げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。

ECOGやその他のツールを使用して、脳の活動が知覚や認知などの機能をどのように生み出すかを研究し、局所的なニューロン活動をより広い規模で皮質信号と結びつける方法。

二光子イメージングにおける細胞外スパイク記録は、個体群活動の測定に使用されますが、ECOGは、ヒトと動物の基礎研究の両方で利用できる数少ない技術の1つです。

脳の活動は、多くの空間的および時間的スケールにまたがっています。それらを一度にすべてキャプチャする信号法はありませんが、ECOGは多くの重要な質問に対して十分な時間的および空間的分解能を持っています。

私たちのプロトコルは、ECOGを局所記録および光遺伝学と組み合わせることで重要なギャップを埋め、メソスケールの皮質表面信号からマイクロスケールの情報を効果的に提供します。

私たちの発見は、新皮質組織の基本原理を研究し、ヒトの特定の皮質機能のバイオマーカーを明らかにするためのマルチモーダル実験パラダイムの一部としての ECOG の使用を拡大します。

[講師]まず、麻酔をかけたマウスを手術用ベッドに置き、ピンセットを使用して頭蓋骨上の皮膚の先端を持ち上げます。次に、外科用ハサミを使用して、皮膚の直径約1センチメートルの部分を切除します。スクレーパーで、頭蓋骨の上部から結合組織と骨膜を取り除きます。生理食塩水を頭蓋骨に流します。次に、低速でセットされたサージカルドリルを使用して、記録領域と同側の半球の前頭部分にバリ穴を開けます。開頭術の輪郭を定義するために、周囲に浅い溝を開けます。頭蓋骨が極度に軽い圧力で窓全体が目に見えて小刻みに揺れるまで薄くなったら、薄くなった部分を取り除きます。生理食塩水を定期的に塗布し、止血スポンジを使用して脳を湿らせてください。次に、銀の基準線をバリ穴に約1ミリ挿入し、出血を起こさずに脳表面に接触させます。ヘッドバーを埋め込んだ後、動物を記録セットアップに入れます。次に、ゼロ挿入力クリップコネクタを使用して、マイクロ皮質電図グリッドをヘッドステージに取り付けます。マイクロマニピュレーターに固定されたメカニカルバーを使用して、ヘッドステージの電子基板を所定の位置に保持します。マイクロ皮質電図グリッドを水平に下げて、前後軸に沿って開頭術の上に平らに整列させます。グリッドが脳に触れずに脳に近づいたら、グリッドの基準線を埋め込まれた銀線の金ピンに取り付けます。次に、グリッドをさらに下げて脳に接触させます。グリッドを横方向に動かして湿った硬膜表面の上を滑り、中外側軸に沿って中央になるまで調整を続けます。開頭術の端の周りに吸引または外科用スポンジを使用して、余分な生理食塩水を取り除きます。準備が少し乾いたら、グリッドが硬膜にしっかりと付着し、滑らないことを確認します。グリッドのケーブルが脳の輪郭に合わせて曲がっている間、グリッドに横方向から内側への動きを適用して、最も外側の電極との接触を確保します。記録ソフトウェアを使用して電気生理学的活動を観察します。軽い麻酔下で、さまざまな脳信号パターンを監視します。グリッド線、基準線、およびアース線が正しく接続されていることを確認して、高い信号対雑音比を実現します。300〜6,000ヘルツのバンドパスフィルタリングを備えたTrodesソフトウェアを使用して、高周波範囲のノイズを監視し、数十マイクロボルト以内にとどまるようにします。拍手や指を鳴らすなどの騒音刺激を生成して感覚反応性を評価し、対応する皮質表面の電位を観察します。光遺伝学的光を低強度でオンにして光源を誘導し、ファイバーの位置決めを助け、関節アームを使用して光遺伝学的光をターゲット領域に向かって大まかに配置します。信号を記録する前に、マイクロマニピュレーターまたは微調整ネジを使用してファイバーの位置に焦点を合わせ、微調整します。グリッドをきれいにするには、脳が乾燥している場合は、注射器を使用して脳の表面に少量の生理食塩水を塗布し、グリッドを持ち上げる前に30秒から1分間放置します。顕微鏡下で作業し、マイクロマニピュレーターを使用して脳表面からグリッドをそっと持ち上げます。局所的な皮質電図検査反応は、単一のひげ刺激の約 10 ミリ秒後に観察され、ピークたわみ振幅は約 1 ミリボルトでした。最も強い電極反応は、対応するひげの刺激によって引き起こされましたが、より遠くのひげからは弱い、またはまったく反応が観察されませんでした。光遺伝学的阻害は、抑制性オプシンを発現する動物でのみひげ誘発皮質応答の抑制をもたらしました。光電アーティファクトは、大径ファイバーを使用した5秒間の光パルス刺激の開始時とオフセット時にのみ現れました。 1 ミリメートルの光ファイバーはマイクロ皮質電図スコアに大きな光アーティファクトを生成しましたが、200 マイクロメートルのファイバーはこのアーティファクトを大幅に最小限に抑えました。ラットのマイクロ皮質電図記録は、強い聴覚誘発反応を示し、刺激後約25〜30ミリ秒でピーク反応を示しました。誘発応答の周波数スペクトルでは、高ガンマ、超高ガンマ、および多単位活性ピークが観察され、高ガンマが支配的な成分でした。マイクロ皮質電図検査は、層流プローブの記録とともに記録されました。ポリトロードの記録では明確なスパイク波形が検出され、複数のチャネルにわたって明確な波形が示されました。表面マイクロエレクトロピルチコグラフィー電極からの周波数応答振幅プロットは、深さ全体にわたって層流ポリトロード電極からの周波数応答振幅プロットと密接に一致し、一貫した聴覚調整を示しています。高ガンマ信号から生成された高解像度のトノトピックマップにより、一次、後部、腹側領域を含む聴覚皮質野の機能的構成が明らかになりました。