細胞集団分析スキン発がん中

この手順の全体的な目標は、皮膚がん基底細胞がんのマウスモデルで細胞集団解析を行うことです。これは、まずマウスで標的遺伝子の発現を誘導することによって達成されます。第2ステップでは、表皮をマウスの皮膚から分離します。

単一細胞懸濁液を生成した後、表皮細胞に特定の細胞サービスマーカーを標識します。最終的に、皮膚の腫瘍発生中の細胞集団の変化は、フローサイトメトリー分析によって監視できます。がんの発生は、多くの細胞タイプが関与するプロセスです。

この手順の目的は、研究者がさまざまな細胞が皮膚がんの発症にどのように寄与しているかを調査するのを支援することです。この方法は、皮膚がんの発生中の細胞相互作用に関する洞察を提供できますが、膵臓がんなどの他のシステムにも適用できます。この手法は、視覚的な評価なしに実験をいつ終了すべきかを判断するのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

まず、ケラチン14クリーERマウスをK14マウスと呼び、ローザ26マウスをYFPタグ付き平滑化遺伝子SMU M2をSMUと呼ぶ2匹をマウスとする。マウス。次に、3〜6週齢のダブルポジティブマウスから採取した0.5センチメートルのロングテール標本を、プロテイナーゼKの1ミリグラムあたり1ミリグラムの直接PCRテール溶解溶液に浸します。翌日、マイクロ遠心分離機で組織を最高速度で回転させ、破片を取り除きます。

次に、各動物の遺伝子型を定型するために、ベンダーが推奨するプライマーおよび条件での個々のPCR反応で、各検体から1マイクロリットルのSNATを使用します。湾曲した20ゲージの栄養針を使用して、動物にタモキシフェンを投与します。.K 14 C erとROSA 26のダブル陽性を5日間連続して経口強制経口投与し、ケラチノサイトにOO M 2発現を誘導しました。

一般に、表現型は、細胞分析のために皮膚を採取するために、GFPタグ付きK14 OOマウスの耳と尾部でより深刻です。まず、震えを使用して、安楽死させた動物の毛皮を取り除きます。次に、マウスの皮膚を取り除き、組織を摂氏37度のディスベ溶液に1〜2時間浸します。

ディスパ治療の後、一対の鉗子を使用して表皮を真皮から分離します。次に、はさみを使用して表皮をミンチにします。次に、組織をコラゲナーゼ4溶液に50ミリリットルのチューブ内で摂氏37度で1〜2時間浸します。

20分ごとにチューブを静かに回転させて、細胞を解離させます。顕微鏡を使用して、コラゲナーゼ培地で単一細胞を検出できる場合に細胞の解離を確認します。標本をさらに30分間インキュベートして、細胞収量を増やします。

次いで、70ミクロンの細胞ストレーナーを介して組織混合物を濾過し、Gの500倍および室温で10分間細胞を洗浄し、細胞を標識し、10%FBSを添加したPBSで洗浄したばかりのペレットを1ミリリットルあたり6個の細胞のうち10倍で懸濁する。次に、細胞溶液を氷上に30分間置き、非特異的結合をブロックします。次に、細胞のアリコートを1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、特異的抗体を標識します。

抗体を各チューブに最終濃度2マイクログラム/ミリリットルで添加します。チューブを数秒間静かにボルテックスして抗体を細胞と混合し、さらに30分間チューブを氷に戻します。チューブを1ミリリットルのPBSで洗浄した後、ペレットをPBSに再懸濁し、次にDPIを最終濃度1ミリグラム/ミリリットルで追加します。

データを分析するときは、まず、前方散乱図と側方散乱図に基づいて、DABI陽性のデッドセルを除外した単一セルを選択します。マウスは、これらの画像に見られるようにハリネズミシグナル伝達が活性化されている場合を除き、基底細胞癌を発症しません。タモキシフェンは、発癌性平滑化M two YFPの発現を誘導し、これらの動物の皮膚hおよびe染色標本の成長解剖学的レベルでも明らかな皮膚表現型をもたらします。

皮膚腫瘍はK 14 SMUマウスで観察できます。SMU M 2 YFP誘導がなければ、動物の皮膚はhおよびeによって異常な形態を示さなかった。これらのドットプロットを染色すると、正常マウスと担がんマウスの骨髄細胞の代表的な分析が示されています。

CD 11 B陽性GR 1陽性細胞は骨髄細胞に由来し、その一部は正常および非smu M 2 YFP誘導マウスの骨髄由来サプレッサー細胞である。CD 11 B陽性GR 1陽性細胞集団はほとんど検出できませんが、炎症または腫瘍の発生に応答して増加します。K 14 SMUマウス。

皮膚におけるsmu、M、two、YFP、およびケラチノサイトの発現が誘導されると、CD 11 B陽性のGR one陽性細胞集団が増加します。この技術により、皮膚生物学の研究者は、マウスのB細胞がんの分子解析を行うことができます。