出生後早期マウス脳発生におけるミクログリア活性化を特徴付けるためのフローサイトメトリーと単一細胞解析

私たちの研究では、ミクログリアが出生前脳損傷後の脳修復にどのような影響を与えるかを調査しています。そして、ミクログリア細胞の活性を調節することで長期的な神経学的転帰を改善できるかどうかを判断することを目指しています。ミクログリア細胞の反応の複雑さと、生理学的だけでなく病理学的反応や疾患を表すために、それらの反応を最も正確な方法で記述することの難しさだと思います。

私たちは、単一細胞RNAシーケンシングやフローサイトメトリー実験などのさまざまなモダリティを使用して、出生前損傷後の発達中の脳におけるミクログリアの状態と機能を特徴付けています。主な課題は、分離中、特に小脳細胞数が限られている新生児の時点で、細胞の生存率とミクログリアの同一性を維持することです。これは、幼少期の小脳損傷がミクログリア亜集団の転写変化にどのようにつながり、標的療法がこれらの変化をどのように調節する可能性があるかについて疑問を投げかけます。

まず、必要に応じてマウスの特定の脳領域を解剖します。鉗子を使用して、細胞の生存率を維持するために氷上に置かれたミクログリア細胞培養培地を含む小さなペトリ皿に組織を移します。ピペットを使用して、ペトリ皿からミクログリア細胞培養培地を取り出します。

次に、メスを使用して、同じペトリ皿で脳組織を細かく切ります。均質化された脳組織を酵素消化のために5ミリリットルのチューブに移します。コラゲナーゼDとDNase 1を添加したハンクスバランス塩溶液2ミリリットルを各チューブに加え、キャップをパラフィルムでしっかりと密封します。

次に、チューブを摂氏37度の水浴で15分間インキュベートし、5分ごとに振とうします。消化を止めるには、チューブを氷の上に置きます。次に、ホモジネートを 140 マイクロメートルの金属メッシュ フィルターに通し、大きな破片を取り除きます。

ガラス乳棒を使用して、フィルター上の残りの細胞をそっと解離します。金属メッシュフィルターを、洗浄ごとに3ミリリットルのミクログリア細胞培養培地で複数回洗浄します。次に、10ミリリットルのピペットを使用して、濾液を集め、15ミリリットルのチューブに移します。

次に、チューブを摂氏4度で500gで7分間遠心分離します。その後、チューブを慎重に反転させて上清を捨てます。ラックを使用して、チューブをそっとこすり、ペレットを再懸濁させます。

次に、10ミリリットルの37%シリカベースのコロイド媒体溶液を再懸濁した細胞に加えます。溶液を摂氏4度で500gで10分間遠心分離し、最小限の破断力で遠心分離します。10ミリリットルのピペットを使用して、溶液の上部からミエリン層を吸引します。

細胞を洗浄するには、10ミリリットルのハンクスバランス塩溶液を加え、チューブを摂氏4度で500gで7分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを再懸濁した後、10ミリリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーをチューブに加えます。遠心分離後、最終ペレットを残りのバッファーに再懸濁して下流の用途に使用します。

すべての単離細胞を、底が円錐形の96ウェルプレートに移します。プレートを摂氏4度で5分間500gで遠心分離します。プレートを1回の動作で素早く反転させて、上清を捨てます。

次に、細胞ペレットを25マイクロリットルのブロッキング溶液に再懸濁し、プレートを室温で15分間インキュベートします。細胞外抗体染色ミックスを調製するには、抗体ストックチューブを10, 000gで遠心分離して凝集体を除去します。ペレットを乱すことなく、上清から必要な量を吸引します。

蛍光活性化細胞選別バッファーを使用して、総容量を25マイクロリットルに調整します。次に、25マイクロリットルの細胞外抗体染色ミックスを各ウェルに加え、プレートを室温で20分間インキュベートします。混合せずに、150マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーを各ウェルに加えます。

プレートを摂氏4度で5分間500gで遠心分離します。次に、プレートを素早く反転させ、1回の動作で上清を除去します。細胞ペレットを200マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁し、前述のように遠心分離します。

細胞を100マイクロリットルのサポニン-パラホルムアルデヒド緩衝液に再懸濁して、細胞を固定して透過します。次に、プレートを光から保護して室温で10分間インキュベートします。混合せずに、各ウェルに100マイクロリットルのサポニン緩衝液を加えます。

プレートを500gで摂氏4度で6分間遠心分離します。次に、プレートを反転させて上清を1回の動きで除去し、細胞ペレットを200マイクロリットルのサポニン緩衝液に再懸濁します。次に、11個の空のウェルに20マイクロリットルのビーズを追加して、補償コントロールを準備します。

細胞内抗体染色ミックスを調製するには、抗体ストックチューブを10, 000gで遠心分離して、潜在的な凝集体を除去します。ペレットを乱すことなく、上清から必要な量を吸引します。サポニンバッファーを使用して容量を50マイクロリットルに調整します。

次に、細胞ペレットを50マイクロリットルの細胞内抗体混合物に再懸濁します。各抗体1マイクロリットルをそれぞれのビーズウェルに加え、プレートを室温で30分間インキュベートします。混合せずに、細胞サンプルを含む各ウェルに150マイクロリットルのサポニンバッファーを加えます。

100マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーを各補償コントロールウェルに加えて、ビーズを洗浄します。プレートが遠心分離されたら、細胞ペレットとコントロールをそれぞれ200マイクロリットルのサポニンバッファーと蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁します。プレートを500gで摂氏4度で6分間遠心分離し、上清を取り除きます。

細胞サンプルと補償コントロールの両方を200マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁します。懸濁液を標識された蛍光活性化細胞選別チューブに移します。単一細胞RNAシーケンシングにより、転写プロファイルに基づいて、他の脳細胞型とは別の異なるミクログリアクラスターが同定されました。

差次発現解析により、Csf1r、Fcrls、Fyb、Adap2、P2ry12などのミクログリアの有意なアップレギュレーション遺伝子が明らかになりました。ミクログリア細胞は、CD45およびCD11bマーカーの異なる発現に基づいて、生きた脳サンプルから分離することに成功しました。CD80、CD86、iNOS、CD206とArg1、CD86とCD64、CD163とCD206などの活性化マーカーの組み合わせに基づいて、異なるミクログリア亜集団が同定されました。

Ptprc と Itgam のマーカー遺伝子発現は、umap 投影のミクログリア クラスターに特異的に局在し、これらの細胞の同一性を確認しました。バイオリンプロット分析では、ビヒクルコントロールと比較して、処理されたミクログリアにおけるFcgr1やCd86などの抗炎症マーカーの発現が低いことが示されました。