出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析
2025年10月3日
このプロトコルは、フローサイトメトリーとシングルセルRNAシーケンシングを組み合わせて、出生後早期マウス脳の小脳におけるミクログリア細胞の状態を単離し、特徴付けます。酵素解離、パーコール遠心分離、免疫染色を使用してミクログリアの不均一性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるミクログリアの役割の理解を深めます。
私たちの研究では、ミクログリアが出生前脳損傷後の脳修復にどのような影響を与えるかを調査しています。そして、ミクログリア細胞の活性を調節することで長期的な神経学的転帰を改善できるかどうかを判断することを目指しています。ミクログリア細胞の反応の複雑さと、生理学的だけでなく病理学的反応や疾患を表すために、それらの反応を最も正確な方法で記述することの難しさだと思います。
私たちは、単一細胞RNAシーケンシングやフローサイトメトリー実験などのさまざまなモダリティを使用して、出生前損傷後の発達中の脳におけるミクログリアの状態と機能を特徴付けています。主な課題は、分離中、特に小脳細胞数が限られている新生児の時点で、細胞の生存率とミクログリアの同一性を維持することです。これは、幼少期の小脳損傷がミクログリア亜集団の転写変化にどのようにつながり、標的療法がこれらの変化をどのように調節する可能性があるかについて疑問を投げかけます。
まず、必要に応じてマウスの特定の脳領域を解剖します。鉗子を使用して、細胞の生存率を維持するために氷上に置かれたミクログリア細胞培養培地を含む小さなペトリ皿に組織を移します。ピペットを使用して、ペトリ皿からミクログリア細胞培養培地を取り出します。
次に、メスを使用して、同じペトリ皿で脳組織を細かく切ります。均質化された脳組織を酵素消化のために5ミリリットルのチューブに移します。コラゲナーゼDとDNase 1を添加したハンクスバランス塩溶液2ミリリットルを各チューブに加え、キャップをパラフィルムでしっかりと密封します。
次に、チューブを摂氏37度の水浴で15分間インキュベートし、5分ごとに振とうします。消化を止めるには、チューブを氷の上に置きます。次に、ホモジネートを 140 マイクロメートルの金属メッシュ フィルターに通し、大きな破片を取り除きます。
ガラス乳棒を使用して、フィルター上の残りの細胞をそっと解離します。金属メッシュフィルターを、洗浄ごとに3ミリリットルのミクログリア細胞培養培地で複数回洗浄します。次に、10ミリリットルのピペットを使用して、濾液を集め、15ミリリットルのチューブに移します。
次に、チューブを摂氏4度で500gで7分間遠心分離します。その後、チューブを慎重に反転させて上清を捨てます。ラックを使用して、チューブをそっとこすり、ペレットを再懸濁させます。
次に、10ミリリットルの37%シリカベースのコロイド媒体溶液を再懸濁した細胞に加えます。溶液を摂氏4度で500gで10分間遠心分離し、最小限の破断力で遠心分離します。10ミリリットルのピペットを使用して、溶液の上部からミエリン層を吸引します。
細胞を洗浄するには、10ミリリットルのハンクスバランス塩溶液を加え、チューブを摂氏4度で500gで7分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを再懸濁した後、10ミリリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーをチューブに加えます。遠心分離後、最終ペレットを残りのバッファーに再懸濁して下流の用途に使用します。
すべての単離細胞を、底が円錐形の96ウェルプレートに移します。プレートを摂氏4度で5分間500gで遠心分離します。プレートを1回の動作で素早く反転させて、上清を捨てます。
次に、細胞ペレットを25マイクロリットルのブロッキング溶液に再懸濁し、プレートを室温で15分間インキュベートします。細胞外抗体染色ミックスを調製するには、抗体ストックチューブを10, 000gで遠心分離して凝集体を除去します。ペレットを乱すことなく、上清から必要な量を吸引します。
蛍光活性化細胞選別バッファーを使用して、総容量を25マイクロリットルに調整します。次に、25マイクロリットルの細胞外抗体染色ミックスを各ウェルに加え、プレートを室温で20分間インキュベートします。混合せずに、150マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーを各ウェルに加えます。
プレートを摂氏4度で5分間500gで遠心分離します。次に、プレートを素早く反転させ、1回の動作で上清を除去します。細胞ペレットを200マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁し、前述のように遠心分離します。
細胞を100マイクロリットルのサポニン-パラホルムアルデヒド緩衝液に再懸濁して、細胞を固定して透過します。次に、プレートを光から保護して室温で10分間インキュベートします。混合せずに、各ウェルに100マイクロリットルのサポニン緩衝液を加えます。
プレートを500gで摂氏4度で6分間遠心分離します。次に、プレートを反転させて上清を1回の動きで除去し、細胞ペレットを200マイクロリットルのサポニン緩衝液に再懸濁します。次に、11個の空のウェルに20マイクロリットルのビーズを追加して、補償コントロールを準備します。
細胞内抗体染色ミックスを調製するには、抗体ストックチューブを10, 000gで遠心分離して、潜在的な凝集体を除去します。ペレットを乱すことなく、上清から必要な量を吸引します。サポニンバッファーを使用して容量を50マイクロリットルに調整します。
次に、細胞ペレットを50マイクロリットルの細胞内抗体混合物に再懸濁します。各抗体1マイクロリットルをそれぞれのビーズウェルに加え、プレートを室温で30分間インキュベートします。混合せずに、細胞サンプルを含む各ウェルに150マイクロリットルのサポニンバッファーを加えます。
100マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーを各補償コントロールウェルに加えて、ビーズを洗浄します。プレートが遠心分離されたら、細胞ペレットとコントロールをそれぞれ200マイクロリットルのサポニンバッファーと蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁します。プレートを500gで摂氏4度で6分間遠心分離し、上清を取り除きます。
細胞サンプルと補償コントロールの両方を200マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁します。懸濁液を標識された蛍光活性化細胞選別チューブに移します。単一細胞RNAシーケンシングにより、転写プロファイルに基づいて、他の脳細胞型とは別の異なるミクログリアクラスターが同定されました。
差次発現解析により、Csf1r、Fcrls、Fyb、Adap2、P2ry12などのミクログリアの有意なアップレギュレーション遺伝子が明らかになりました。ミクログリア細胞は、CD45およびCD11bマーカーの異なる発現に基づいて、生きた脳サンプルから分離することに成功しました。CD80、CD86、iNOS、CD206とArg1、CD86とCD64、CD163とCD206などの活性化マーカーの組み合わせに基づいて、異なるミクログリア亜集団が同定されました。
Ptprc と Itgam のマーカー遺伝子発現は、umap 投影のミクログリア クラスターに特異的に局在し、これらの細胞の同一性を確認しました。バイオリンプロット分析では、ビヒクルコントロールと比較して、処理されたミクログリアにおけるFcgr1やCd86などの抗炎症マーカーの発現が低いことが示されました。
概要
このプロトコルは、フローサイトメトリーと単一細胞RNAシーケンシングを組み合わせて、出生直後のマウス脳の小脳におけるミクログリア細胞状態を分離し、特徴付けます。酵素分離とペルコル遠心分離、免疫染色を用いて、ミクログリアの多様性を明らかにし、小脳の発達と疾患におけるそれらの役割の理解を深めます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- ミクログリアは脳の発達と機能において重要です。
- ミクログリアのダイナミクスを理解することで、様々な疾患における役割を明らかにできます。
- ミクログリアの状態を特徴付けることは、標的療法の開発に不可欠です。
- 単一細胞分析は細胞の多様性についての洞察を提供します。
研究の目的
- 小脳におけるミクログリアの状態を分離し、特徴付けること。
- 脳の発達におけるミクログリアの役割の理解を深めること。
- 疾患プロセスにおけるミクログリアの関与に関する知識に貢献すること。
使用された方法
- 主に使用されるプラットフォームはフローサイトメトリーと単一細胞RNAシーケンシングの組み合わせです。
- 生物学的モデルは出生直後のマウス脳で、小脳のミクログリアに焦点を当てています。
- 重要なステップには細胞を分離するための酵素分離とペルコル遠心分離が含まれます。
- ミクログリアの特性をさらに分析するために免疫染色技術が使用されます。
主な結果
- 研究はミクログリア細胞状態を成功裏に分離し、その多様性を明らかにしました。
- 小脳の発達におけるミクログリアの役割についての洞察が得られました。
- 疾患メカニズムにおけるミクログリアの意味についての理解が深まりました。
結論
- この研究はミクログリア状態を分析するための堅牢な方法論を実証しています。
- 神経機構と潜在的な疾患モデルの理解に大きく貢献しています。
- 結果は、ミクログリア機能を標的とする将来の治療戦略への道を開く可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution characterization of microglial activation states in early postnatal mouse brain development is critical for de-risking neuroinflammation targets and understanding developmental mechanisms. Integrating flow cytometry and single-cell RNA sequencing enables robust, quantitative profiling of microglial heterogeneity, supporting predictive confidence in target validation and translational research. These methods provide a reproducible framework for advancing neuroimmune discovery programs and informing portfolio decisions in neurodevelopmental and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microglial activation states and population diversity.
- Supports functional target validation by linking surface marker expression to transcriptomic profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroimmune pathways in early development.
- Provides quantitative data for triaging neuroinflammation targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated cell isolation and gating strategies for reproducible microglia assays.
- Standardizes live/dead discrimination and marker profiling for downstream screening workflows.
- Enables scalable preparation of high-quality neural cell suspensions for compound evaluation.
- Supports platform reuse across multiple experimental conditions and perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial phenotyping with disease-relevant transcriptomic signatures.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of neurodevelopmental and neurodegenerative models.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in microglia-driven pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-method workflow bridges early discovery and preclinical research by enabling robust microglial profiling from cell isolation to transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and diversity during brain development.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for microglial marker expression and viability.
- Analytics: Delivers high-dimensional single-cell data and differential gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects microglial phenotypes to disease-relevant states and experimental perturbations.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable protocols for diverse brain regions and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of microglial profiling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroimmune targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, single-cell RNA sequencing, and neural tissue handling.
- Demands access to advanced instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell isolation and gating protocols.
- Adaptable to other brain regions with protocol optimization for tissue-specific characteristics.
- Dependent on validated antibodies and careful control of cell viability and state during processing.
