細胞集団分析スキン発がん中
2013年8月21日
発癌は、癌細胞とがん微小環境との相互作用を伴うプロセスである。分子事象を分析するためには、癌の開発中の異なる段階で異なる細胞集団を単離する必要がある。基底細胞癌のマウスモデルを用いて、発癌の間に、細胞分析のためのプロトコールを述べる。
この手順の全体的な目標は、皮膚がん基底細胞がんのマウスモデルで細胞集団解析を行うことです。これは、まずマウスで標的遺伝子の発現を誘導することによって達成されます。第2ステップでは、表皮をマウスの皮膚から分離します。
単一細胞懸濁液を生成した後、表皮細胞に特定の細胞サービスマーカーを標識します。最終的に、皮膚の腫瘍発生中の細胞集団の変化は、フローサイトメトリー分析によって監視できます。がんの発生は、多くの細胞タイプが関与するプロセスです。
この手順の目的は、研究者がさまざまな細胞が皮膚がんの発症にどのように寄与しているかを調査するのを支援することです。この方法は、皮膚がんの発生中の細胞相互作用に関する洞察を提供できますが、膵臓がんなどの他のシステムにも適用できます。この手法は、視覚的な評価なしに実験をいつ終了すべきかを判断するのが難しいため、視覚的にデモンストレーションすることが重要です。
まず、ケラチン14クリーERマウスをK14マウスと呼び、ローザ26マウスをYFPタグ付き平滑化遺伝子SMU M2をSMUと呼ぶ2匹をマウスとする。マウス。次に、3〜6週齢のダブルポジティブマウスから採取した0.5センチメートルのロングテール標本を、プロテイナーゼKの1ミリグラムあたり1ミリグラムの直接PCRテール溶解溶液に浸します。翌日、マイクロ遠心分離機で組織を最高速度で回転させ、破片を取り除きます。
次に、各動物の遺伝子型を定型するために、ベンダーが推奨するプライマーおよび条件での個々のPCR反応で、各検体から1マイクロリットルのSNATを使用します。湾曲した20ゲージの栄養針を使用して、動物にタモキシフェンを投与します。.K 14 C erとROSA 26のダブル陽性を5日間連続して経口強制経口投与し、ケラチノサイトにOO M 2発現を誘導しました。
一般に、表現型は、細胞分析のために皮膚を採取するために、GFPタグ付きK14 OOマウスの耳と尾部でより深刻です。まず、震えを使用して、安楽死させた動物の毛皮を取り除きます。次に、マウスの皮膚を取り除き、組織を摂氏37度のディスベ溶液に1〜2時間浸します。
ディスパ治療の後、一対の鉗子を使用して表皮を真皮から分離します。次に、はさみを使用して表皮をミンチにします。次に、組織をコラゲナーゼ4溶液に50ミリリットルのチューブ内で摂氏37度で1〜2時間浸します。
20分ごとにチューブを静かに回転させて、細胞を解離させます。顕微鏡を使用して、コラゲナーゼ培地で単一細胞を検出できる場合に細胞の解離を確認します。標本をさらに30分間インキュベートして、細胞収量を増やします。
次いで、70ミクロンの細胞ストレーナーを介して組織混合物を濾過し、Gの500倍および室温で10分間細胞を洗浄し、細胞を標識し、10%FBSを添加したPBSで洗浄したばかりのペレットを1ミリリットルあたり6個の細胞のうち10倍で懸濁する。次に、細胞溶液を氷上に30分間置き、非特異的結合をブロックします。次に、細胞のアリコートを1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、特異的抗体を標識します。
抗体を各チューブに最終濃度2マイクログラム/ミリリットルで添加します。チューブを数秒間静かにボルテックスして抗体を細胞と混合し、さらに30分間チューブを氷に戻します。チューブを1ミリリットルのPBSで洗浄した後、ペレットをPBSに再懸濁し、次にDPIを最終濃度1ミリグラム/ミリリットルで追加します。
データを分析するときは、まず、前方散乱図と側方散乱図に基づいて、DABI陽性のデッドセルを除外した単一セルを選択します。マウスは、これらの画像に見られるようにハリネズミシグナル伝達が活性化されている場合を除き、基底細胞癌を発症しません。タモキシフェンは、発癌性平滑化M two YFPの発現を誘導し、これらの動物の皮膚hおよびe染色標本の成長解剖学的レベルでも明らかな皮膚表現型をもたらします。
皮膚腫瘍はK 14 SMUマウスで観察できます。SMU M 2 YFP誘導がなければ、動物の皮膚はhおよびeによって異常な形態を示さなかった。これらのドットプロットを染色すると、正常マウスと担がんマウスの骨髄細胞の代表的な分析が示されています。
CD 11 B陽性GR 1陽性細胞は骨髄細胞に由来し、その一部は正常および非smu M 2 YFP誘導マウスの骨髄由来サプレッサー細胞である。CD 11 B陽性GR 1陽性細胞集団はほとんど検出できませんが、炎症または腫瘍の発生に応答して増加します。K 14 SMUマウス。
皮膚におけるsmu、M、two、YFP、およびケラチノサイトの発現が誘導されると、CD 11 B陽性のGR one陽性細胞集団が増加します。この技術により、皮膚生物学の研究者は、マウスのB細胞がんの分子解析を行うことができます。
概要
本研究では、マウスモデルを用いて基底細胞癌の発生過程における細胞集団を解析するためのプロトコルを提示します。この手法により、癌細胞とそれを取り巻く微小環境との相互作用を調査することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- がん研究
背景
- 発がん過程には、がん細胞とその微小環境との間の複雑な相互作用が関与しています。
- これらの相互作用を理解するには、がん形成のさまざまな段階において異なる細胞集団を単離する必要があります。
- 本研究では、マウスモデルにおける基底細胞癌に焦点を当てています。
- 細胞集団解析を行うことで、腫瘍の発生と細胞間相互作用に関する知見を得ることができます。
研究目的
- 皮膚がんのマウスモデルにおいて、細胞集団解析を行う。
- 異なる細胞型が皮膚がんの進展にどのように寄与しているかを調査する。
- 膵がんなど、他のがん種にも適用可能な手法を提供する。
使用方法
- マウスにおける標的遺伝子発現の誘導。
- マウス皮膚からの表皮の単離。
- 単一細胞懸濁液の調製および特異的マーカーによる標識。
- 細胞集団の変化をモニタリングするためのフローサイトメトリー解析。
主な結果
- 腫瘍形成過程における細胞集団の変化を効果的にモニタリングできる。
- oncogenic smoothened の誘導発現により、観察可能な皮膚表現型が生じる。
- 腫瘍担持マウスにおいて、骨髄由来抑制細胞（MDSC）の集団が増加する。
- 実験終了の判断には、視覚的な評価が不可欠である。
結論
- この手法は、基底細胞癌の分子解析に役立ちます。
- これにより、皮膚癌における細胞間相互作用の理解が深まります。
- この方法は、他の癌研究への応用も可能です。
よくある質問
産業界における重要性
このプロトコルにより、生体内における腫瘍形成への細胞の寄与を系統的に解析することが可能となり、腫瘍学における標的バリデーションの重要な課題を解決できます。遺伝子組換え皮膚発がんモデルから定義された細胞集団を単離することで、治療仮説のメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチは、ストローマ細胞および免疫細胞の動態に関する定量的かつ再現性のあるデータを提供し、初期の創薬意思決定における予測的な信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：腫瘍の進行過程における特定の細胞集団の変化を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：マウス皮膚から表皮を分離し、単一細胞懸濁液を調製するための標準化されたワークフローを提供する。
- 予測的価値：癌遺伝性シグナルに応答した骨髄由来抑制細胞の増殖をフローサイトメトリーでモニタリングすることにより、生物学的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：免疫腫瘍学スクリーニングにおける免疫表現型解析パネルに適した、バリデート済み単一細胞懸濁液を調製します。
- 再現性：定義された酵素的解離およびろ過ステップを含んでおり、一貫した細胞回収率と生存率を確保します。
- 拡張性：複数の皮膚生検試料を処理できるように設計されており、前臨床研究におけるコホートベースの解析を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：Hedgehog経路の活性化によって誘導される基底細胞癌をモデル化しており、ターゲット検証において機序的に重要なシステムである。
- トランスレーショナルな連続性：細胞表現型の変化を腫瘍形成に関連付けることで、リスクを調整した進展決定をサポートする。
- バイオマーカーの整合性：骨髄由来抑制細胞（MDSC）活性の潜在的なトランスレーショナルバイオマーカーとして、CD11b+GR1+集団の追跡を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットのバリデーションから前臨床評価に至るディスカバリー・コンティニュアムに適合しており、発がんにおける細胞メカニズムの反復的な評価を可能にします。
- 探索生物学：表皮およびストロマのコンパートメントを分離することで、パスウェイ特異的な細胞応答を明確にし、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：定量的かつマルチパラメトリックなフローサイトメトリー出力を提供し、異なる実験条件下での細胞組成の比較を可能にします。
- 分析：細胞集団の頻度の統計的な比較を可能にし、データに基づいた標的の優先順位付けを促進します。
- トランスレーショナルリサーチ：保存された細胞間相互作用パターンを通じて、マウスの皮膚発がんモデルをヒトのがん生物学へと結びつけます。
- 企業内での再利用：さまざまな遺伝子改変がんマウスモデルにおける細胞集団ダイナミクスを分析するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 定義された細胞分離および表現型解析を通じて、腫瘍・ストロマ相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 組織処理ステップを標準化し、研究室間および実験バッチ間での再現性を向上させる。
- 戦略的価値： 複雑な組織におけるオンターゲットな生物学的影響の早期エビデンスを提供し、go/no-go判断の根拠とする。
- ポートフォリオへの影響： 免疫抑制性細胞集団への影響に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- マウス遺伝学、タモキシフェン誘導、および酵素的な組織解離に関する専門知識が必要である。
- フローサイトメトリー装置および細胞表面マーカー用に検証済み抗体パネルへのアクセスに依存する。
- 細胞回収量のばらつきを最小限に抑えるため、生検採取および処理時間の標準化が必要である。
- 表皮単離法を他の組織型や疾患モデルに適用する場合、適応に関する検討が必要となる。
- 遺伝的に適切なマウスを十分な数確保するために時間を要し、実験期間が延長される可能性がある。
バイオファーマ よくあるご質問（FAQ）
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Generating K14-creER+ R26-SmoM2YFP+ Mice and Inducing SmoM2 Expression in Skin Keratinocytes
2:35
Skin Specimen Preparation and Epidermis Isolation
3:11
Single Cell Generation
3:54
Cell Labeling and Flow Cytometric Analysis
5:08
Results: Induction of SmoM2 Expression and Skin Keratinocytes
6:31
Conclusion
![ジメチルベンズを用いた化学的誘発性皮膚発癌モデル[a]アントラセンと12-O-テトラデカノイル・ホルボル-13-酢酸(DMBA-TPA)](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F60445.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A21.159Z&w=384&q=75)
