組織サンプル中の皮膚細胞の表現型と増殖状態を評価するためのハイスループットイメージングおよび分析ワークフロー

このプロトコルは、マルチプレックス光学イメージング法、IBEX、およびClick-iT EDUラベリングを組み合わせて、皮膚修復などの非常に動的なプロセスで分裂する細胞型を検出および分類します。さらに、ハイスループットの画像取得と分析のための新しいオープンソースの画像処理パイプラインを提供します。24ウェルプレートに200マイクロリットルのクロムアルミニウムゼラチンをコーティングし、ロッカーシェーカーでプレートを15分間インキュベートします。

次にゼラチンを完全に取り除き、コーティングされたウェルを40度のオーブンで60分間乾燥させます。クライオスタットでOCT包埋組織を15〜30マイクロメートルの厚さで切断し、2ミリリットルのPBSを含むコーティングウェルにすばやく移します。組織切片をウェルの中心に保つことを目的として、1ミリリットルのピペットを使用してPBSを慎重に除去します。

これを効果的に行うには、ウェルの端からPBSをゆっくりと吸引し、必要に応じてピペットの位置を調整して組織がずれないようにします。組織切片を摂氏37度のオーブンで1時間乾燥させます。1ミリリットルPBSで5分間再水和します。

500マイクロリットルの0.5%Tritonで組織を室温で30分間透過処理します。組織をPBSで2回短時間洗浄し、室温で30分間Click-iT反応を行います。サンプルを光から保護してください。

PBSで組織を2回短時間洗浄します。室温でブロッキングバッファーで1時間ブロックします。最初のサイクルの一次抗体を追加します。

そして、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。PBSで3回洗浄します。二次抗体染色を行います。

最初のサイクルでは、非共役一次抗体の二次抗体を核対比染色とともに適用します。光から保護したサンプルを室温で60分間インキュベートします。組織を1ミリリットルPBSで室温で5分間3回洗浄します。

各ウェルに約500マイクロリットルのPBSを残し、プレートを顕微鏡に持っていきます。Meta Expressソフトウェアで、[スクリーニング]、[獲得設定]の順にクリックします。[取り出し] ボタンをクリックします。

プレートの底を70%エタノールで洗浄し、プレートを顕微鏡に挿入します。[ロード プレート]ボタンをクリックします。[対物レンズとカメラ]タブで、目的の倍率を選択します。

取得モードとして、共焦点51マイクロメートルスリットモードを選択します。[プレート]タブで、プレート モデルを選択します。[プレートサイト訪問]タブに移動します。

[サイトオプション]で、[固定数のサイト]をクリックします。井戸全体がほぼ覆われるように、列数と行数の両方を設定します。重複するサイトをクリックします 10%プレートマップ上の対応するウェルを右クリックして、取得する最初のウェルのみを選択します。

[取得オートフォーカス]タブに移動します。ウェルツーウェルのオートフォーカスの場合は、プレートとウェル底のオプションを選択します。サイトのオートフォーカスの場合は、[すべてのサイト] オプションを選択します。

[波長]タブに移動し、現在のサイクルでイメージングする色素の数を選択します。最初の波長タブに移動します。Z位置決めにZオフセットのレーザーを選択し、[オフセットの計算]ボタンをクリックして正しいイメージング高さを設定します。

サンプルに最も焦点が合っている画像を選択します。フォーカスボタンを押します。組織の焦点が合った画像が表示されます。

照明パワーを50%に設定する ターゲットの最大強度を2000に設定し、自動露出を押します。ZシリーズはZシリーズと2D投影画像を選択し、シェーディング補正はFLシェーディングのみを選択します。他の波長についても手順を繰り返しますが、Zオフセットのレーザーの代わりに、W1からZオフセットを選択し、ゼロを選択します。

Zシリーズステップに移動し、希望のステップサイズを入力します。[フォーカス] ボタンをクリックします。組織の底に到達するまで現在の位置の矢印をドラッグし、[B を設定] ボタンをクリックします。

位置矢印をティッシュの上部にドラッグし、[T を設定] ボタンをクリックします。F2、停止をクリックし、ライブの開始をもう一度押します。ステージを左クリックして、ステージが最初の井戸にあることを確認します。

組織の境界を見つけ、右クリックで取得する組織を含むすべての部位に印を付けます。[実行] タブに移動し、プレートの名前を入力します。[プロトコルの保存]をクリックします。

他のすべての井戸の取得領域を設定します。Control、Journalを実行し、記録を開始し、すぐにControl、Journal、記録を停止します。作成した仕訳帳を保存し、コントロール、仕訳帳、仕訳編集で再度開きます。

左側のパネルで、プレート取得に移動し、ファイルからプロトコルをロードし、プレート取得をクリックして、これらのステップをジャーナルに追加します。Edit Plate Acquisitionをダブルクリックし、ファイルからプロトコルをロードし、最初のウェルに保存されたプロトコルを選択します。取り込むウェルごとに手順を繰り返し、常にそれぞれのプロトコルをロードするようにしてください。

[仕訳の実行] をクリックして、取得を開始します。ジャーナルが終了する30分前に、漂白試薬の準備を開始します。10ミリグラムの水素化ホウ素リチウムを10ミリリットルの二重蒸留H2Oに溶解し、0.22マイクロメートルのフィルターに通します。

10分間放置します。溶液は気泡を形成し始めるはずです。効率的な漂白を確実にするために、調製後 4 時間以内に漂白試薬を使用してください。

漂白液をサンプルに加え、サンプルを周囲の照明にさらしたまま15分間インキュベートします。組織に小さな泡が現れるはずです。漂白したサンプルを1ミリリットルPBSで室温で5分間3回洗浄します。

次のサイクルの一次抗体を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。Click-iT EDU標識と組み合わせた多重IBEXイメージングは、損傷した皮膚のさまざまな構造と増殖する細胞型を明らかにします。凍結保存されたサンプルのEDU標識は、パラフィン包埋組織切片でKI-67の抗体免疫蛍光標識を行う場合、およびフローサイトメトリーを使用してKI 67で細胞を標識する場合に類似していることが示されています。

このプロトコルを使用すると、複雑な生物学的プロセスにおける細胞増殖を正確に検出できます。さらに、オープンソースのイメージング処理パイプラインはプログラミングの経験を必要とせず、FijiやquPathなどの非商用ソフトウェアで処理できるファイルを生成します。さらに、このプロトコルは高価な機器を必要としないため、ほとんどの研究環境で実行できます。