ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

別の脳領域からの光感受性軸索に接続された標的ニューロン領域を含むラットの脳スライスから始めます。

スライスを水没記録チャンバーに入れ、スライスアンカーで固定します。

顕微鏡下で目的の層を見つけ、標的錐体ニューロンを特定します。

顕微鏡の対物レンズを上げて、スライス面でメニスカスを作成します。

細胞内記録溶液で満たされたガラス製マイクロピペットをこのメニスカスに下げます。

識別された錐体細胞をピペットチップで接触させ、メンブレンにくぼみを作成します。

吸引を加えてシールを形成します。

膜が破裂するまで吸引を増やし、全細胞構成を確立します。

取り付けられた光源を使用して、スライスに光パルスを印加します。

これらの光パルスは、光に敏感な軸索の活動電位を引き起こし、シナプス間隙で神経伝達物質を放出します。

これらの放出に対する錐体ニューロンの反応を記録して、シナプス効率を分析します。

標的細胞を同定するには、スライスを記録チャンバーに入れ、スライスアンカーを使用して固定します。低倍率で、赤外線照明を使用して、LEC レイヤー 5 に移動します。次に、高倍率の水浸対物レンズに変更し、錐体ニューロンを同定します。

モニター上のセルの位置をテープでマークします。次に、全細胞パッチクランプを形成するために、ホウケイ酸ガラスマイクロピペットを製造し、細胞内記録溶液で満たします。充填したマイクロピペットを電極ホルダーに入れ、電極ホルダー側のポートに接続されたマウスピースに強く息を吹き込んで陽圧を加えます。

メニスカスが形成されるように顕微鏡の対物レンズを持ち上げ、顕微鏡で見えるまで電極をメニスカスに挿入します。シールテストウィンドウを開き、ピペットの抵抗が3〜5メガオームであるかどうかを判断します。次に、同定された細胞をピペットチップで接触させ、細胞膜にくぼみを作ります。

次に、マウスピースを吸引して負圧を加え、ピペットの抵抗を増やします。細胞膜が破裂するまで徐々に負圧を加え続け、細胞全体の静電容量過渡現象が生じます。電流クランプ構成に入るには、フィルターキューブと適切な光学系を備えた顕微鏡の光路に向けられた取り付けられたLEDを使用し、40倍対物レンズを介してスライスに光パルスを印加します。シナプス前放出特性を調べるために、5ヘルツ、10ヘルツ、および20ヘルツで複数の光パルスの列を供給します。