 (高解像度高い細胞塊、図 4e につながるに 0.4 (低解像度が少ない細胞塊、図 4 dにつながる) に至る、クラスター数することができます変更することを示すことを操作しても).低解像度、高解像度でまたサブタイプまたはセル人口の過渡的状態を表す場合がありますこれに対し各クラスターが定義済みのセルの種類を表す可能性が高いです。このインスタンスで低解像度のクラスターの設定は特定のクラスター (図 4 階) で最も高い発現遺伝子を識別する (スーラの DoHeatmap 関数を使用して) 式ヒートマップなどをさらに分析するために使用されました。このインスタンスで最も高い発現遺伝子を各クラスターが定義された遺伝子で一意に表されたことを示す、他のすべてのクラスターとクラスターの差分式を評価することによって同定しました。さらに、スーラの FeaturePlot 関数 (図 4 g) を使用して恒常的なプロットで個々 の候補者の遺伝子を視覚化できます。これにより解読するマクロファージを表すクラスターがあったかどうか。FeaturePlot を使用すると、両方クラスター 2 であることがわかった 4 Cd68 - パン ・ マクロファージ マーカーを表現していたと。
モノクル パッケージ、スーラで識別される細胞塊を裏付けに使用されたセル軌道や pseudotemporal の順序を構築するため生物学的プロセス (図 5) を要約します。Pseudotemporal 注文使用できますのサンプル コースを時間生物学的単一細胞発現されます。セルは中間の状態、2 つの代替セル運命の分岐ポイントを解決する pseudotemporal 連続体に沿って注文することができます、各運命の取得の基礎となる遺伝子の署名を識別します。まずスーラのろ過と同様、すべてのセルの mRNA の分布は通常、図 5 aで指定された上限と下限の間落ちたログするように質の悪い細胞が削除されました。モノクルの newCellTypeHierarchy 関数を使用して、単一のセル分類されたし、知られている系統マーカー遺伝子 (図 5 b、 5 c) を使用してカウントします。たとえば、PDGF の受容器のアルファや線維芽細胞特定蛋白質 1 を発現する細胞は、線維芽細胞を定義するための条件を作成する細胞の種類 #1 に割り当てられました。次に、この人口 (携帯型 #1) が評価され、線維芽細胞の軌跡を解読します。これを行うは、集団内で極端な状態を表すセルを比較し、(図 5 d) 人口の残りのセルの順序の差動遺伝子を発見、モノクルの差分 GeneTest 関数が利用されました。多様体学習法 (非線形次元削減の種類) を適用するとすべてのセルの間で、pseudotemporal のパスに沿った座標が割り当てられていた。この軌道は、セル状態 (図 5e) と pseudotime (図 5 階) で可視化しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig1v3.jpg"> 図 1: フローチャート。全体の動物の準備から単一の分析へのステップは細胞 RNA Seq データセットの公開リポジトリへのデータセットの最後の送信です。ゲルビーズ エマルジョン (宝石) では数千の単一のセルをカプセル化するバーコード オリゴヌクレオチドとビーズを参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig2v3.jpg"> 図 2: 神経組織から実行可能な単一細胞懸濁液を作成します。(a) 品質管理チェックの概要を漫画します。(b) 細胞および細胞残骸まだ残骸 (赤矢印) に組み込まれています。(c) 細胞残骸 (赤矢印) からリリースされました。(d) セル FACS により分離。P0: 破片端数P1: 細胞のような端数Duplets; の P3: 除外P4: 生存率色素 (Sytox オレンジ) 否定的な割合です。(e) の生存率色素コントロール。(f) P0 分数を表すのイメージは、破片を分離しました。(g) 分離可能な細胞 (赤矢印) を表す P4 分数のイメージ。(b)(c)(f)、(g) あった核色素イメージングの前に 20 分を追加しました。スケール バー: 80 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig3v3.jpg"> 図 3: 浅いシーケンス処理サンプル X 10 の回復されたセルの数を予測する。(自信を持ってマップリードにより MiSeq によって生成された csv リスト携帯バーコードとその対応する海の a) の例 (サンプル 1.6) をカウントします。(サンプル 1.6 b) バーコード ランク プロットは、携帯バーコードの機能として、海の数に 1 つの大幅な低下を示しています。破線と固体の線は、セルと背景ビジュアル検査によって決定されるカットオフを表しています。(c) 携帯バーコードは、浅いシーケンスは、サンプル 1.6 のセルの数を正確に近似明らかにセル レンジャー パイプラインのポスト HiSeq を使用して観察。(d) 浅いシーケンスに基づくフロー セル設定の例は、セルの見積もりを派生します。サンプル 1.6 の浅いシーケンス予測 3480 細胞 1.17 レーンに割り当てられたことを確認 &gt; HiSeq のセル配列範囲あたり 100,000 の読み取り。注: すべてのレーンは、100% を追加する必要があります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig4v3.jpg"> 図 4: 品質管理とスーラ R パッケージを使用して単一細胞 RNA Seq データセットのバイオインフォマティクス。(a) 品質管理指標遺伝子の数、数分子の一意の識別子 (Umi) のミトコンドリアのゲノムへのマッピングの成績証明書の割合などのプロット。(b) サンプルの遺伝子は、ミトコンドリアの転写産物と Umi の常軌を逸したレベルで検出セルがプロットされます。(c) サンプル肘のプロットが統計的に有意なパソコンのアドホックの決定に使用されます。破線や一点鎖線は、明確な「肘」がグラフに明らかになるカットオフを表しています。この肘の前に PC の寸法は、下流の分析に含まれます。(d, e)恒常的なプロットを使用して低次元空間における 2 つの異なる解像度で可視化グラフ ベースの細胞塊。(f) 上のマーカー遺伝子 (黄) 各クラスターのスーラの DoHeatmap 関数を使用して式ヒートマップで視覚化。(g) 可視化マーカー遺伝子の発現、たとえば、Cd68 マクロファージ スーラの FeaturePlot 関数を使用して (紫) を表します。2、このデータセットのパネル (ニ) 4 クラスターを表しますマクロファージが示唆されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58709/58709fig5v3.jpg"> 図 5: 細胞分類とモノクル ツールキットを使用して peudotemporal 軌道に沿って順序。(a) サンプルのすべてのセルに (海カウントから推論) mRNA の分布を調べること。のみ細胞 mRNA 0 ~ ~ 20,000 下流解析に使用されました。(b, c)割り当てることと知られている系統の細胞マーカーに基づく細胞の種類を数えます。たとえば、PDGF の受容器のアルファや線維芽細胞特定蛋白質 1 を発現する細胞に割り当てられていた携帯型 #1 パン線維芽細胞を表すモノクルの newCellTypeHierarchy 関数を使用します。円グラフ (b) と (c) のテーブルとして、異なる種類の細胞の数を視覚化できます。(d) セルを使用してたとえば、平均式対遺伝子分散を示す散布を使用してセルを視覚化できる並べ替えに使用する遺伝子型 #1 (繊維芽細胞)。赤色の曲線は、モノクルの estimateDispersions 関数を使用して平均分散モデルによる計算順序のための遺伝子のためのカットオフを示しています。このカットオフを満たす遺伝子は、下流の pseudotime 順序に使用されました。(e, f)色のセルの「状態」(e)、モノクルに割り当てられた"Pseudotime"(f) 減らされた次元セル軌跡の可視化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58709/58709fig5v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルを記述する一般的なプロセスと品質管理チェック液滴ベース、高スループット単一細胞 RNA シーケンス準備のため健康な成体哺乳類単一細胞を準備するために必要です。パラメーターのシーケンス、読み取りの配置、およびダウン ストリームの単一細胞バイオ情報解析されています。

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

この方法は、怪我や病気の後に何千もの単一細胞にわたる遺伝子発現の変化を理解するなど、微生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複雑な組織内の個々の細胞のトランスクリプトームを解剖し、特定の集団内の機能的ダイナミクスをよりよく理解できることです。私たちのプロトコルの利点は、一次組織の単一細胞の分離から、このデータセットの分析と視覚化に至る包括的な方法を提供することです。この方法は皮膚および神経からの単細胞懸濁液から始まるが、我々が記述するシーケンシング方法は、哺乳類組織を研究するために適用することができる。この手順を実証するのは、エロディ・ラヴィットと、私の研究室の2人の研修生であるWisoo Shinです。まず、マウスの後ろの後ろの領域から皮膚を切り離すことによって安楽死させたマウスの坐骨神経を解剖する。無菌メスの刃を使用して、太ももの長さに沿って切開を行います。その後、坐骨神経を露出し、除去するために細かい鉗子とはさみを使用してください。背側の背中の皮膚を解剖するには、細かい鉗子とはさみを使用して、肩から肩、ランプを横切り、背中を下に切開します。氷冷HBSSで2回組織を洗浄します。解剖顕微鏡の下で、不要な結合組織、脂肪沈着物、または破片を除去する。皮膚のみの場合は、滅菌メスの刃を使用して薄いスライスに皮膚をカットします。皮膚真皮を得るために、皮膚スライスをディスパーゼで、HBSSで10センチメートル皿に、摂氏37度で30〜40分間浮かべる。細かい鉗子を使用して表皮を真皮から剥離し、分離し、表皮を捨てます。その後、皮膚と神経のために、滅菌メスの刃のペアを使用して、各サンプルを1〜2ミリメートルにミンチします。ティッシュピースを解凍したばかりの部分に入れ、15ミリリットルの円錐形チューブに1ミリリットルの冷たいコラゲザーゼ4酵素あたり2グラム置きます。各サンプルを37°Cの浴槽に30分インキュベートし、10分ごとに穏やかな揺れをします。30分で、P1000ピペッタを使用して組織を20〜30回トリチュレートし、水浴に戻します。溶液が濁って見えるまで30分ごとにトリチャレーションを繰り返し、組織の塊は大部分解化されます。皮膚のみの場合、インキュベーションの最後の1時間に、皮膚サンプルにミリリットル1ミリグラムのドナーゼを加えます。一部の細胞タイプは機械的ストレスに対して他の細胞よりも敏感であるため、過度の解離技術は人口に偏る可能性があります。一般的な解離は、高い細胞収率を達成するために重要であり、組織組成物の正確な表現です。その後、50ミリリットル円錐形チューブの上に40マイクロメートルのフィルターを使用して、各組織サンプルを2回濾過します。1 パーセント BSA/HBSS でフィルターをリンスします。原稿に記載されているようにサンプルを遠心した後、広孔先端を使用して1%BSAを含むHBSS内の細胞ペレットを再中断し、氷の上に置く。生存性染料の添加は、あなたの準備を最適化するのに役立ちます。少なくとも80%の生存細胞を目指すべきです。最適化が完了すると、解離プロセスを早めるためにこの品質管理手順を省略して、RNAの品質を維持し、細胞損失を低減させることができます。FACSを使用して生存可能で健康な細胞を分離するには、まずサンプルコレクション用に8ミリリットルの氷冷1%BSA/HBSSで15ミリリットルの狭底チューブを調製します。液体の表面とチューブの内側の間の界面が湿っていることを確認し、静的および表面張力を防ぐために、収集前にチューブを反転させます。FACS細胞の選別直後に、細胞を15ミリリットルのチューブに集めたら、1%のBSA/HBSSを1ミリリットル使用して、チューブの側面からすべての細胞を洗い流し、押し下げる。その後、各サンプルを260gで8分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを1%BSA/HBSSに再び懸濁し、チューブに33.8マイクロリットルを加え、そのチューブを氷の上に置きます。このステップは標準化されたキットから得られる試薬を使用して行われるように設計されている。実証済みのすべての手順は、製造元の指示に従って実行する必要があります。GEM生成の準備のために、チップホルダーにチップを入れ、メーカーのプロトコルに従って氷の上にセルマスターミックスを準備します。マスターミックスの56.2マイクロリットルを33.8マイクロリットルのセルフサスペンションを含むチューブに加えます。チップを調製するために、まず使用しないウェルに50%グリセロールで。その後、セルマスターミックスの90マイクロリットルをウェル1に、40マイクロリットルのゲルビーズをウェル2に、270マイクロリットルの分配油を3に加えます。チップをガスケットで覆います。チップをロードして単一セルコントローラで実行するには、まずトレイを取り出します。トレイにチップを入れる。トレイを引き込み、再生を押します。完全な実行後、サンプルの100マイクロリットルを収集し、PCRチューブに入れ。PCRチューブをプリセット PCR マシンに配置し、キットに従って実行します。実行後、GEはポリアデニル化mRNAから全長のバーコード化されたcDNAを含みます。チューブをマイナス20度で一晩置きます。ライブラリの構築、シーケンス、位置合わせ、および解析を進めます。サンプルがシーケンス化され、原稿に記述されているように整列されたら、NCBI の GEO などのパブリック リポジトリにデータを格納します。これを行うには、提出者アカウントに登録します。まず、メタデータシートをダウンロードしてGEO提出を完了します。プロジェクトの提出ごとに 1 つのメタデータ シートのみを含めます。スプレッドシートをディレクトリに配置します。次に、すべてのライブラリのセル Ranger カウント スクリプトから生成された生データ ファイルをディレクトリに追加します。3 番目のフォルダーは、処理されたデータ ファイルです。すべてのライブラリのセル範囲カウントスクリプトから生成された処理済みデータファイルをディレクトリに配置します。GEO 送信者の FTP サーバー資格情報を使用して、3 つのコンポーネントすべてを含むディレクトリーを転送します。細胞レンジャーを実行した後、分析準備ができた遺伝子バーコードマトリックスは、高度なバイオインフォマティクスを使用してさらに処理することができます。まず、バイオリンと散乱プロットを生成して、遺伝子の数、一意の分子識別子の数、ミトコンドリア遺伝子の割合を視覚化して細胞の二重および外れ値を識別するSeurat Rパッケージを使用して前処理量チェックを行いました。主成分、またはPCの選択のために、PC軸の標準偏差の高原を超えるPCが除外された肘のプロットが使用されました。クラスタリングの解像度も操作されました。低解像度の場合、セル クラスターが少なくなり、各クラスターが定義されたセルの種類を表している可能性があります。高解像度は、セル集団のサブタイプ(移行状態)を表すセル確率を高くすることにつながった。低解像度のクラスター設定は、特定のクラスター内で最も高発現の遺伝子を同定するために、発現ヒートマップのさらなる解析に使用されました。個々の候補遺伝子をtSNEプロット上で視覚化し、Seuratの特徴プロット機能を使用して、解読を可能にし、例えばマクロファージを表すクラスターがあるかどうかを確認することができた。クラスター2と4の両方がCD68、汎マクロファージマーカーを発現した。他のパッケージは、品質管理のためのツールを提供します, 例えば, Monocle, 細胞の軌道を構築するために使用されるRパッケージ, 低品質の細胞を除去します, そして、すべての細胞間のmRNAの分布が対数正規であることを確認し、上限と下限の間に落ちています.次に、単一細胞を分類してカウントし、既知の系統マーカー遺伝子を用いて、目的のマーカーを発現する細胞を細胞型第1に割り当てた。細胞型1番は線維芽細胞であると判断した。この集団は、線維芽細胞の発達軌道を構築するために評価された。この手順に従って、定量PCRのような他の方法は、その場でのハイブリダイゼーションにおいて、免疫者の化学を実施して、遺伝子発現結果の正確性を検証する必要があります。単細胞mRNAシーケンシングは、多くの異なる分野の研究者が細胞間の不均一性を探求し、ホメオスタシス中に異なる組織内の機能的ダイナミクスを同定する道を開き、これらは傷害または病気の発症後にどのように変化する可能性があります。

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Biology

生物学

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多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

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凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

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哺乳類の成体の液滴バーコードベースの単一細胞トランスクリプトーム

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